一种抗凝血共聚物的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种抗凝血共聚物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of anticoagulant copolymer ) 是由 欧阳晨曦 徐天成 焦培 龙行 吴瑶 刘思诗 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于医疗技术领域,公开了一种抗凝血共聚物的制备方法及其应用,该共聚物首先由单体A、B、C三种单体按比例加聚形成聚合物,其中,单体A含有双键和磺酸基团,单体B为含有双键和吡咯环的亲水性物质,单体C为含有双键的疏水性物质,然后通过将聚合物侧链的吡咯环打开,通过酯化反应接枝上维生素和薯蓣皂苷元即可制得。该共聚物能对聚氨酯材料表面进行改性,改性后的聚氨酯表面同时具有良好的抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、抗血栓性能,有良好的应用前景。(The invention belongs to the technical field of medical treatment, and discloses a preparation method and application of an anticoagulant copolymer, wherein the copolymer is formed by the polyaddition of A, B, C monomers according to a proportion, wherein the A monomer contains double bonds and sulfonic acid groups, the B monomer is a hydrophilic substance containing double bonds and a pyrrole ring, the C monomer is a hydrophobic substance containing double bonds, and then the anticoagulant copolymer is prepared by opening the pyrrole ring of the side chain of the polymer and grafting vitamins and diosgenin through esterification reaction. The copolymer can modify the surface of a polyurethane material, and the modified polyurethane surface has good anticoagulation, anti-infection, anti-protein adsorption and anti-thrombus performances, and has good application prospects.)
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种可用于聚氨酯材料表面改性的抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、抗血栓共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
聚碳酸酯型聚氨酯材料因其生物体内稳定性好、生物相容性佳和物理机械性能优而被广泛应用于生物医学领域。然而，作为植/介入医疗器械材料，聚氨酯与组织或血液接触的过程中，由于其表面固有的生物惰性以及缺乏有效的抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、和抗血栓性能，容易导致材料表面产生微生物污染而出现凝血、细菌感染、炎症反应等严重问题。因此，在聚氨酯材料表面构建高效的抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、和抗血栓涂层一直是聚氨酯医用材料改性过程中函待解决的一个关键性问题。
