阅读说明：本技术 一种泰乐菌素混种发酵方法 (Mixed fermentation method of tylosin ) 是由 郭佳 王少云 刘晓明 石雷 李芳� 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种泰乐菌素混种发酵方法,该方法是在以弗式链霉菌为发酵菌种,在生产泰乐菌素的发酵过程中接入培养好的芽孢状态的双球菌继续发酵。本发明利用双球菌与弗式链霉菌混合发酵生产泰乐菌素,其中双球菌和弗式链霉菌在发酵体系中混合培养,共用其代谢酶系和代谢中间体,对泰乐菌素的合成有明显的促进作用,从而有效提高了发酵水平,改善了发酵液的组分含量,尤其是泰乐菌素A的含量。通过本发明的方法,可使泰乐菌素的发酵周期控制在160～170小时,发酵单位较原工艺提高10%以上,发酵液中泰乐菌素A效价提高10%以上,对发酵液过滤无影响。(The invention relates to a tylosin mixed culture fermentation method, which is characterized in that streptomyces fradiae is used as a fermentation strain, and a cultured spore-state diplococcus is inoculated in the fermentation process for producing tylosin for continuous fermentation. The method utilizes the mixed fermentation of the diplococcus and the streptomyces fradiae to produce the tylosin, wherein the diplococcus and the streptomyces fradiae are mixed and cultured in a fermentation system, and share a metabolic enzyme system and a metabolic intermediate thereof, so that the method has obvious promotion effect on the synthesis of the tylosin, thereby effectively improving the fermentation level and improving the component content of the fermentation liquor, particularly the content of the tylosin A. By the method, the fermentation period of the tylosin can be controlled within 160-170 hours, the fermentation unit is improved by more than 10% compared with the original process, the titer of the tylosin A in the fermentation liquor is improved by more than 10%, and the tylosin A has no influence on the filtration of the fermentation liquor.)

一种泰乐菌素混种发酵方法

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术，特别是涉及一种泰乐菌素混种发酵方法。

背景技术

泰乐菌素(Tylosin)，又名泰乐星，泰洛霉素，为大环内酯类抗生素，其抗菌谱广，对支原体抗菌最强，低毒广谱，可用于治疗由耐青霉素细菌引起的感染，主要抗G⁺，对大部分G^-、螺旋体、大病毒也有作用。泰乐菌素主要由泰乐菌素A、B、C、D四个组分组成。四组分中除泰乐菌素D组分基本无抗菌活性外，A、B、C均有抗菌活性，其中以A组分抗菌活性为最高。在目前生产的泰乐菌素中，A组分是泰乐菌素的主要组分。

现有技术中，泰乐菌素的发酵生产通常都是采用弗式链霉菌进行纯种发酵，例如专利CN111139197A 一种弗氏链霉菌及其在泰乐菌素发酵时的应用，通过种子培养、发酵过程控制等手段使菌体产生泰乐菌素，该方法泰乐菌素发酵单位低，发酵水平提高难度大，发酵工艺改变空间小。目前，提高发酵水平是发酵企业亟待解决的问题，进一步提高其工业发酵水平、节能降耗也是当前提高该产品的国际竞争力的迫切需求。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种有效改善泰乐菌素发酵中泰乐菌素A组分的含量，提高发酵水平的泰乐菌素混菌发酵方法。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种泰乐菌素混种发酵方法，其特征是：在以弗式链霉菌为发酵菌种生产泰乐菌素的发酵培养过程中，接入培养好的芽孢状态双球菌后继续发酵。

