阅读说明：本技术 灭菌方法 (Sterilization method ) 是由 R·M·帕什利 A·G·桑切斯 巴里·尼哈姆 于 2018-11-28 设计创作，主要内容包括：本公开涉及用于灭活水溶液中的微生物的方法、系统和设备。该方法包括使气体的气泡通过水溶液,其中所述气体包含按体积计至少10％的CO<Sub>2</Sub>并具有至少18℃的温度。所述系统包括：气体供应装置,以供应包含至少10％的CO<Sub>2</Sub>且温度高于18℃的气体；气体输送装置,以接收气体并将其以气泡的形式输送至水溶液中。所述设备包括：透气性材料,其具有被配置为使得水溶液能够流过所述流动表面的流动表面；布置在所述透气性材料的相对侧的腔室,以提供灭活所述微生物的气体,使得所述气体能够穿过该透气性材料并作为气泡进入水溶液。(The present disclosure relates to methods, systems, and devices for inactivating microorganisms in aqueous solutions. The method comprises passing bubbles of a gas through an aqueous solution, wherein the gas comprises at least 10% CO by volume 2 And has a temperature of at least 18 ℃. The system comprises: a gas supply device for supplying a gas containing at least 10% of CO 2 And a gas at a temperature above 18 ℃; a gas delivery device to receive the gas and deliver it in the form of bubbles into the aqueous solution. The apparatus comprises: a gas permeable material having a flow surface configured to enable an aqueous solution to flow through the flow surface; is arranged atA chamber on the opposite side of the gas permeable material to provide a gas that inactivates the microorganisms such that the gas can pass through the gas permeable material and enter the aqueous solution as bubbles.)

灭菌方法

技术领域

本发明涉及灭活水溶液中的微生物的方法、系统和设备。所述方法、系统或设备可以用于对水溶液进行消毒。

背景技术

在许多情况下，可能需要灭活水溶液中微生物诸如病毒和细菌。例如，用于食品或药品制造的水中存在的微生物会引起食品或药品的污染，并且因此在使用之前可能需要对水进行处理以灭活所述的微生物。类似地，来自农业或工业用途的废水或从环境流动水中获得的水可能包含病原性微生物，在将所述水用于工业或农业目的或用于饮用水之前，需要将所述微生物灭活。

人类活动产生的废水通常含有诸如肝炎和轮状病毒之类的人类肠道病毒以及诸如大肠杆菌之类的细菌。如果要重复使用这些水，例如在农业中，则必须对其进行消毒。

已知有多种方法可以灭活水和水溶液中的病毒、细菌和其他微生物。这样的方法包括加热、用化学品(例如臭氧)处理、辐射(例如紫外线处理)、高压处理和过滤(例如膜过滤)。这些方法中的许多方法，特别是热处理方法，都是能源密集型的。迫切需要更节能的处理技术。

世界卫生组织(WHO)在其饮用水水质准则中比较了热液体中不同类型细菌和病毒的热灭活率。他们得出的结论是，高于60℃的温度可以有效地灭活病毒和细菌。当温度范围介于60℃和65℃之间时，细菌灭活比病毒灭活快。这些研究表明，在60℃的水温，大肠杆菌需要300秒才能达到1.5log的降低，而诸如肠道病毒、埃可病毒6、柯萨奇B4和B5病毒则需要1800秒才能达到4log的降低。

希望提供灭活水溶液中的病毒、细菌或其他微生物的替代方法。提供不需要使用高压，可以以相对较低的成本执行和/或不消耗能量的方法是有利的。

在第一方面，本发明提供了一种灭活水溶液中的微生物的方法，该方法包括：

使气体的气泡通过所述水溶液，其中当所述气体首次接触所述水溶液时，所述气体包含按体积计至少10％的CO₂并具有至少18℃的温度。

在一个实施方案中，所述微生物是藻类、原生动物、真菌或孢子。在一个实施方案中，所述微生物是病毒或细菌。在一个实施方案中，所述水溶液包含一种或多种病毒和一种或多种细菌的组合，并且所述方法用于灭活所述水溶液中的病毒和细菌。

通常，当所述水溶液暴露于大气压或大约大气压时，所述气泡通过所述水溶液。所述水溶液可例如暴露于约0.9至1.5巴的压力。

在一个实施方案中中，所述气泡的直径为0.1mm至7mm，例如1mm至3mm。

在一个实施方案中，所述气体包含按体积计从50％至100％的CO₂。在另一个实施方案中，所述气体包含按体积计10％至50％的CO₂。

在一个实施方案中，所述气体的温度超过100℃。在另一个实施方案中，所述气体的温度为18℃至100℃。

在一个实施方案中，通过使气体通过与水溶液接触的多孔材料而形成气泡，从而在与所述水溶液接触的材料表面上形成气泡。

在一个实施方案中，当所述气泡通过水溶液时，所述气泡占据水溶液和气泡的组合的总体积的10％至60％。

在一个实施方案中，所述水溶液的整体温度为18℃至80℃，例如，从18℃到55℃或从18℃到50℃。

在一个实施方案中，所述水溶液的整体温度为18℃至55℃，并且所述气体的温度高于所述水溶液的整体温度。

在一个实施方案中，所述水溶液包含气泡聚结抑制剂。所述气泡聚结抑制剂可以例如选自NaCl、蔗糖、乳化剂和表面活性剂。

在第二方面，本发明提供了一种用于灭活水溶液中存在的微生物的系统，该系统包括：

-气体供应装置，其被配置为供应包含按体积计至少10％CO₂的气体，所述气体具有至少18℃以上的温度；

-气体输送设备，该气体输送设备配置为接收气体的供应并将所述气体以气泡的形式输送到所述水溶液中。

在第三方面，本发明提供了一种灭活水溶液中存在的微生物的设备，所述设备包括：

-透气性材料，所述材料在其一侧具有流动表面，该流动表面配置成使所述水溶液能够流过该流动表面，

-布置在所述透气性材料的相对侧的腔室，以供应灭活所述水溶液中存在的微生物的气体，使得该气体能够穿过所述透气性材料并进入所述水溶液作为气泡流过所述流动表面。

附图简述

参照附图，仅以举例的方式进一步描述本发明，其中：

图1是实施例中用来评估使气体N₂，CO₂，Ar，空气和O₂在不同温度下通过鼓泡塔蒸发器中的水溶液通过的效果的系统/装置的示意图。根据实验，将气体泵送通过加热器(电加热器)，该加热器将气体温度保持在特定温度下刚好高于烧结矿表面。在本文所述的实施例中，鼓泡塔蒸发器的底部装有直径为135mm的40-100μm孔径的玻璃烧结体(类型2)。使用热电偶测量气体加热器中气体的温度和鼓泡塔蒸发器中水溶液的温度。

