阅读说明：本技术 一种基于结核分枝杆菌pfge法分型中的dna提取方法 (DNA extraction method based on mycobacterium tuberculosis PFGE method typing ) 是由 吴利先 王国富 聂恒 *** 郝贤斌 李萍 李丛哲 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于结核分枝杆菌PFGE法分型中的DNA提取方法,包括将培养的结核分枝杆菌在磨菌管中制成菌悬液,菌悬液进行灭活、离心、沸水加热处理后,再加入溶菌酶,置于plug模具中,凝固成胶栓备用；对胶栓进行多次细胞溶解及水浴震荡后,获得结核分枝杆菌DNA,采用本方法能够方便去除M.tb细胞壁,获得M.tb的DNA；并且能够降低成本,推广性、实用性较强。(The invention discloses a DNA extraction method based on mycobacterium tuberculosis PFGE method typing, which comprises the steps of preparing a bacterial suspension from cultured mycobacterium tuberculosis in a bacterium grinding tube, inactivating the bacterial suspension, centrifuging, heating with boiling water, adding lysozyme, placing in a plug mould, and solidifying into a plug for later use; the cell lysis and water bath oscillation are carried out on the glue suppository for many times to obtain the DNA of the mycobacterium tuberculosis, and the method can be adopted to conveniently remove the cell wall of M.tb and obtain the DNA of the M.tb; and can reduce cost, and popularization nature, practicality are stronger.)

一种基于结核分枝杆菌PFGE法分型中的DNA提取方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，特别涉及一种基于结核分枝杆菌PFGE法分型中的DNA提取方法。

背景技术

结核病(Tuberculosis)是引起全世界范围内成人死亡的一个主要传染性疾病。随着分子微生物学的发展近年来许多新鉴别微生物的方法得以建立与应用，但在感染性疾病的分子流行病学研究中脉冲场凝胶电泳技术(pulse field gel electrophoresis，PFGE)一直是一种重要的鉴别方法。PFGE在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)基因分型当中的应用有助于结核病的暴发流行调查以及区分新发感染和陈旧病变的激发感染。在之前的研究人员研究发现PFGE在肺结核患者的M.tb临床分离株基因分型中其分辨力与M.tb的基因分型金标准***序列6110限制性片段长度多态性分析(IS6110-RFLP)的分辨力相同。但在结核分枝杆菌PFGE分型研究过程中由于M.tb自身细胞结构的特殊性导致其细胞壁去除困难，所以PFGE在M.tb基因分型中的应用在研究者中间存在争论，这也是在近年的M.tb基因分型研究报道中鲜有PFGE法分型的相关报道的主要原因。针对以上困难后来的研究者不断的改良实验技术，试图找到一种能解决M.tb细胞壁难去除的方法。如有的研究者在M.tb培养的对数期时在培养基中加入抗生素如氨苄青霉素和环丝氨酸；有的研究者试图应用溶细胞酶和化学溶菌的洗脱剂来去除M.tb的细胞壁。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于结核分枝杆菌PFGE法分型中的DNA提取方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：设计一种基于结核分枝杆菌PFGE法分型中的DNA提取方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取培养的结核分枝杆菌在磨菌管中制成菌悬液，菌悬液于65-90℃中灭活30min；

(2)取1ml菌悬液至EP管中，置于离心机中以12000/rpm离心5min，去上清液，沉淀重悬于250-500μL TEN buffer中；

(3)对步骤(2)的菌悬液置于离心机中以离心4500/rpm离心10min，去上清液，沉淀重悬于100-200μL EC buffer，然后在沸水中加热10-20min；

(4)待步骤(3)的溶液冷却后加入溶菌酶，使其终浓度为25mg/ml，再加入2％低熔点琼脂糖混合均匀，混合物于56℃水浴备用；

(5)取80μL混合物置于plug模具中，4℃凝固成胶栓备用；

(6)将含有M.tb基因组DNA的胶栓置于离心管中，再加入10ml细胞溶解bufferⅠ，37℃水浴震荡24h；

(7)去除细胞溶解bufferⅠ后，加入9800μL细胞溶解bufferⅡ，再加入200μL蛋白酶K溶液，50℃水浴震荡24h；

(8)去除细胞溶解bufferⅡ后，加入10ml TE buffer摇床洗3次，每次30min，第3次洗涤后将胶栓移至无菌试管中，获得结核分枝杆菌DNA。

优选的，所述步骤(1)中菌悬液的浓度≥10¹⁰cfu/ml，灭活温度为85℃。

优选的，所述步骤(2)中TEN buffer为300μL。

优选的，所述步骤(3)中EC buffer为150μL。

优选的，所述步骤(3)中沸水中加热时间为15min。

优选的，所述步骤(6)中加入与混合溶液等体积的低熔点琼脂糖。

优选的，所述步骤(7)中蛋白酶K为20mg/ml。

优选的，所述DNA提取方法应用于结核分枝杆菌PFGE法分型。

相对于现有技术，本发明的有益效果；

1、本方法通过煮沸处理，去除了大部分细胞壁，再加入溶菌酶去除剩余的细胞壁，从而克服了PFGE法分型中M.tb细胞壁去除困难的难题；

2、本方法减少了溶菌酶的用量，减少实验成本；

3、本方法中蛋白酶K的使用浓度仅为0.4mg/ml，而之前的蛋白酶K浓度大多在1mg/ml左右，再次降低了成本；

4、本方法提取的DNA经过DraⅠ酶切后，电泳显示基因片段清晰，分型效果明显提高，有助于结核病的研究；

附图说明

图1为结核分枝杆菌实验组1临床分离株DraⅠ酶切PFGE指纹图谱；

图2为结核分枝杆菌实验组2临床分离株DraⅠ酶切PFGE指纹图谱；

图3为MtbPFGE法分型的聚类分析图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围不受具体的实施例所限制，以权利要求书为准。另外，以不违背本发明技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