所述双球菌是在发酵培养90～100小时接入。

所述双球菌接种量为0.05～0.1%。

所述芽孢状态双球菌的制备方法为：将双球菌菌液接种到灭菌好的摇瓶培养基中，在摇床170～220转，温度29～33℃下培养10～14小时，镜检菌体成芽孢状即可；

所述摇瓶培养基组成为：葡萄糖2.0～3.0%，玉米浆：0.1～0.2%，酵母膏0.2～0.3%，碳酸钙0.15～0.3%，豆油适量。

上述发酵过程的控制以现有公开的泰乐菌素发酵生产工艺为基础进行工艺控制，如工业技术杂志发表的浅谈泰乐菌素生产工艺。

本发明利用双球菌与弗式链霉菌混合发酵生产泰乐菌素，其中双球菌和弗式链霉菌在发酵体系中混合培养，共用其代谢酶系和代谢中间体，对泰乐菌素的合成有明显的促进作用，从而有效提高了发酵水平，改善了发酵液的组分含量，尤其是泰乐菌素A的含量。通过本发明的方法，可使泰乐菌素的发酵周期控制在160-170小时，发酵单位较原工艺提高10%以上，发酵液中泰乐菌素A效价提高10%以上，对发酵液过滤无影响。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例双球菌培养基组成为：葡萄糖2.0-3.0%，玉米浆：0.1-0.2%，酵母膏0.2-0.3%，碳酸钙0.15-0.3%，豆油适量。

实施例1

1、双球菌菌液的制备

双球菌培养基：葡萄糖2.0%，玉米浆0.1%，酵母膏0.2%，碳酸钙0.15%，豆油适量。灭菌温度119～122℃，保温25分钟，降温待种。

将保存的双球菌菌液挑取一环接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床180转，温度30℃培养10小时，镜检菌体成芽孢状，放置4℃冰箱备用。

2、将双球菌菌液接入泰乐菌素发酵液混种培养

以弗式链霉菌ACCC40012为发酵菌种，按照常规发酵方法进行发酵：

一级种子培养基：花生饼粉6g/L，酵母浸粉4g/L，玉米浆5g/L，豆油12g/L，碳酸钙2g/L。

二级种子培养基：麸质粉12g/L，棉籽饼粉10g/L，豆饼粉10g/L，玉米浆8g/L，豆油15g/L，磷酸氢二铵 0.4g/L，碳酸钙 3g/L。

发酵培养基：豆饼粉0.6％，鱼粉0.5％，玉米粉 1.8％，盐酸甜菜0.5％，磷酸氢二铵 0.01％，氯化钾 0.08％，氯化钠 0.1％，氯化钴 0.0004％，硫酸镍 0.0004％，碳酸钙0.2％。

一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的弗氏链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的10％，一级种子培养至菌体浓度20%、pH值6～8、无其它杂菌污染时移种。

二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液移入二级种子罐进行培养，接种量10％，至菌体浓度30%、发酵周期34小时、无其它杂菌污染时移种。

发酵培养：二级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，控制培养温度31～34℃，通气量1：1.1～1.4v/v/min，搅拌发酵，发酵过程中根据pH补入硫酸铵，残油含量补入豆油，根据菌浓补入水，待发酵至100小时后接入培养好的芽孢状双球菌，接种量为0.05%，生长165小时放罐。

经检测，芽孢杆菌接入后对泰乐菌素发酵有明显促进作用，泰乐菌素发酵效价为13500 µg/ml，较对照提高10%以上，泰乐菌素A组分87%，提高4%以上。

实施例2

1、双球菌菌液的制备

双球菌培养基：葡萄糖2.5%，玉米浆1.5%，酵母膏0.25%，碳酸钙0.2%，豆油适量。灭菌温度119～122℃，保温20-25分钟，降温待种。

将保存的双球菌菌液挑取一环接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床180转，温度30℃培养10小时，镜检菌体成芽孢状，放置4℃冰箱备用。

2、将双球菌菌液接入泰乐菌素发酵液混种培养

发酵培养基：豆饼粉0.7％，鱼粉0.6％，玉米粉 2.0％，盐酸甜菜0.5％，磷酸氢二铵0.01％，氯化钾 0.08％，氯化钠 0.1％，氯化钴 0.0004％，硫酸镍 0.0004％，碳酸钙0.2％。

按实施例1工艺方法进行泰乐菌素发酵，生长90小时将培养好的双球菌菌悬液按接种量0.08%接入。发酵体系，生长165小时放罐，放罐效价13800 µg/ml，较对照提高13.5%，发酵液A组分达到88%，提高4%以上。