图2是在25℃、使用DLS、在0.17M NaCl中以1×10⁶细胞/ml的大肠杆菌ATCC 15597的大肠杆菌大小分布图(峰值(平均值/面积)在1601d.nm)。

图3是在实施例中使用的设备的照片，其中使用燃烧气体作为气体。该照片显示了发生器(本田EM2200)的排气管，该排气管连接到一个阀上，所述的阀通过鼓泡塔蒸发器提供27l/min的排气流量。

图4显示了样品中MS2病毒的双层噬斑测定培养皿的照片，所述样品得自BCE中经过进入温度为200℃的CO₂处理(a)0，(b)0.75，(c)2.25和(d)3分钟后的NaCl 0.17M溶液，如实施例中所述。

图5是MS2病毒存活因子log(PFU\PFU0)相对于在0.17M NaCl溶液中不同鼓泡气体(进入温度为200℃的空气、氧气、氮气、二氧化碳或氩气，或者来自60℃生成器的燃烧气体)的暴露时间(min)的图。

图6是大肠杆菌存活因子log(PFU\PFU0)相对于在0.17M NaCl溶液中不同鼓泡气体(进入温度为150℃的空气、氧气、氮气、二氧化碳或氩气，或者来自58℃发生器的燃烧气体，20℃的氧气或20℃的空气)的暴露时间(min)的图。

图7是MS2病毒存活因子log(PFU\PFU0)相对于在0.17M NaCl溶液中不同CO₂进入温度(205℃、150℃、100℃、11℃和20℃)的鼓泡二氧化碳的暴露时间(min)的图。

图8是MS2病毒存活因子log(PFU\PFU0)相对于在0.17M NaCl溶液中进入温度为22℃、流速为27l/min或20l/min的鼓泡二氧化碳的暴露时间(min)的图。

图9是当水溶液流过所述流动反应器时用于以连续方式执行本发明的方法的连续流动反应器(第三方面的实施方案)的横截面的透视图。

发明详述

在第一方面，本发明提供了一种使水溶液中的微生物失活的方法，该方法包括：

使气体的气泡通过所述水溶液，其中当所述气体首次接触所述水溶液时，该气体包含按体积计至少10％且温度至少为18℃的CO₂。

所述方法(在本文中有时称为“本发明的方法”)能够使水溶液中的水传播病毒和细菌失活，而无需将水溶液煮沸或将水溶液的整体温度提高到超过约60℃。

如本文所用，“灭活微生物”是指抑制或降低微生物的生存力或减少水溶液中存在的微生物的数量。通常，微生物的灭活杀死微生物，使得微生物不再存活。

气体的气泡可以在鼓泡塔蒸发器中通过水溶液。

鼓泡塔蒸发器(BCE)通常是圆柱形容器，其中通过塔底多孔多孔玻璃料引入的气体在液相中产生不断上升的气泡流[1]。它们被用于许多生化，化学和石化行业[2]。在废水工业中，它们被用作氯化，氧化和发酵的反应器[3]。

BCE与其他用于接触气体和液体的系统相比，具有多个优点。BCE为气体和液体之间的化学反应提供了高水平的接触，并在气体和液体之间提供了良好的传热和传质[1]。如果可以诱导气泡聚结抑制来控制气泡尺寸，则这些优点将随着有效界面面积的增加而提高。当气泡通过水溶液时，许多气泡会聚结。在BCE中使用多种强电解质可以抑制气泡聚结，并可以产生高密度气泡(直径1-3mm)[4]。自1993年以来，人们一直在研究在生理浓度(0.17M)及以上的特定盐类抑制气泡聚结的现象[4]。迄今为止没有解释。气泡通常不会在浓度大于0.17M的氯化钠中聚结，而实际上所有气体的气泡都会在该浓度以下聚结(详细结果请参见参考文献[4])。在0.17M NaCl中添加盐会抑制气泡聚结，并通过产生更高的气-水界面面积来提高BCE的性能[4]。在实施例中报道的实验中，所有研究均在0.17M NaCl溶液中进行，这为所使用的各种气体提供了相似程度的气泡聚结。

Xue等[8]最近描述了使用BCE使粪便大肠菌灭活。在该文件所述的方法中，使用空气和氮气的热气泡(在150℃)灭活了大肠菌。BCE方法用于灭活溶液中的大肠菌，同时保持较低的柱温。

在至少优选的实施方案中，使用本发明的方法，使用包含按体积计至少10％的二氧化碳的气体，相对于Xue等人的方法中所述的方法提供了意想不到的优点。例如，在一些实施方案中，即使当气体的温度远低于150℃时，包含至少10体积％二氧化碳的气体的气泡也可以有效地灭活水溶液中的微生物，包括病毒和细菌，并且即使在室温(约22℃)也如此。因此，使用包含按体积计至少10％的二氧化碳的气体提供了使微生物失活的另一种机制，该机制与Xue等人描述的热失活是不同的。结果，使用本发明的方法的这种实施方案，可能需要较少的气体加热。此外，在一些实施方案中，即使不存在气泡聚结抑制剂，包含至少10％体积二氧化碳的气体的气泡在水溶液中的聚结也比空气和许多其他气体的气泡少。因此，在一些实施方案中，在水溶液中不必包含气泡聚结抑制剂以抑制气泡的聚结。相反，当在鼓泡塔蒸发器中使用诸如空气或氮气的其他气体的气泡时，通常需要在水溶液中包含气泡聚结抑制剂以抑制气泡的聚结。

当用作超临界流体或在高压下使用时，以前已成功地将二氧化碳用于细菌和病毒的灭活。其他研究也比较了在不同的高压和高温条件下，使用***性减压系统与CO₂，N₂，N₂O和Ar进行***性减压时，面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的灭活率。这些研究发现，CO₂和N₂O的灭活率高于其他气体。这归因于它们在水中可溶并随后被细胞吸收[17]。与这些研究中使用的方法相反[14-17]，本发明可有效地灭活微生物而无需使用高压。不希望受理论的束缚，据信本发明方法的有效性至少部分地是由于使气泡通过水溶液而产生的大的CO₂-液体接触表面。这增加了溶解在溶液中的二氧化碳的量，即使在暴露于大气压的水溶液中保持约1atm的压力下，也可以产生与在密相二氧化碳法中提高压力所获得的结果相似的结果。

