具体实施方式

本发明提供了一种植物中多糖的提取方法，包括以下步骤：

将植物原料进行酶解，得到酶解液；

将所述酶解液依次和无机盐水溶液和有机溶剂混合，所得混合液进行两相盐析萃取，得到醇溶性多糖和水溶性多糖；

所述无机盐水溶液中的无机盐包括硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和氯盐中的一种或多种；

所述有机溶剂包括乙醇、异丙三醇、丙酮、乙腈和叔丁醇中的一种或几种。

在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。

本发明将植物原料进行酶解，得到酶解液。

在本发明中，所述植物原料的粒径优选为40～200目，进一步优选为100～160目。在本发明中，所述植物材料优选包括甘草、甜叶菊和万寿菊中的一种或多种。在本发明中，所述植物原料优选通过包括以下步骤的方法制备得到：将所述植物原材料依次进行自然阴干和粉碎，得到植物原料。在本发明中，所述植物原材料的部位优选为根、茎、叶、花或者相应的药渣。本发明对所述粉碎的操作不做具体限定，只要能够使植物原料的粒径为40～200目即可。

在本发明中，所述酶解的酶优选包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶和淀粉酶中的一种或多种，进一步优选为纤维素酶和β-葡聚糖酶的混合酶，所述纤维素酶和β-葡聚糖酶的混合酶中纤维素酶和β-葡聚糖酶的质量比优选为2：1。本发明中，所述纤维素酶的酶活力优选为500U/g，所述β-葡聚糖酶的酶活力优选为250U/g。本发明中，所述酶的质量优选为植物原料质量为0.6～1.8％，进一步优选为1.5％。

在本发明中，所述酶解的酶优选以酶溶液的形式使用；所述酶溶液中的溶剂优选包括缓冲液；所述缓冲液优选为柠檬酸-磷酸氢二钠；所述缓冲液的pH值优选为3.5～6.5，进一步优选为4.0。本发明中，所述缓冲液的作用为保证酶的最佳活性。

本发明中，所述酶解的温度优选为40～60℃；所述酶解的时间优选为30～150min，最优选为120min。在本发明实施例中，所述酶解优选在水浴锅中进行。

得到酶解液后，本发明将所述酶解液依次和无机盐水溶液和有机溶剂混合，所得混合液进行两相盐析萃取，得到醇溶性多糖和水溶性多糖。

本发明中，所述混合液与植物原料的液料比优选为(35～55)mL：1g。

所述两相盐析萃取的试剂为无机盐水溶液和有机溶剂的混合物；所述无机盐水溶液中的无机盐优选包括硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和氯盐中的一种或几种，进一步优选为硫酸盐、磷酸盐。本发明中，所述硫酸盐优选为硫酸铵。本发明中，所述磷酸盐优选为磷酸氢二钾和/或磷酸氢二钠。本发明中，所述柠檬酸盐优选为柠檬酸铵和/或柠檬酸钠；本发明中，所述氯盐优选为氯化钠。本发明中，所述无机盐在混合液中的质量百分含量优选为20～24％。

本发明中，所述有机溶剂优选包括无水乙醇、异丙三醇、丙酮、乙腈、叔丁醇中的一种或几种，进一步优选为无水乙醇。本发明中，所述有机溶剂在混合液中的质量百分含量优选为19～23％。

本发明中，所述酶解液和无机盐水溶液混合的时间优选为8～10min，与有机溶剂混合的时间优选为8～10min。本发明对所述混合的具体方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的操作将物料混匀即可。

本发明所述两相盐析萃取的方式优选为依次静置和离心，得到上相有机溶剂提取液和下相无机盐水提取液。

本发明中，所述静置时间优选为60～70min，进一步优选为60min；所述离心的转速优选为1000～8000rmp，进一步优选为3000～8000rmp；时间优选为5～10min。本发明中，所述两相盐析萃取的温度优选为25～40℃，进一步优选为25～35℃。本发明中，所述两相盐析萃取的时间为30～150min。

两相盐析萃取后，本发明优选还包括对所述上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液分别进行后处理。

本发明中，所述后处理的步骤优选包括将所述上相有机溶剂提取液和下相无机盐水提取液分别依次进行透析、脱蛋白、离心，得到上清液；然后，将所述上清液进行脱色，分别得到有机相多糖溶液和水相多糖溶液；将所得有机相多糖溶液和水相多糖溶液依次进行减压浓缩、醇沉和真空冷冻干燥，得到有机相粗多糖和水相粗多糖。然后，将所得有机相粗多糖和水相粗多糖分别进行纯化，得到醇溶性多糖和水溶性多糖。