实施例3

1、双球菌菌液的制备：

双球菌培养基：葡萄糖3.0%，玉米浆0.2%，酵母膏0.3%，碳酸钙0.25%，豆油适量。灭菌温度119～122℃，保温25分钟，降温待种。

将保存的双球菌菌液挑取一环接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床180转，温度30℃培养10小时，镜检菌体成芽孢状，放置4℃冰箱备用。

2、将双球菌菌液接入泰乐菌素发酵液混种培养

发酵培养基：豆饼粉0.8％，鱼粉0.7％，玉米粉2.2％，盐酸甜菜0.5％，磷酸氢二铵0.01％，氯化钾 0.08％，氯化钠 0.1％，氯化钴 0.0004％，硫酸镍 0.0004％，碳酸钙0.2％。

按实施例1工艺方法进行泰乐菌素发酵，生长100 h将培养好的双球菌菌悬液按接种量0.08%接入。发酵体系，生长165小时放罐，放罐效价14100 µg/ml，较对照提高14.3%，发酵液A组分达到88%，提高4%以上。

对比实施例1

以弗式链霉菌ACCC40012为发酵菌种，按照常规发酵方法进行发酵：

一级种子培养基：花生饼粉6g/L，酵母浸粉4g/L，玉米浆5g/L，豆油12g/L，碳酸钙2g/L。

二级种子培养基：麸质粉12g/L，棉籽饼粉10g/L，豆饼粉10g/L，玉米浆8g/L，豆油15g/L，磷酸氢二铵 0.4g/L，碳酸钙 3g/L。

发酵培养基：豆饼粉0.6％，鱼粉0.5％，玉米粉 1.8％，盐酸甜菜0.5％，磷酸氢二铵 0.01％，氯化钾 0.08％，氯化钠 0.1％，氯化钴 0.000 4％，硫酸镍 0.000 4％，碳酸钙0.2％。

一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的弗氏链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的10％，一级种子培养至菌体浓度20%、pH值6～8、无其它杂菌污染时移种。

二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液移入二级种子罐进行培养，接种量10％，至菌体浓度30%、周期34小时、无其它杂菌污染时移种。

发酵培养：二级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，控制培养温度31～34℃，通气量1：1.1～1.4v/v/min，搅拌发酵，发酵过程中根据pH补入硫酸铵，残油含量补入豆油，根据菌浓补入水，生长165小时放罐。

经检测，放罐效价11800 µg/ml，发酵液中A组分为83%。

对比实施例2

发酵培养基：豆饼粉0.7％，鱼粉0.6％，玉米粉 2.0％，盐酸甜菜0.5％；磷酸氢二铵0.01％，氯化钾 0.08％，氯化钠 0.1％，氯化钴 0.0004％，硫酸镍 0.0004％，碳酸钙0.2％。

按对比实施例1工艺进行泰乐菌素发酵，弗氏链霉菌ACCC40012孢子经一级、二级种子培养，再级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度32～34℃，通气量1：1.1～1.4v/v/min，搅拌，发酵过程溶氧30%以上，根据pH补入硫铵、根据油残补入豆油，根据菌浓补入水，经165小时培养得含有泰乐菌素的发酵液，发酵过程为纯种发酵，放罐效价 12150 µg/ml，发酵液中A组分为84%。

对比实施例3

发酵培养基：豆饼粉0.8％，鱼粉0.7％，玉米粉2.2％，盐酸甜菜0.5％，磷酸氢二铵0.01％，氯化钾 0.08％，氯化钠 0.1％，氯化钴 0.0004％，硫酸镍 0.0004％，碳酸钙0.2％。

按对比实施例1工艺进行泰乐菌素发酵，弗氏链霉菌ACCC40012孢子经一级、二级种子培养，再级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度32～34℃，通气量1：1.1～1.4v/v/min，搅拌，发酵过程溶氧30%以上，根据pH补入硫铵、根据油残补入豆油，根据菌浓补入水，经165小时培养得含有泰乐菌素的发酵液，发酵过程为纯种发酵，放罐效价12340 µg/ml，发酵液中A组分为84%。