水溶液

术语“水溶液”是指液体，其中水是唯一的溶剂或占液体中全部溶剂重量的至少50％。水溶液可以是乳液或微乳液的一部分，例如油/水乳液或微乳液的水性组分。水溶液可以包含水和与水混溶的助溶剂，例如甲醇或乙醇，条件是水占存在的溶剂的至少50％重量。在一些实施方案中，水占所述水溶液中的溶剂的重量的至少80％，例如80％至100％，90％至100％，98％至100％，99％至100％，80％至99％或90％至99％。

该水溶液例如可以是含有微生物的水，其将被处理以提供饮用水。例如，本发明可用于处理含有潜在病原微生物的来自环境流水例如河流或湖泊的水，以将微生物的数量减少到足够低的水平，以使得该水适合用作人类的饮用水或适合农业使用。

在一些实施方案中，所述水溶液是来自农业用途的含有病毒、细菌和/或其他微生物的废水，并且在将水再利用以进一步用于农业用途之前或在将水释放到环境中之前，对所述水进行处理以灭活病毒、细菌和/或其他微生物。

在其他实施方案中，所述水溶液可以是来自发酵或生物反应器的包含用于生产蛋白质的细菌的培养基。使用细菌生产蛋白质的常规发酵过程的一个问题是如何既停止细菌的生长又如何提取所需的蛋白质。在某些情况下，例如对于完全或部分疏水的蛋白质而言，所需蛋白质的提取可能会很困难，这些蛋白质往往会在细胞内部被“疏水力”固定在一起从而“聚集”在一起。在某些以前的方法中，使用单链阳离子表面活性剂分离蛋白质并进行提取，这些表面活性剂会通过去污力破坏细胞膜。此后，阳离子表面活性剂覆盖疏水蛋白，并通过它们之间的静电排斥将团块分离成所需的单个分子单元，现在由它们的阳离子表面活性剂涂层带电。但是，然后需要从蛋白质中除去表面活性剂，例如通过使表面活性剂和蛋白质通过离子交换柱，这可能是昂贵的。本发明的方法提供了杀死细菌的另一种方法。此外，在疏水蛋白的情况下，可以对系统进行脱气以分离疏水蛋白。

水具有高蒸发热。蒸发热(也称为汽化焓或汽化热)是在给定压力下将一定量的物质从液体转变为气体所需的焓变。对于具有高蒸发热的液体，与具有较低蒸发热的液体相比，需要更多的热量来蒸发给定量的液体。由于水蒸发的热量高，气体(特别是当所用气体的湿度较低时)通过水溶液时，与蒸发热量较低的液体相比通常会导致整体液体的加热效应降低(由于气泡捕获的蒸气)。

在一些实施方案中，当气体的气泡通过水溶液时，水溶液的整体温度为18℃至80℃，例如18℃到60℃，18℃到55℃，18℃到50℃，20℃到80℃，20℃到60℃，20℃到55℃或20℃至50℃。液体的整体温度是指远离表面的液体温度，所述表面例如装有液体的容器表面或通过液体的气泡表面。在本发明的方法中，可以通过在远离表面的点测量水溶液的温度来确定水溶液的整体温度。由于在本发明的方法中穿过水溶液的气泡引起水溶液的快速混合，因此通常可以通过使用常规温度计或其他用于测量液体温度的设备通过单独测量水溶液的温度来确定水溶液的整体温度。本领域技术人员将能够考虑诸如以下的因素来选择合适的方法来确定水溶液的整体温度，例如，用于使气泡通过水溶液的方法和用于容纳水溶液的容器等。

在一些实施方案中，在使气体气泡通过水溶液之前，水溶液的整体温度为10℃至80℃，例如10℃到30℃，10℃到50℃，18℃到80℃，18℃到60℃，18℃到55℃或18℃到50℃。在一些实施方案中，当气体的气泡通过水溶液时，所述水溶液的整体温度可以改变(取决于具体的气体或气体混合物以及气体和水溶液的相对温度而升高或降低)。

所述水溶液中可以包含气泡聚结抑制剂。因此，在一些实施方案中，所述水溶液包含气泡聚结抑制剂。在一些实施方案中，该方法在使气泡穿过水溶液的步骤之前包括向该水溶液中添加气泡聚结抑制剂的步骤。在其他实施方案中，所述水溶液不包含气泡聚结抑制剂，不包含添加的气泡聚结抑制剂，或不包含大量的气泡聚结抑制剂或添加的气泡聚结抑制剂。

如本文所用，术语“气泡聚结抑制剂”是指当以超过一定浓度存在于水溶液中时抑制水溶液中的气泡聚结的任何物质。本领域技术人员可以容易地确定物质是否为气泡聚结抑制剂。例如，本领域技术人员可以通过将不同浓度的该物质添加到水溶液样品中并目视观察该物质对通过水溶液的气泡例如空气的气泡的聚结的作用，确定该物质是否为气泡聚结抑制剂。气泡聚结抑制剂的实例包括某些盐，例如MgCl₂，MgSO₄，NaCl，NaBr，NaNO₃，Na₂SO₄，CaCl₂，Ca(NO₃)₂，KCl，KBr，KNO₃，NH₄Br，NH₄NO₃，CsBr，LiCl，LiNO₃，LiSO₄以及各种糖，例如蔗糖。其他气泡聚结抑制剂包括乳化剂和表面活性剂。在一些实施方案中，所述水溶液是废水或包含废水，其可能已经包含一种或多种气泡聚结抑制剂。在一些实施方案中，所述废水包含脂质、表面活性剂和/或生物聚合物。

与空气，氮气和许多其他气体的气泡相比，包含按体积计至少10％二氧化碳的气体气泡在水溶液中的聚结较少。因此，在本发明的方法中，所述水溶液中不必包括气泡聚结抑制剂。然而，在一些实施方案中，可以将气泡聚结抑制剂添加到水溶液中以抑制气泡的聚结。在这样的实施方案中，所述气泡聚结抑制剂通常以有效抑制气体气泡在水溶液中聚结的量包含在所述水溶液中。

在一些实施方案中，所述气泡聚结抑制剂是表面活性剂或乳化剂。表面活性剂可以是例如非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂(例如普通肥皂)或两性离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括单十二烷基八甘醇。阳离子表面活性剂包括氯化十六烷基吡啶。阴离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。乳化剂的实例包括充当乳化剂的脂质、蛋白质和脂肪。一些聚合物还充当乳化剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素和聚氧乙烯硬脂酸酯。