本发明中，所述透析优选为截留分子量为3500Da的透析袋，透析时间优选为48～72h，进一步优选为72h。

本发明中，所述脱蛋白的试剂优选为Sevag溶液，本发明中，所述脱蛋白的离心转速优选为4000～6000r/min，离心时间优选为5～10min。

本发明中，所述脱色优选在AB-8大孔树脂柱中进行，本发明中，所述上清液和AB-8大孔树脂的用量比优选为25～50mL：2～5g。本发明中，所述脱色的温度优选为30～50℃。本发明中，所述脱色优选在摇床进行，所述摇床转速为100～140rpm。

本发明中，所述减压浓缩的温度优选为40～60℃，进一步优选为50℃。本发明优选将透析后的提取液减压浓缩至提取液体积的1/3～1/4，进一步优选为1/4。

本发明中，所述醇沉时，醇沉体系中无水乙醇的体积百分含量为80％。本发明中，所述醇沉的温度优选为4℃，沉淀时间优选为12～24h。

本发明中，所述真空冷冻干燥的温度优选为-50～-65℃，进一步优选为-55℃。

本发明中，所述纯化包括优选将有机相粗多糖和水相粗多糖经DEAE-52纤维素色谱柱分离，得到多糖初产物，所得多糖初产物经Sephadex G-100凝胶色谱柱分离，然后采用苯酚-硫酸法隔管检测洗脱液在紫外490nm处光密度值，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线中呈单一峰的多糖组分，所得多糖组分依次进行减压浓缩，透析、冷冻干燥，分别得到醇溶性多糖和水溶性多糖。

本发明中，所述Sephadex G-100凝胶色谱柱分离时的洗脱液为去离子水。

图1为本发明提取方法的提取流程。

从图1可知，本发明的提取流程为先将原料进行粉碎，然后进行酶解，得到酶解液；然后将所述酶解液进行两相盐析萃取，得到醇溶性多糖和水溶性多糖。

下面结合实施例对本发明提供的植物中多糖的提取方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将阴干的甘草药渣粉碎，过120目筛，得到甘草药渣粉末。

将上述甘草药渣粉末0.20g，加入甘草药渣粉末质量1.50％的纤维素酶和pH值为4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.50g，混合均匀后，在40℃的水浴锅中酶解90min，得到酶解液；

将2.30g硫酸铵和3.20g的水与上述所得的酶解液混合10min，然后，加入2.0g的无水乙醇混合10min，形成两相盐析体系，所得两相盐析体系在室温条件下静置60min后离心5min，分别得到上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液。

将所述上相有机溶剂提取液和下相无机盐水提取液分别依次进行透析、加入Sevag溶液进行脱蛋白、离心，得到上清液；然后，将所述上清液在AB-8大孔树脂柱中进行脱色，分别得到有机相多糖溶液和水相多糖溶液。然后，将上述所得有机相多糖溶液和水相多糖溶液经DEAE-52纤维素柱色谱进行分离，得到多糖初产物，然后将获得的多糖初产物溶于蒸馏水，离心，得到上清液，将所得上清液再通过Sephadex G-100凝胶柱色谱，用去离子水洗脱，得到洗脱液。然后，采用苯酚-硫酸法隔管检测洗脱液在紫外490nm处光密度值，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线中呈单一峰的多糖组分，减压浓缩后透析72h，冷冻干燥，得醇溶性多糖和水溶性多糖。

经分析计算，醇溶性多糖得率为0.79％，水溶性的多糖得率为2.12％。

本发明中，采用苯酚-硫酸比色法测定多糖得率。

取1mL稀释一定倍数的提取液于10mL试管中，加入1mL5％苯酚溶液和5mL 98％硫酸，静置10min，混合均匀，冰浴1min，在30℃水浴20min后在490nm处测定吸光度。根据标准曲线，分别计算上相有机溶剂相、下相无机盐水相提取液中多糖的浓度，代入公式(1)，计算醇溶性多糖和水溶性多糖的提取率。