表面改性是一种有效改善或提高材料表面性能的途径，它可以在保持材料原有的基本物理化学性能的同时赋予材料表面新的性能与功能。在过去的二十多年中，通过活化聚氨酯表面后引入特定官能团改善材料表面抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、和抗血栓性能的研究逐渐成为热点。以往研究往往针对抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、和抗血栓性能中的一种对聚氨酯进行改性。例如将肝素引入聚氨酯表面，获得肝素涂层的聚氨酯，以期提升材料的抗凝血性能。而实际应用中聚氨酯材料与人体的血液或组织接触时往往需要面对凝血、感染、蛋白吸附、血栓形成等各种问题，需要研发新型涂层材料以同时解决以上问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种抗凝血共聚物及其制备方法，该共聚物接枝到聚氨酯表面后，能同时并有效改善聚氨酯材料的抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附以及抗血栓性能。
为了实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：
一种抗凝血共聚物的制备方法，包括步骤：
S1、将单体A、B、C溶于有机溶剂中，在氮气保护下，搅拌均匀，加入引发剂，在15～80℃，反应1～48h，得到聚合物；其中，单体A含有双键和磺酸基团，单体B为含有双键和吡咯环的亲水性物质，单体C为含有双键的疏水性物质；
S2、将步骤S1制备的聚合物在氢氧化钠和N,N-二甲基乙酰胺的水溶液中加热1～10h后，调节pH为酸性，先后加入维生素和薯蓣皂苷元实质发生酯化反应，其中，维生素和薯蓣皂苷元的加入量是单体B物质的量的1～20％。
S3、将S2反应得到的溶液采用透析的方法去除剩余的钠离子、氯离子和N,N-二甲基乙酰胺后，冻干即得所述共聚物。
在上述技术方案中，所述单体A：(B+C)的物质的量比为99:1～1:99。在实际应用中，根据涂层材料接触血液的流速和压力不同，调整该比例；具体的：应用于主动脉血管压力较低而流速较快的血流环境，优选抗凝作用为主，抗蛋白吸附作用为辅，A：(B+C)的物质的量比为优选99:1～50:50，更优选75:25；应用于外周小口径血管压力较高而流速较慢的血流环境，优选抗蛋白吸附作用为主，抗凝作用为辅，A：(B+C)的物质的量比为优选50:50～1:99，更优选25:75。
进一步地，在上述技术方案中，所述单体B：C的物质的量比为99:1～1:99。在实际应用中，根据血液中亲水性蛋白质较多的实际情况，B：C的物质的量比优选99:1～50:50，更优选75:25。
作为优选的技术方案，步骤S1所述的有机溶剂为二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮或N,N-二甲基乙酰胺。
作为优选的技术方案，所述单体A为苯乙烯磺酸钠，所述单体B为乙烯基咯烷酮，所述单体C为乙烯基三乙氧基硅烷；
作为优选的技术方案，所述维生素为维生素A、维生素C、维生素E中的一种或多种。
作为优选的技术方案，步骤S2所述pH为3～6。
本发明还提供了采用上述方法制备的共聚物在在改性聚氨酯中的应用，具体可采用以下步骤进行改性：
步骤一：将聚氨酯材料表面依次用氢氧化钠溶液和高锰酸钾溶液活化处理，以获得表面含有活性羧基官能团；
步骤二：将共聚物溶解于N,N-二甲基乙酰胺的水溶液中，并在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀亚胺的催化作用下，使共聚物与活化的聚氨酯表面发生酰胺化反应，清洗后干燥。
作为优选的技术方案，步骤一所述活化处理具体为：聚氨酯表面先置于0.1％～5％的氢氧化钠溶液中1～10小时，再置于0.1％～5％的高锰酸钾溶液中1～10小时，温度均为室温。