气体气泡

本发明的方法包括使气体的气泡通过水溶液。该气体包含按体积计至少10％的二氧化碳。因此，气体包含按体积计10％至100％的二氧化碳。

如本领域技术人员将理解的，当气泡通过水溶液时，气泡中的气体成分的相对量可以改变。例如，当气体包括气体混合物时，一种或多种气体比其他气体更容易溶解在水溶液中。作为另一个例子，当气泡通过水溶液时，水或水溶液的其他成分可被蒸发并掺入气泡中的气体中。除非另有说明，否则本文中对气体组分的量(例如，气体中CO₂的体积百分比)的引用是指气体首次与水溶液接触时气体中的组分的含量。在水溶液中形成气泡。首先与水溶液接触的气体在本文中有时称为进气(inlet gas)。

如本领域技术人员还将理解的，当气泡通过水溶液时，气泡中的气体的温度可以改变。除非另有说明，否则本文所指的气体温度是指气体首先与水溶液接触时的气体温度，即进气温度。

在一些实施方案中，所述气体包含按体积计50％至100％，例如50％至100％。80％至99％的二氧化碳。

在一些实施方案中，所述气体包含按体积计10％至98％，例如10％至80％，10％至90％，10％至80％，10％至50％或10％至20％的二氧化碳。在一些实施方案中，所述气体包含按体积计15％至100％，或20％至100％的二氧化碳。

作为温室气体的二氧化碳被认为对全球变暖负有责任。垃圾填埋场，沼气厂和燃煤发电厂等许多行业排放大量的二氧化碳。本发明有利地提供了一种使用由这种工业产生的含CO₂气体的方法。

所述气体首次接触水溶液时的气体温度至少为18℃。

在一些实施方案中，当气体首次接触水溶液时的气体温度高于水溶液的整体温度。在一些实施方案中，水溶液的整体温度为18℃至55℃，并且气体的温度高于水溶液的整体温度。

在一些实施方案中，所述气体的温度为至少50℃，例如，至少55℃，至少60℃或至少100℃。在一些实施方案中，所述气体的温度为50℃至1000℃，50℃至500℃，50℃至400℃，50℃至300℃，50℃至200℃。，50℃至150℃，55℃至1000℃，55℃至500℃，55℃至400℃，55℃至300℃，55℃至200℃，55℃至150℃，60℃至1000℃，60℃至500℃，60℃至400℃，60℃至300℃，60℃至200℃或60℃到150℃。在一些实施方案中，所述气体的温度为至少100℃，例如100℃至1000℃，100℃至500℃，100℃至400℃，100℃至300℃，100℃至200℃，150℃至1000℃，150℃至500℃，150℃至400℃，150℃至300℃，150℃至200℃或100℃至150℃。

当引入温度高于水溶液的整体温度的气体的气泡并使其通过水溶液时，在每个气泡周围会产生瞬时的热表面层。例如，当引入温度超过100℃的气体气泡并使其通过整体温度低于100℃的水溶液时，在每个气泡周围产生瞬时的热表面层。该瞬时热表面层具有比水溶液的整体温度更高的温度。不受理论的束缚，据信，当气体的温度为100℃或更高时，微生物与该瞬态热表面层的相互作用以及加热的气泡本身会导致微生物失活，即使水溶液的总体温度低于会使微生物失活的温度也是如此。

当气泡通过水溶液时，瞬态热表面层引起一些水溶液的汽化，其被所述气泡吸收。这导致气泡在通过水溶液时冷却，并且当气泡通过水溶液时，瞬态热表面层的温度和范围减小。气泡能够吸收汽化的水溶液的程度因此影响了当气泡通过水溶液时气体增加水溶液的整体温度的程度。当气体具有低湿度时，与气体具有较高的初始水含量时相比，将发生更大的水溶液汽化，从而导致更多的热能被用于汽化。由于当气泡通过水溶液时一些水溶液汽化的结果，气泡可以通过水溶液通过而基本上不增加水溶液的整体温度。因此，本发明提供了一种可用于使水溶液中的微生物失活的方法，该方法不需要将本体溶液加热至有效使微生物失活的温度。

在一些实施方案中，当气体首先与水溶液接触时(即，进气)具有相对较低的湿度。在一些实施方案中，所述气体的相对湿度小于50％，例如小于40％，小于25％，小于20％或小于10％。湿度相对较低的气体比湿度较高的气体更容易从水溶液中吸收水蒸气，因此将导致散装液体的加热较少。

在一些实施方案中，所述水溶液包含表面活性剂或乳化剂。如上所述，表面活性剂可以充当气泡聚结抑制剂。所述水溶液中表面活性剂或乳化剂的存在还可以提高微生物的灭活速率，特别是当进气的温度超过100℃时。表面活性剂或乳化剂在气泡周围形成涂层。由于在气泡的表面层中存在表面活性剂或乳化剂，因此气泡的表面层的沸点高于在不存在表面活性剂或乳化剂的情况下围绕气泡形成的表面层。结果，与在不存在表面活性剂或乳化剂的情况下形成的气泡相比，气泡的瞬态热表面层可以达到更高的温度。将微生物暴露于具有较高温度的瞬时热表面层中可增加微生物的灭活速率。

出人意料的是，当气体温度低于100℃时，例如在约22℃至50℃，本发明的方法仍可有效地灭活水溶液中的一种或多种微生物。不希望受到理论的束缚，据信这是由于使气泡通过水溶液而产生的大的CO₂-液体接触表面。即使当本发明的方法在暴露于水的水溶液中进行时，这也增加了溶解在溶液中的二氧化碳的量，据信产生了与通过在密相二氧化碳过程中增加压力可以实现的效果相似的效果，即便如此，当本发明的方法在暴露于大气压的水溶液中进行时，所述压力保持在1atm左右。因此，在一些实施方案中，所述气体的温度低于约100℃，例如，18℃到100℃或22℃到100℃。在一些实施方案中，所述气体的温度为18℃至50℃或22℃至50℃。

在一些实施方案中，进气可以是由包含碳的燃料在空气或另一种含氧的气氛中的燃烧形成的燃烧气体，例如甲烷、天然气、石油、煤炭、焦炭、木炭、木材、沼气、生物质或乙醇的燃烧。在一些实施方案中，所述燃烧气体是内燃机的排气。通过在空气中燃烧包含碳的燃料而形成的燃烧气体包括气体的混合物。通过在空气中燃烧含碳燃料而形成的气体包括二氧化碳和其他燃烧产物以及氮气和氩气(来自空气)。其他燃烧产物通常包括水，以及少量其他气体，例如CO，H₂，SO₂和氮氧化物。