式中：m为甘草药渣的质量，g；

C为上相有机溶剂相或下相无机盐水相提取液多糖的浓度，mg/mL；

V为上相有机溶剂相或下相无机盐水相提取液体积，mL；

D为稀释倍数。

实施例2

与实施例1的区别仅仅在于将纤维素酶替换为β-葡聚糖酶，缓冲液的pH值由4.50变为6.00。

经分析计算，本实施例醇溶性多糖得率为0.85％，水溶性多糖得率为1.90％。

实施例3

与实施例1的区别仅仅在于将纤维素酶替换为纤维素酶和β-葡聚糖酶的复合酶，其中纤维素酶与β-葡聚糖酶的质量比为2：1。缓冲液的pH值由4.50变为4.00。

经分析计算，本实施例醇溶性多糖得率为0.86％，水溶性的多糖得率为2.39％。

由实施例1～3可以看出，当分别采用纤维素酶、β-葡聚糖酶以及纤维素酶和β-葡聚糖酶的复合酶进行酶解时，采用复合酶最终得到的多糖得率最高。

实施例4

为了测试不同酶对多糖提取的效果，实施例4中共进行了5个试验；

试验4.1

与实施例1的区别仅仅在于将柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH值由4.5调整为pH值为4.00；酶解的温度由40℃调整为50℃。