作为优选的技术方案，步骤二所述催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀亚胺的摩尔比例6:4。进一步地，共聚物聚合反应使用单体B与催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀亚胺的摩尔比例10～1:6:4，优选的5～1:6:4，更加优选的为1:6:4。
本发明的有益效果为：1)本发明将含抗凝血和抗蛋白吸附官能团的单体通过加成聚合的方式形成高分子，然后通过碱催化打开吡咯烷酮五元环形成羧基和氨基，最后在酸性条件下发生酯化反应将抗感染和抗血栓的物质接枝在侧链端部。2)共聚物涂层分子侧链的氨基与活化后聚氨酯表面的羧基通过简单的酰胺化缩合聚合反应即可牢固键合在聚氨酯表面，形成稳定的聚合物涂层，显著提高了聚氨酯材料表面抗凝血、抗感染、抗蛋白吸附、抗血栓性能。
附图说明
图1实施例1制备合成的高分子中间体结构示意图；
图2实施例1制备合成的高分子中间体的吡咯烷酮五元环打开后的结构示意图；
图3实施例1制备合成的共聚物结构示意图(A为薯蓣皂苷元，B为维生素E)；
图4未涂层处理的聚氨酯材料表面(左图为低倍率全貌，右图为高倍率局部)；
图5经实施例1制备的共聚物涂层处理后的聚氨酯材料表面(左图为低倍率全貌，右图为高倍率局部)；
图6经实施例2制备的共聚物涂层处理后的聚氨酯材料表面(左图为低倍率全貌，右图为高倍率局部)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详述，但不应理解为是对本发明保护范围的限制。
①薯蓣皂苷元溶出量的测定
检验液制备：按照表面积6cm2:1mL的比例将样品浸于37℃水中72小时，收集所有液体作为检验液。
检测方法：采用反向C18色谱柱，以甲醇-水(95:5)为流动相，通过紫外检测器测定在209nm波长位置的峰面积，根据求得的标准曲线算出溶出量。
②维生素E溶出量的测定
检验液制备：按照表面积6cm2:1mL的比例将样品浸于37℃水中72小时，收集所有液体作为检验液。
检测方法：按照GB/T 17812-1999所述高效液相色谱方法进行。
③聚氨酯材料的血小板附着实验方法
用生理盐水将聚氨酯材料表面洗净后，去除产品上残留的生理盐水。对人的静脉进行采血后，立即添加肝素至50U/ml。将上述血液在采血后的10分钟以内，在聚氨酯材料中装入10mL，在37℃下振荡1小时。此后，用100ml的生理盐水将聚氨酯材料洗净，采用2.5％的戊二醛生理盐水对血液成分进行固定，用200ml的蒸馏水洗净。将洗净后的聚氨酯材料在常温下进行10小时的减压干燥。将干燥后的聚氨酯材料裁剪成适当大小，用双面胶贴附在扫描型电子显微镜的试样台上。然后，通过溅射在样品表面上形成Pt-Pd薄膜，将其作为试样。将样品的表面用场发射型扫描电子显微镜以1500倍的倍率观察试样的表面，数出1个视野中(4.3×103微米2)的附着血小板数目。在样品中央附近的纵向上不同的10个视野中附着血小板数的平均值作为血小板附着数(个/4.3×103微米2)
实施例1
一种适用于大口径血管改性的共聚物，其制备方法具体如下：
(1)抗凝血共聚物的制备
本实施例中各单体的比例如下：
对苯乙烯磺酸钠(A)、N-乙烯基吡咯烷酮(B)、乙烯基三乙氧基硅烷(C)和偶氮二异丁腈(D)的摩尔比为A:(B+C):D＝75:25:1.5，其中B：C＝75:25。
按上述比例称取适量的A、B、C单体溶于200mL的DMAc溶液中，在氮气保护下，搅拌30分钟后，加入引发剂偶氮二异丁腈，在80℃下反应20小时，使3种含双键的单体加成聚合成高分子。
将聚合后的高分子聚合物在5wt％氢氧化钠和N,N-二甲基乙酰胺的水溶液中(N,N-二甲基乙酰胺与水的质量比为1:1)加热10h，使聚合物侧链的吡咯烷酮五元环打开，产生氨基和羧基。
通过5％盐酸溶液滴定使溶液由碱性变为酸性，pH为4，采用透析的方式脱去溶液中的水和可溶性无机离子，然后在浓硫酸的催化和脱水作用下先加入薯蓣皂苷元在70℃反应2小时后，再加入维生素E反应，在70℃下反应4小时，充分完成羧、醇的酯化反应，具体为高分子侧链上的羧基与薯蓣皂苷元和维生素E中的羟基发生酯化反应；其中，薯蓣皂苷元和维生素E的加入量均为单体B物质的量的10％。
维生素E中醇羟基与吸电子效应较强的苯环结构相连，失去氢离子较为容易，因此反应活性较强，而薯蓣皂苷元中醇羟基与吸电子效应较弱的环己烷结构相连，失去氢离子较为困难，因此反应活性较弱。故将薯蓣皂苷元和维生素E按顺序分开加入能使薯蓣皂苷元充分接枝在聚合物上。