燃烧气体无需进一步处理即可用于本发明的方法。有利地，可在燃烧之后立即使用燃烧气体，同时该气体具有来自燃烧过程的升高的温度。

在本发明的方法中使用燃烧气体具有几个优点。首先，本发明的方法提供了用于燃烧气体的用途，否则该燃烧气体通常将被视为废物。燃烧气体可具有升高的温度，当气泡通过水溶液时，该温度可有助于微生物的灭活。此外，存在于燃烧气体中的痕量气体，例如CO，H₂，SO₂和氮氧化物，本身可能具有杀生物作用，有助于水溶液中微生物的失活。此外，燃烧气体中水蒸气的存在降低了鼓泡塔的蒸发冷却效果，从而使燃烧气体比另一种具有较低水蒸气量的气体将水溶液加热的程度更大。

当所述水溶液暴露于大气压时，可以例如使用具有的压力刚好在大气压以上的压力范围内例如在1至1.5个大气压的范围内的气体入口将气泡引入水溶液中。

在一些实施方案中，所述气泡是通过使气体通过多孔材料，例如通过多孔材料而形成的。多孔玻璃烧结体，与水溶液接触，从而在与水溶液接触的材料表面上形成气泡。随着更多的气体通过多孔材料，气泡从材料表面释放出来并通过水溶液上升。有利地，可以在气体接触多孔材料之前调节气体的温度，从而提供一种在气体接触水溶液时控制气体温度的手段。在一些实施方案中，多孔材料是烧结材料(例如玻璃烧结物，玻璃粉或金属烧结物，例如不锈钢烧结物)或多孔陶瓷(例如耐火陶瓷)。在一些实施方案中，所述多孔材料的孔径在1至1000μm的范围内(例如10至500μm，20至200μm，40至100μm，50至80μm)。尤其是40至100m。如将意识到的，本领域技术人员可以通过改变各种参数来操纵气泡的大小，所述参数诸如多孔材料的孔径，水溶液的粘度，水溶液的表面张力，气体流速和/或气压。

通常，通过使气体通过包含水溶液的容器或结构的底部处的多孔材料而使气体的气泡通过水溶液，以形成气体的气泡，然后该气泡上升通过水溶液。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了使水溶液中的微生物失活的方法，该方法包括：

使气体通过与所述水溶液接触的多孔材料以在所述水溶液中形成气体的气泡，并使气泡上升通过所述水溶液，

其中所述气体包含按体积计至少10％的CO₂，并且当所述气体首次接触所述水溶液时具有至少18℃的温度。

在一些实施方案中，所述方法在鼓泡塔蒸发器(有时称为鼓泡塔反应器)中进行。鼓泡塔反应器通常由一个或多个垂直排列的圆柱形塔组成。气泡塔被构造成使得气泡形式的气体被引入到塔的下部并通过液相上升。从液相的顶表面逸出的气体可以被重新捕获。回收的气体可以再循环回到鼓泡塔反应器，再加热并重新引入到塔底。

优选地，所述气泡的直径为0.1mm至7mm，例如0.1mm至7mm，0.1mm至6mm，0.1mm至5mm，0.1mm至4mm，0.1mm至3mm，0.1mm至2mm，0.1mm至1mm，0.5mm至7mm，0.5mm至6mm，0.5mm至5mm，0.5mm至4mm，0.5mm至3mm，0.5mm至2mm，0.5mm至1mm，1mm至7mm，1mm至6mm，1mm至5mm，1mm至4mm，1mm至3mm，1mm至2mm，2mm至7mm，2mm至6mm，2mm至5mm，2mm至4mm或2mm至3mm。所述气泡优选以高密度通过水溶液。通常，由于高密度气泡的通过，水溶液变得不透明。在一些实施方案中，当气泡通过水溶液时所述气泡占据水溶液和气泡的总体积的10％至60％(例如20％至60％，30％至60％，40％至60％，50％至60％，10％至50％，20％至50％，25％至55％，30％至50％，40％至50％，10％至40％，20％至40％，30％至40％，10％至30％，20％至30％或，或10％至20％)。

当使用暴露于大气压的BCE时，所述气体气泡在塔中的压力通常约为1个大气压加上塔中液体的静水压力。当它们离开色谱柱时，其压力将降至1个大气压。进入塔底的干气体气泡将迅速吸收与塔中液体温度相对应的水蒸气密度。

气体气泡可以例如以连续或间歇的方式通过水溶液。优选地，所述气泡以连续的流通过水溶液。在这样的实施方案中，当气泡穿过水溶液时，所述气泡通常占据水溶液和气泡的组合的总体积的10％至60％。

在一些实施方案中，使气泡以连续流通过水溶液超过约30秒的时间，例如持续约1分钟以上的时间。在一些实施方案中，使所述气泡以连续流通过水溶液30秒至90分钟，1分钟至90分钟，1分钟至30分钟，1分钟至10分钟，2分钟。分钟到30分钟或5分钟到30分钟。

在一些实施方案中，使所述气泡以大于每min每L水溶液0.1L气体的速率通过水溶液，例如每分钟每升水溶液中0.1至1000、1至1000、10至1000或10至100L气体。

在第二方面，本发明提供了一种用于灭活水溶液中存在的微生物的系统，该系统包括：

-气体供应装置，其被配置为供应包含按体积计至少10％CO₂的气体，所述气体具有至少18℃以上的温度；

-气体输送设备，该气体输送设备构造成接收气体的供应并将气体以气泡的形式输送到水溶液中。

关于第一方面描述的特征也可以应用于第二方面。

在一些具体的实施方案中，所述气体输送设备是鼓泡塔蒸发器或鼓泡塔反应器。在一些具体的实施方案中，所述气体输送设备是鼓泡塔蒸发器或鼓泡塔反应器的阵列。在一些具体的实施方案中，该阵列包含2至200个BCE，例如5-100个BCE。

在一些具体实施方案中，所述气体供应装置包括加热器，以加热气体源或进气，从而形成温度至少为18℃以上的气体。

在一些具体实施方案中，所述气体供应源还包括气体源。气体源可适于提供按体积计至少10％的CO₂的气体。在一些具体实施方案中，所述气体源可以是可商购的产品，例如在加压气瓶中的CO₂(例如，可得自BOC Gas Australia)。在一些具体实施方案中，可以将CO₂与一种或多种其他气体(例如，N₂，O₂，Ar)混合以获得所需比例的CO₂(例如，以体积或分压计)。在一些实施方案中，CO₂可以例如通过化学反应，包括燃烧而在现场产生。在一些具体实施方案中，所述气体源是通过燃烧包括碳的燃料，特别是在内燃机中燃烧的燃料而形成的燃烧气体。