试验4.2与试验4.1的区别仅仅在于将纤维素酶替换为β-葡聚糖酶。

试验4.3与试验4.1的区别仅仅在于将纤维素酶替换为纤维素酶与β-葡聚糖酶的质量比为1:1的复合酶。

试验4.4与试验4.1的区别仅仅在于将纤维素酶替换为纤维素酶与β-葡聚糖酶的质量比为1:2的复合酶。

试验4.5与试验4.1的区别仅仅在于将纤维素酶替换为纤维素酶与β-葡聚糖酶的质量比为2:1的复合酶。

表1为实施例4中5个试验的实验条件和分析检测结果。

表1实施例4的各试验条件和检测结果

从表1可以看出：当采用纤维素酶与β-葡聚糖酶复合酶质量比例为2:1时醇溶性及水溶性多糖得率最高。

实施例5

为了测试不同酶量对多糖提取的效果，实施例5中共进行了5个试验；

试验5.1与实施例3的区别仅仅在于酶解的温度由40℃调整为50℃；酶量占甘草药渣粉末质量百分比为0.6％。

试验5.2与试验5.1的区别仅在于酶量占甘草药渣粉末质量百分比为0.9％。

试验5.3与试验5.1的区别仅在于酶量占甘草药渣粉末质量百分比为1.2％。

试验5.4与试验5.1的区别仅在于酶量占甘草药渣粉末质量百分比为1.5％。

试验5.5与试验5.1的区别仅在于酶量占甘草药渣粉末质量百分比为1.8％。

表2为实施例5中5个试验的实验条件和分析计算结果。

表2实施例5的各试验条件和检测结果

从表2可知，当复合酶的用量为1.50％时，多糖得率最高。

实施例6

为了测试不同酶解时间对多糖提取的效果，实施例6中共进行了5个试验。

试验6.1与实施例3的区别仅仅在于酶解的温度由40℃调整为50℃，酶解时间为30min。经分析计算，醇溶性多糖的得率为0.63％；水溶性多糖得率为2.0％。

试验6.2与试验6.1的区别仅仅在于酶解时间为60min。

试验6.3与试验6.1的区别仅仅在于酶解时间为90min。

试验6.4与试验6.1的区别仅仅在于酶解时间为120min。

试验6.5与试验6.1的区别仅仅在于酶解时间为150min。

表3为实施例6中5个试验的实验条件和分析计算结果。

表3实施例6的各试验条件和分析计算结果

从表3可知，当酶解时间为120min时，多糖得率最高。

实施例7

为了测试不同酶解温度对多糖提取的效果，实施例7中共进行了5个试验。

试验7.1与实施例6中试验6.4的区别仅在于将酶解温度设置为40℃。

试验7.2与试验7.1的区别仅在于将酶解温度设置为45℃。

试验7.3与试验7.1的区别仅在于将酶解温度设置为50℃。

试验7.4与试验7.1的区别仅在于将酶解温度设置为55℃。

试验7.5与试验7.1的区别仅在于将酶解温度设置为60℃。表4为实施例7中5个试验的实验条件和分析计算结果。

表4实施例7的各试验条件和分析计算结果

经表4可知，当酶解温度为50℃时，多糖得率最高。

实施例8

为了测试不同缓冲液pH值对多糖提取的效果，实施例8中共进行了5个试验。

试验8.1与实施例7试验7.1的区别仅在于将缓冲液的pH值设置为3.50；

试验8.2与试验8.1的区别仅在于将缓冲液的pH值设置为4.00；

试验8.3与试验8.1的区别仅在于将缓冲液的pH值设置为4.50；

试验8.4与试验8.1的区别仅在于将缓冲液的pH值设置为5.00；

试验8.5与试验8.1的区别仅在于将缓冲液的pH值设置为5.50。表5为实施例8中5个试验的实验条件和分析计算结果。

表5实施例8的各试验条件和分析计算结果

经表5可知，当缓冲液的pH值为4.00时，得到的醇溶性多糖和水溶性多糖的得率最高。

实施例9

为了检测硫酸铵的质量对多糖提取效果的影响，实施例9进行了2个试验。

试验9.1与实施例4中4.5的区别仅仅在于硫酸铵的质量为2.00g，经分析计算，醇溶性多糖得率为0.61％，水溶性多糖得率为2.60％。

试验9.2与实施例4中4.5的区别仅仅在于硫酸铵的质量为2.40g，经分析计算，醇溶性多糖得率为0.77％，水溶性多糖得率为1.49％。

经实施例9可知，当无机盐在混合液中的质量百分含量为20～24％时，本方法对醇溶性多糖和水溶性多糖具有良好的提取效果。

实施例10

为了检测无水乙醇的质量对多糖提取效果的影响，实施例10进行了2个试验。

试验10.1与实施例4中4.5的区别仅在于无水乙醇的质量为1.90g，经分析计算，醇溶性多糖得率为0.74％，水溶性多糖得率为2.14％。

试验10.2与实施例4中4.5的区别仅在于无水乙醇的质量为2.30g，经分析计算，醇溶性多糖得率为0.70％，水溶性多糖得率为1.80％。

经实施例10可知，当有机溶剂在混合液中的质量百分含量为19～23％时，本方法对醇溶性多糖和水溶性多糖具有良好的提取效果。

实施例11

为了检测原料的质量对多糖提取效果的影响，实施例11进行了2个试验。

试验11.1与实施例4中4.5的区别仅在于甘草药渣粉末的质量为0.18g，经分析计算，醇溶性多糖得率为0.95％，水溶性多糖得率为2.09％。

试验11.2与实施例4中4.5的区别仅在于甘草药渣粉末的质量为0.29g，经分析计算，醇溶性多糖得率为1.00％，水溶性多糖得率为1.84％。

经实施例11可知，当甘草药渣质量为0.18～0.29g时，本方法对醇溶性多糖和水溶性多糖具有良好的提取效果。

实施例12

将甘草根切成小段，避光通风阴干，粉碎，过120目筛，得到甘草粉末；

将上述甘草粉末0.22g，加入占甘草粉末质量百分比1.40％的纤维素酶和pH 5.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.50g，混合均匀，在40℃水浴锅中酶解60min，得到酶解液；

将2.40g硫酸铵和3.10g的水加入上述得到的酶解液中进行混合10min，然后，向其中加入2.00g的无水乙醇混合10min，形成两相盐析体系，所得两相盐析体系在室温条件下静置60min后离心5min，分别得到上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液。

后续上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液处理与实施例1上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液的后处理步骤相同，不在赘述。

经分析计算，本实施例醇溶性多糖得率为1.58％，水溶性多糖得率为4.24％。

实施例13

将甜叶菊叶子避光通风阴干，粉碎，过160目筛，得到甜叶菊粉末；

将上述甜叶菊粉末0.20g，加入占甜叶菊粉末质量百分比1.50％的纤维素酶和pH4.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.5g，混合均匀，在50℃水浴锅中酶解120min，得到酶解液；

将1.70g磷酸氢二钾和3.10g的水加入上述得到的酶解液中混合10min，然后向其中加入2.70g的无水乙醇混合10min，形成两相盐析体系，所得两相盐析体系在室温条件下静置60min后离心5min，分别得到上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液。

后续上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液处理与实施例1上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液的后处理步骤相同，不在赘述。

经分析计算，本实施例醇溶性多糖得率为18.91％，水溶性多糖得率为4.61％。

实施例14

将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎，过120目筛，得到万寿菊花粉末；

将上述万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.50％的果胶酶和pH 4.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g，混合均匀，在45℃水浴锅中酶解90min，得到酶解液；

将1.80g硫酸铵和1.40g的水加入上述得到的酶解液中进行第一混合，混合时间为10min，然后，向其中加入2.80g的无水乙醇混合10min，形成两相盐析体系，所得两相盐析体系在室温条件下静置60min后离心5min，分别得到上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液。

后续上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液处理与实施例1上相有机溶剂提取液和下相无机盐提取液的后处理步骤相同，不在赘述。

经分析计算，本实施例醇溶性多糖得率为4.70％，水溶性多糖得率为11.62％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。