一种基于结核分枝杆菌PFGE法分型中的DNA提取方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取培养的结核分枝杆菌在磨菌管中制成菌悬液，菌悬液于65-90℃中灭活30min；

(2)取1ml菌悬液至EP管中，置于离心机中以12000/rpm离心5min，去上清液，沉淀重悬于250-500μL TEN buffer中；

(3)对步骤(2)的菌悬液置于离心机中以离心4500/rpm离心10min，去上清液，沉淀重悬于100-200μL EC buffer，然后在沸水中加热10-20min；

(4)待步骤(3)的溶液冷却后加入溶菌酶，使其终浓度为25mg/ml，再加入2％低熔点琼脂糖混合均匀，混合物于56℃水浴备用；

(5)取80μL混合物置于plug模具中，4℃凝固成胶栓备用；

(6)将含有M.tb基因组DNA的胶栓置于离心管中，再加入10ml细胞溶解bufferⅠ，37℃水浴震荡24h；

(7)去除细胞溶解bufferⅠ后，加入9800μL细胞溶解bufferⅡ，再加入200μL蛋白酶K溶液，50℃水浴震荡24h；

(8)去除细胞溶解bufferⅡ后，加入10ml TE buffer摇床洗3次，每次30min，第3次洗涤后将胶栓移至无菌试管中，获得结核分枝杆菌DNA。

优选的，所述步骤(1)中菌悬液的浓度≥10¹⁰cfu/ml，灭活温度为85℃。

优选的，所述步骤(2)中TEN buffer为300μL。

优选的，所述步骤(3)中EC buffer为150μL。

优选的，所述步骤(3)中沸水中加热时间为15min。

优选的，所述步骤(6)中加入与混合溶液等体积的低熔点琼脂糖。

优选的，所述步骤(7)中蛋白酶K为20mg/ml。

优选的，所述DNA提取方法应用于结核分枝杆菌PFGE法分型。

实施例1

1、实验对象

取27位临床肺结核病人的口痰标本；

2、分组

将27份口痰标本分为实验组1、实验组2；

3、标本处理

取肺结核病人的口痰标本进行酸处理20min，用碱中和；

4、培养

采用分区划线法接种于L-J(罗氏)培养基，37℃培养；

5、纯化

每天观察，若有菌落生长则进行：A.观察菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色等；B.抗酸染色法和鉴别培养基鉴定；C.以上方法难以鉴定的用分枝杆菌常规生化反应，必要时使用法国梅里埃公司的BacT/ALERT 3D 360全自动培养仪及配套的BacT/ALERT MP结核分枝杆菌培养瓶进行培养和鉴定；D.鉴定正确后转种L-J斜面培养基得到纯种；

6、结核分枝杆菌DNA提取

(1)分别取实验组1、2培养的结核分枝杆菌在磨菌管中制成菌悬液，菌悬液于65-90℃中灭活30min；

(2)取1ml菌悬液至EP管中，置于离心机中以12000/rpm离心5min，去上清液，沉淀重悬于250-500μL TEN buffer中；

(3)对步骤(2)的菌悬液置于离心机中以离心4500/rpm离心10min，去上清液，沉淀重悬于100-200μL EC buffer，然后在沸水中加热10-20min；

(4)待步骤(3)的溶液冷却后加入溶菌酶，使其终浓度为25mg/ml，再加入2％低熔点琼脂糖混合均匀，混合物于56℃水浴备用；

(5)取80μL混合物置于plug模具中，4℃凝固成胶栓备用；

(6)将含有M.tb基因组DNA的胶栓置于离心管中，再加入10ml细胞溶解bufferⅠ(0.5mM EDTA，10％十二烷基肌氨酸钠)，37℃水浴震荡24h；

(7)去除细胞溶解bufferⅠ后，加入9800μL细胞溶解bufferⅡ(0.5mM EDTA，1％十二烷基肌氨酸钠)，再加入200μL蛋白酶K溶液，50℃水浴震荡24h；

(8)去除细胞溶解bufferⅡ后，加入10ml TE buffer摇床洗3次，每次30min，第3次洗涤后将胶栓移至无菌试管中，获得结核分枝杆菌DNA。

7、DNA的限制性消化

将两组获得结核分枝杆菌DNA加入含有30U DraⅠ的消化液，30℃中预消化30min后移至37摄氏度中消化16h；

8、电泳

在0.5X BE制成的1％琼脂糖凝胶中电泳，电场设置(C倾倒细胞溶解bufferⅡ，加入10ml TE buffer(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)摇床洗3次，每次30min，第3次洗涤后将胶栓移至无菌10ml试管中HEF DRⅢ：6V/cm，120°转角，14℃；前16h脉冲设置1s～15s，后8h脉冲设置60s～70s)；

9、染色

将电泳结束后的胶块移至0.5mg/ml EB染液中染色20min，水清洗20min

10、凝胶成像

11、聚类分析

将PFGE法获得的指纹用BioNumerics(6.6)软件UPGMA法进行聚类分析；

12、结果

12.1通过脉冲场凝胶电泳后，如图1、2所示凝胶成像显示条带清晰，有16-18条DNA片段，从而获得了结核分枝杆菌DNA指纹图谱；

12.2用Bionumerics6.6进行处理和聚类分析(UPGMA)生成基因发育树，如图3所示，共分为了21个基因型，5个基因群，其中主要流行的基因群是A群并且H37Rv减毒株也在A群；按≥80％计算成簇性27株M.tb全部成簇，共5簇，达到了较为理想的分型效果。