图1是描绘根据本发明的第二方面的系统的实施方案的示意图。系统100包括气体供应装置，该气体供应装置包括与第一龙头102，空气流量计103，气体加热器104和第二龙头105流体连通的气体源101(其提供按体积计包含至少10％CO₂的气体)。加热器104可以用于确保到达气体输送设备的气体的温度大于约18℃。在一些实施方案中，加热器104用于将气体加热到期望的温度。气体供应器构造成将气体供应到气体输送设备。在该实施方案中，气体输送设备包括泡罩塔蒸发器106，该泡罩塔蒸发器本身包括玻璃烧结体107形式的多孔材料和构造成容纳液体的部分。在使用中，鼓泡塔蒸发器106包含含有微生物108的水溶液。气体输送设备通过玻璃烧结体107将加热的气体输送到水溶液108中。当气体输送到溶液108中时，它形成所述气体的气泡109通过溶液108上升，从而使存在于溶液108中的微生物失活。该实施方案还包括用于测量整体溶液108的温度的热电偶110。

在第三方面，本发明提供了一种使水溶液中存在的微生物失活的设备，该设备包括：

-透气材料，该材料在其一侧具有流动表面，该流动表面构造成使水溶液能够流过该流动表面，

-布置在透气性材料的相对侧的腔室，以供应使水溶液中存在的微生物失活的气体，使得该气体能够穿过透气性材料并作为气泡进入流过该流动表面的水溶液中。

关于第一方面描述的特征也可以应用于第三方面。

通常，使水溶液中存在的微生物失活的气体是按体积计包含至少10％的CO₂且具有至少18℃的温度的气体。

在一些具体实施方案中，所述水溶液的流动通过重力实现。在一些具体实施方案中，所述水溶液的流动通过泵进行。

在一些具体实施方案中，所述设备包括加热元件，该加热元件定位成在接触透气性材料之前加热气体。在一些具体实施方案中，所述加热元件设置在腔室中。在一些具体实施方案中，所述加热元件设置在腔室的入口内或附近，以在进入的气体进入腔室时对其进行加热。在一些具体实施方案中，腔室壁被加热。在一些具体实施方案中，所述热交换器用于加热进入的气体。

在一些具体实施方案中，所述流动表面为通道的形式。在一些具体实施方案中，所述流动表面是导管或管道的一部分。在一些具体实施方案中，跨过流动表面的流动涉及水溶液从表面的第一区域到表面的第二区域的流动。

在一些具体实施方案中，所述流动表面被配置为使得当气泡流过流动表面时，气泡在与水溶液的流动方向成横向的方向上穿过水溶液。在一些具体实施方案中，气泡在水溶液中上升，而水溶液在基本水平的方向上流动(例如，从约0°至约20°，从约0°至约10°或从约0°至约5°)。

在一些具体实施方案中，选择透气材料，使得当水溶液在约0.9至1.5巴的压力下时，进入水溶液的气泡的直径为约0.1mm至约7mm。如本领域技术人员将理解的，这可以通过选择在特定压力或压力范围下操作的具有适当孔隙率的透气材料来实现。

在一些具体实施方案中，该设备包括盖，该盖布置成在气体离开水溶液时捕获气体。

当水溶液在两个位置之间流动时(例如，当水溶液移动通过通道时)，本发明的方法可以以连续的方式进行，例如使用第三方面的设备。图9是连续流动反应器的横截面的透视图，当水溶液移动通过流动反应器时，该连续流动反应器可用于执行本发明的方法。如图9中大体上所示，气体(例如，CO₂气体或燃烧气体)通过入口被引入到腔室中。可选地，腔室中的加热器用于加热气体。气体然后流过多孔结构，例如由多孔陶瓷例如耐火陶瓷形成的通道，到形成多孔结构中水溶液流过的通道。然后，气泡上升通过水溶液，随着水溶液沿通道移动，灭活水溶液中的微生物。

更详细地，图9是描绘根据本发明的第三方面的设备的实施方案的示意图。装置200包括入口201，该入口201用于接收包含至少10体积％的CO₂的气体。气体在流进腔室203时通过加热器202。在替代实施方案中，腔室203本身可以被加热。在使用中，腔室203充满加热的气体。在正压下，将加热的气体推动通过以耐火陶瓷204(多孔材料；气体由箭头206指示的运动)的形式的透气性材料经由流动表面205并进入水溶液207。在该实施方案中，所述流动表面为通道的形式。气体以加热的气泡208的形式从流动表面205上升，其上升通过水溶液。水溶液207在重力的作用下沿基本水平的方向流过所述流动表面，而气泡208通常通过水溶液207大致竖直地上升，并出现在溶液的表面上。在一些实施方案中，通过放置在水溶液顶部上方的盖来捕获涌出的气体，可选地形成针对保持多孔材料204的无孔支撑结构209和210(其可以形成腔室的一部分)的密封。在一些实施方案中，所述支撑结构209是可拆卸的。

微生物

通常，所述微生物是细菌，例如大肠杆菌或病毒。但是，本发明的方法也可以用于灭活其他微生物，例如藻类、原生动物、真菌或孢子。

在一些实施方案中，所述微生物是选自以下的细菌：大肠杆菌，肉毒梭菌，空肠弯曲菌，霍乱弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，海洋分枝杆菌，诸如志贺氏痢疾杆菌的引起痢疾的种，诸如嗜肺军团菌的军团菌属的种，钩端螺旋体属的种，或伤寒沙门氏菌。

在一些实施方案中，所述微生物是选自冠状病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒或多瘤病毒的病毒。

在一些实施方案中，所述微生物是原生动物，例如小隐孢子虫或另一种致病的原生动物。

在一些实施方案中，所述水溶液中的微生物灭活是至少减少1log，例如减少1到4log，减少1到3log，减少1到2log，减少1到1.5log，减少1.5到4log，减少1.5到3log，减少1.5到2log，减少2到4log，减少2到3log。所述减少相对于初始溶液中(即，在与气体接触之前)的初始微生物含量。在一些具体实施方案中，所述微生物灭活在90分钟以内完成，例如30秒至90分钟，30秒至90分钟，30秒至30分钟，30秒至10分钟，30秒至5分钟，1分钟至90分钟，1分钟至30分钟，1分钟至10分钟，1分钟至5分钟，2分钟至30分钟或5分钟至30分钟。

实施例

下面参考以下非限制性实施例描述本发明的各种实施方案。

模型水处理病毒和细菌系统

MS2病毒

选择MS2噬菌体(ATCC 15597-B1)[12、13]作为模型病毒，以评估病毒灭活方法的效率。通常通过标准菌斑测定法对感染单位进行计数来量化MS2，该标准菌斑测定法通常用于检测处理后的饮用水和废水中的MS2[20]。