将反应后的溶液通过透析的方法去除剩余的钠离子、氯离子和N,N-二甲基乙酰胺后冻干去除剩余的水分。
(2)聚氨酯的表面改性
聚氨酯表面活化：聚氨酯表面浸泡于5％的氢氧化钠溶液中10小时，以获得表面热塑性聚合物聚碳酸酯键的水解，形成羟基和羧基。然后将产品表面浸泡于5％的高锰酸钾溶液中10小时，使表面聚氨酯中羟基、醛基等官能团氧化成羧基，至此完成聚氨酯材料表面的活化处理。
将(1)获得的聚合物溶解于N,N-二甲基乙酰胺的水溶液中，并在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的催化作用下(EDC:NHS＝6:4)，使聚合物中的氨基与活化后的聚氨酯表面的羧基发生酰胺化反应，其中聚合物与催化剂的摩尔比为聚合物：EDC:NHS＝1:6:4。反应在25℃条件下进行，反应时间为2小时。用纯水清洗去除可溶解小分子物质后干燥，最终获得含涂层的聚氨酯材料。
(3)表面改性后材料溶出物测定
取浸提液50mL，检测结果显示，溶液中薯蓣皂苷元的浓度＜1μg/mL，溶液中维生素E的浓度＜1μg/mL，均低于1μg/mL的检测限。
(4)表面改性后材料与血液接触后的表面吸附情况
按照“血小板附着实验方法”获得材料表面的部分形貌结构，相比未改性聚氨酯材料表面大量红细胞、血小板和蛋白质的聚集沉积(图4所示)，按照本实施例改性的材料表面未见红细胞附着，仅有个别血小板和少量蛋白质附着(图5所示)。
实施例2
一种适用于小口径血管改性的共聚物，其制备方法具体如下：
(1)抗凝血共聚物的制备
本实施例中各单体的比例如下：
对苯乙烯磺酸钠(A)、N-乙烯基吡咯烷酮(B)、乙烯基三乙氧基硅烷(C)和偶氮二异丁腈(D)的摩尔比为A:(B+C):D＝25:75:1.5，其中B：C＝75:25。
按上述比例称取适量的A、B、C溶于200mL的DMAc溶液中，在氮气保护下，搅拌30分钟后，加入引发剂偶氮二异丁腈，在80℃下反应20小时，使3种含双键的单体加成聚合成高分子。
将聚合后的高分子聚合物在5％氢氧化钠和N,N-二甲基乙酰胺的水溶液中(N,N-二甲基乙酰胺与水的质量比为1:1)加热1h，使聚合物侧链的吡咯烷酮五元环打开，产生氨基和羧基。
通过1％盐酸溶液滴定使溶液由碱性变为酸性，pH为6，采用透析的方式脱去溶液中的水和可溶性无机离子，然后在浓硫酸的催化和脱水作用下先加入薯蓣皂苷元在70℃反应2小时后，再加入维生素E，在70℃下反应4小时，充分完成羧、醇的酯化反应；其中，薯蓣皂苷元和维生素E的加入量均为单体B物质的量的10％。
将反应后的溶液通过透析的方法去除剩余的钠离子、氯离子和N,N-二甲基乙酰胺后冻干去除剩余的水分。
(2)聚氨酯的表面改性
聚氨酯表面活化：聚氨酯表面浸泡于5％的氢氧化钠溶液中10小时，以获得表面热塑性聚合物聚碳酸酯键的水解，形成羟基和羧基。然后将产品表面浸泡于5％的高锰酸钾溶液中10小时，使表面聚氨酯中羟基、醛基等官能团氧化成羧基，至此完成聚氨酯材料表面的活化处理。
将(1)获得的聚合物溶解于N,N-二甲基乙酰胺的水溶液中，并在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的催化作用下(EDC:NHS＝6:4)，使聚合物中的氨基与活化后的聚氨酯表面的羧基发生酰胺化反应，其中聚合物与催化剂的摩尔比为聚合物：EDC:NHS＝1:6:4。反应在25℃条件下进行，反应时间为2小时。用纯水清洗去除可溶解小分子物质后干燥，最终获得含涂层的聚氨酯材料。
(3)表面改性后材料溶出物测定
取浸提液50mL，检测结果显示，溶液中薯蓣皂苷元的浓度＜1μg/mL，溶液中维生素E的浓度＜1μg/mL，均低于1μg/mL的检测限。
(4)表面改性后材料与血液接触后的表面吸附情况
按照“血小板附着实验方法”获得材料表面的部分形貌结构，相比未改性聚氨酯材料表面大量红细胞、血小板和蛋白质的聚集沉积(图4所示)，按照本实施例改性的材料表面未见红细胞和血小板和少量蛋白质附着(图6所示)。
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