阅读说明：本技术 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 (Fermentation process for improving production level of recombinant collagen by adjusting addition mode of PTM1 ) 是由 许乔林 杜尔凤 闻帅 冯志平 刘宇乾 赵健烽 黄建民 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺。所述工艺先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中,发酵培养14～18小时后,开始补加甲醇进行诱导表达,同时向发酵培养基中流加PTM1,PTM1流加速度控制在30-300ml/h。本发明在发酵过程中,选取在甲醇诱导表达阶段将PTM1与甲醇分开添加至发酵培养基中,提高重组胶原蛋白的生物合成速率,并且采用连续流加的方式,能够进一步提高重组胶原蛋白的生物合成速率,同时重组胶原蛋白的表达量增加,发酵水平提高20％以上,节约生产成本,特别适用于重组胶原蛋白的工业化大规模生产。(The invention discloses a fermentation process for improving the production level of recombinant collagen by adjusting the addition mode of PTM 1. The process comprises the steps of firstly inoculating a pichia pastoris strain liquid into a sterilized fermentation culture medium, after fermentation culture is carried out for 14-18 hours, beginning to supplement methanol for induction expression, and simultaneously adding PTM1 into the fermentation culture medium in a flowing mode, wherein the adding speed of PTM1 is controlled to be 30-300 ml/h. In the fermentation process, PTM1 and methanol are separately added into a fermentation culture medium at a methanol induction expression stage, so that the biosynthesis rate of the recombinant collagen is improved, the biosynthesis rate of the recombinant collagen can be further improved by adopting a continuous fed-batch mode, the expression amount of the recombinant collagen is increased, the fermentation level is improved by more than 20%, the production cost is saved, and the method is particularly suitable for industrial large-scale production of the recombinant collagen.)

调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺。

背景技术

胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质，广泛分布于皮肤、软骨、血管等组织，参与细胞的迁移、分化和繁殖，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能起着重要的作用，在食品、饲料、美容、化妆品、医药等领域应用普遍。目前，胶原蛋白原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理如猪、牛等动物皮肤、骨骼等组织后分离纯化获得。但是，上述方法得到的胶原蛋白成分复杂，水溶性差，并且由于来自动物组织，存在病毒隐患，限制了胶原蛋白在医药方面的应用。

随着DNA重组技术的迅速发展，各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。与传统工艺相比，胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点，但是也存在着发酵周期较长，生产效率较低等问题。中国专利20181004890.8公开了一种毕赤酵母表达重组胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺，胶原蛋白产量超过20g/L，产量提高5％以上，重组胶原蛋白的回收率达到75％以上。重组胶原蛋白表达量虽有所提高，但提升幅度不大。因此，需要进一步地提高蛋白表达量，进而提高发酵水平，有利于胶原蛋白的工业化大规模生产，为产业化生产带来实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，通过在发酵过程中将甲醇和PTM1分开添加，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，提高重组胶原蛋白的表达量，进一步提升重组胶原蛋白的生产水平。

实现本发明目的的技术方案如下：

调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始流加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中流加PTM1溶液，其中PTM1流加速度为30～300ml/h。

优选地，所述的PTM1流加速度为100～200ml/h。

本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。

本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H₃PO₄6.6～26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.3～1.175g/L，K₂SO₄ 4.5～18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。

本发明所述的PTM1溶液采用现有配方，可以是：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO₄·H₂O 3.0g/L；NaMoO₄·2H2O 0.2g/L；H₃BO₃ 0.02g/L；CoCl₂ 0.5g/L；ZnCl₂20.0g/L；FeSO₄·7H₂O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H₂SO₄ 5.0mL/L。

本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.0～5.2，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。

与现有技术相比，本发明的显著效果如下：本发明在发酵过程中，通过在甲醇诱导表达阶段，添加PTM1溶液，提高了重组胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，提高表达量，发酵水平最高提升了20％，大大节约了生产成本，特别适用于重组胶原蛋白的工业化大规模生产。

具体实施方式

在本发明的具体实施例中，采用的菌株为表达重组胶原蛋白的毕赤酵母，为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC NO.5021，保藏日期为2011年6月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明所述的PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO₄·H₂O 3.0g/L；NaMoO₄·2H2O 0.2g/L；H₃BO₃0.02g/L；CoCl₂ 0.5g/L；ZnCl₂ 20.0g/L；FeSO₄·7H₂O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H₂SO₄5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。

下面结合实施例对本发明作进一步详述。

实施例1

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。

将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时开始流加PTM1，流加速度为30ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵114h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组胶原蛋白浓度为25.5g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.196g/L·h，与对比例1相比提高22.5％。

实施例2

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。

将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时开始流加PTM1，流加速度为100ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵114h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组胶原蛋白浓度为26.8g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.206g/L·h，与对比例1相比提高28.8％。

实施例3

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。

将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时开始流加PTM1，流加速度为200ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵114h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组胶原蛋白浓度为26.0g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.200g/L·h。与对比例1相比提高25.0％。

实施例4

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。

将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时开始流加PTM1，流加速度为300ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵114h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组胶原蛋白浓度为25.1g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.193g/L·h，与对比例1相比提高20.6％。

对比例1

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵114h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组胶原蛋白浓度为20.8g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.160g/L·h。

对比例2

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。

将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时开始流加PTM1，流加速度为400ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵114h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组胶原蛋白浓度为21.2g/L，发酵周期130小时，发酵生产水平为0.163g/L·h，与对比例1相比仅提高1.9％。