MS2被用作肠病毒的替代品，因为它仅在60℃以上的温度下才失活，对高盐度有抵抗力，并且仅对低pH敏感。这意味着它对环境压力具有很高的抵抗力[21]。

根据[22]，MS2是一类称为噬菌体的噬菌体成员。其整个基因组已被测序。它是一个3,569个核苷酸的正义单链RNA分子，具有二十面体结构。该病毒的流体动力学半径约为13nm[22]。

使用Cormier等[23]中描述的优化的双层噬斑测定技术对病毒灭活进行了分析，该技术通过使用大肠杆菌作为宿主仅检测传染性病毒。

大肠菌

大肠杆菌是革兰氏阴性细菌，直径为1.1-1.5μm，长度为2.0-6.0μm，呈直圆柱状[24]。它存在于动物和人类的胃肠道中。大肠杆菌菌株对宿主无害或致病。由于粪便污染，它们可以在水和土壤中发现。因此，它在水中的存在经常被用作监测水质的指标[25]。

许多研究使用大肠杆菌C-3000(ATCC15597)作为水中细菌的代表性模型[26,27]。大肠杆菌C-3000(ATCC15597)是具有1级生物安全性的生物[11]，可以用作MS2病毒宿主[28]。这就是为什么选择它进行此项工作的原因。在0.17M NaCl背景溶液中测量了大肠杆菌菌株(ATCC 15597)的粒径分布，并在1600nm处获得了峰尺寸(结果如图2所示)。该值符合圆柱棒形状的直径为1100-1500nm和长度为2000-6000nm的文献测量值[24]。

Spinks等[29]证明病原菌在55℃至65℃的温度范围内会失活。其他研究发现，大肠杆菌在超过55℃的温度首先出现热灭活迹象，在60℃时达到很高的灭活率[30]。这是可以预期的，因为膜磷脂在该温度下具有相变并失去其有序状态。

材料与方法

实验解决方案

通过在Aesculap 420中在15psi和121-124℃高压灭菌15min来制备和消毒电解质溶液[31]。

通常，所用溶液在300ml Milli-Q水中包含0.17M NaCl(纯度≥99％，得自Sigma-Aldrich)。

Tabor等[32]发现水中的气泡聚结取决于气体类型和pH值。在Tabor等人的文章中，观察到CO₂气泡不会聚结，而其他气体(如Ar，N₂和空气)会聚结。因此，在以下描述的实验中使用0.17M NaCl溶液以确保所有研究气体的气泡聚结相似，从而消除了可能的混淆变量。在实验中，使用NaCl(0.17M)来减小气泡大小并抑制聚结，但是废水中通常含有脂质，表面活性剂和生物聚合物，即使为低含量也可以稳定气泡并减小气泡大小。

MS2病毒对高盐度有抗性，并且在1至2M的NaCl存在下稳定[33]。先前的研究[5、8和9]已显示0.17M NaCl溶液不会灭活大肠杆菌。因此，NaCl的浓度不应成为病毒或细菌灭活的因素。

病毒实验的培养基制备

如Cormier等人[23]中所述，一种特定的优化的双层噬斑测定技术可用于评估活性MS2病毒的浓度。这种噬菌斑测定方法通常用于检测经过处理的饮用水，废水和海水中的MS2。根据噬菌体杀死宿主细菌并允许噬菌体在固定在琼脂层上的细菌宿主细胞汇合区上繁殖的能力来评估水质[23,28,34,35]。

该培养基不是市售的，因此在每个实验之前，先从两种溶液(A和B)制备1.5L。为制备溶液A，使用15克胰蛋白胨，1.5克酵母提取物12克NaCl和1425ml Milli-Q水。用ThermosScientific Orion Star A214 pH计测量pH值为6.9。将该溶液无菌分配到3个装有不同琼脂量的容器中(底部琼脂1％，顶部琼脂0.5％，培养基中无琼脂)，实验中使用的琼脂是Sigma-Aldrich分子生物学级的。将这些溶液加热至沸腾以溶解琼脂，并通过在Aesculap420中在15psi、121-124℃高压灭菌15min来灭菌。

溶液B改进了病毒的可见性。该溶液如下制备:将1.5g葡萄糖，0.441克CaCl₂和0.015g硫胺素加入75ml Milli-Q水中，并通过0.22μm过滤器过滤以进行灭菌，然后在其冷却至50℃时分别无菌添加至3种溶液A中的每一种。

将底部琼脂倒入100mmx15mm培养皿中，并在本生灯(Bunsen burner)上干燥，以保持局部环境无菌性，直到琼脂不太干或太潮湿[34]。

大肠杆菌实验的培养基制备

噬菌斑测定法通常用于检测经过处理的饮用水，废水和海水中的大肠杆菌。根据细菌在琼脂层中繁殖的能力评估水质[26,34]。

对于每个实验，从两种溶液(A和B)中制备1L。为制备溶液A，使用13g的胰蛋白胨，1克酵母提取物，6克NaC和1000ml Milli-Q水。用Thermos Scientific Orion Star A214 pH计测量pH值为6.9。将该溶液无菌分配到两个装有不同量琼脂(1.41％琼脂培养基和无琼脂培养基)的容器中，实验中使用的琼脂为Sigma-Aldrich的分子生物学级。将这些溶液加热至沸腾以溶解琼脂，并通过在Aesculap 420中在15psi和121-124℃高压灭菌15min来灭菌。

溶液B改善了细菌的生长。该溶液如下制备：通过将1g葡萄糖和0.010g硫胺素加入到50ml Milli-Q水中，并通过0.22μm过滤器过滤以进行灭菌，然后将其冷却至50℃时分别无菌添加至2种溶液A中。

将1.41％的琼脂溶液倒入100mmx15mm的培养皿中，并在本生灯旁干燥，以保持局部环境无菌性，直到琼脂不太干燥或太潮湿[34]。

细菌菌株

大肠杆菌C-3000(ATCC15597)用作水中细菌的代表性模型[26,27]，用于大肠杆菌灭活实验以及用于病毒实验作为MS2病毒宿主[28]。使用Malvern Zetasizer纳米系列仪器在带有不同气泡的0.17M NaCl溶液中测量大肠杆菌的大小和Zeta电位。

为了成功进行噬菌斑测定，大肠杆菌C-3000(ATCC 15597)必须处于指数生长期。这可以通过培养两种不同的细菌培养物来实现：过夜培养物和对数期培养物[28,31,35]。过夜培养物在10ml不含琼脂的培养基中于37℃在Labtech数字培养箱LIB-030M中培养18–20h，同时使用PSU-10i轨道振荡器以110rpm的速度震荡。过夜培养导致培养物中的大量细菌，并将其用作参考标准。

为了开始对数期大肠杆菌培养，将1ml的过夜培养物转移至25-30ml无琼脂的肉汤中，并在37℃在110rpm的温和震荡下温育3h。为了防止细胞损失F-pill，然后将其在5℃的冰箱中快速冷却。然后使用UV-VIS光谱仪UVmini-1240测量对数期大肠杆菌培养物的光密度(OD)。520nm处的OD读数介于0.8和1.1之间，表明该培养物可用于噬菌斑测定中用于病毒实验，并可作为大肠杆菌实验的标准品。

病毒株

从美国典型培养物保藏中心获得冷冻干燥的MS2噬菌体小瓶。根据国际标准ISO10705-1[31]和美国环境保护局的紫外线消毒指导手册[36]，使用大肠杆菌C-3000(ATCC15597)复制噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)。使用Malvern Zetasizer纳米系列仪器测量在带有不同气泡的0.17M NaCl溶液中MS2病毒的Zeta电位。

病毒和细菌稀释

MS2噬菌体和大肠杆菌的浓度如下计算：向小瓶中添加1.0ml不含琼脂的培养基，并通过将0.50ml的噬菌体和大肠杆菌(在另一个实验中)放入含有4.50ml无琼脂培养基的试管中连续进行12次10倍稀释[35]。将0.1ml 10^-6到10^-12的稀释液点在14个培养皿的表面上，并用木棒(hocky stick)涂抹。

温育过夜后，在37℃18-24h，可计数单个噬菌斑，并使用以下公式计算MS2噬菌体和大肠杆菌的浓度：

未稀释的峰混悬液的PFU/mL＝(PFU1+PFU2…PFUn)/(V1+V2…Vn)

在这里，PFU是板中噬菌斑形成单位的数量，Vn是添加到含有可计数噬菌斑的板上的每个未稀释样品的体积(mL)，n是可用计数的数量。

鼓泡塔蒸发器工艺

图1示出了用于评估使不同温度的气体N₂，CO₂，Ar，空气和O₂通过鼓泡塔蒸发器中的水溶液的效果的系统/装置的示意图。取决于实验，将气体泵送通过电加热器，该电加热器将气泡温度保持在鼓泡塔蒸发器底部烧结矿表面的正上方。鼓泡塔蒸发器的底部装有直径为135mm的40-100μm孔径的烧结玻璃(类型2)。

将水溶液倒入色谱柱后，用热电偶在色谱柱溶液的中心测量溶液的温度。然后将气体通过烧结玻璃进入300ml溶液中，以灭活MS2病毒或大肠杆菌(在单独的实验中)。

当使用燃烧气体时，使用了与其他实验中使用的类似的鼓泡塔蒸发器，并将发生器(Honda EM2200)的排气管连接到阀上，该阀通过鼓泡塔提供27l/min的排气流量(如图3所示。)

消毒实验

实验使用0.17M NaCl溶液(初始温度22.5℃)进行，进气为CO₂，氩气，氮气，空气，氧气和燃烧气体混合物，对于E.coli实验，CO₂、氩气、氮气、空气和氧气的温度为150℃，燃烧气体为58℃，氧气和空气为20℃，对于MS2病毒实验，CO₂、氩、氮、空气和氧气为200℃，燃烧气体为60℃，所述的实验在BCE中进行，并且作为比较的实验在22.5℃和pH 4.2的水浴中进行。进一步的实验还使用MS2病毒在0.17M NaCl溶液中(初始温度约为22℃)在BCE中进行，其利用具有不同进入温度(205℃，150℃，100℃，11℃和20℃)的CO₂气体以及进入温度为22℃的具有不同流速(27l/min和20l/min)的CO₂气体。

噬菌体和大肠杆菌活力的计数通过噬菌斑测定法进行[23,34,35]。

一旦制备了具有已知浓度的大肠杆菌噬菌体和大肠杆菌的溶液，就进行实验以研究在不同气体和进气温度灭活大肠杆菌噬菌体的过程。对于病毒实验，在36分钟内每6分钟从烧结中心区域上方10到15mm处收集1.3ml样品，对于大肠杆菌实验，每2min收集1.3ml样品。按照双层噬斑测定技术[36]，一式三份地点样0.07ml的每种样品。

为了评估溶液pH值对MS2噬菌体灭活和大肠杆菌实验的影响，使用pH为4.1的0.17M NaCl溶液在另一个烧杯中在水浴中进行了对比测试。在这些实验中，定期从烧杯中取出样品，并像以前一样进行分析。

数据分析

对每个实验的所有18-21个板进行噬斑计数。每个一式三份样品的平均值和标准偏差使用病毒或细菌存活因子：Log₁₀(PFU/PFU₀)，其中PFU₀是每个样品的PFU初始数量，PFU是暴露时间(以min为单位)后每个样品的PFU。绘制时，应用了二阶多项式分布来拟合生存曲线[21]。

结果与讨论

图4中显示了一些常见结果，该图显示了在BCE中，在200℃的CO₂进入温度处理(a)0，(b)0.75，(c)2.25和(d)3min后在NaCl 0.17M水溶液中MS2病毒灭活的双层噬斑测定技术中使用的培养皿的照片。使用仅0.02kJ/ml的总热量输入(在实验结束时溶液温度为46.5℃)，仅3.5min即可实现每个样品295PFU/板的完全灭活。

1.在水溶液中鼓泡CO2时，pH对病毒和细菌灭活的影响

当在鼓泡塔中使用CO₂气体时，水的pH值在不到45秒的时间内从5.9下降到4.2。

当CO₂溶解在水中时，有99％保留为溶解的分子气体，而少于1％成为碳酸(H₂CO₃)。这将水的pH值降低到大约4(等式2)。碳酸分解成碳酸氢根离子和碳酸根离子(参见等式3和4)[37]。

CO₂(g)→CO₂(aq) (1)

为了确定由于溶解的二氧化碳(等式1、2、3和4)导致的pH降低是否与其消毒效果有关，在连续搅拌的烧杯中进行了两次pH为4.2的碳酸(H₂CO₃)实验，其中一次用于病毒，另一次用于细菌。

通过鼓泡27l/min产生碳酸(H₂CO₃)。在22℃10min内，通过0.17M NaCl溶液注入纯二氧化碳。鼓泡后，将溶液在烧杯中连续搅拌，每3min取样一次，pH为4.2，并观察到对数病毒减少仅为0.002。对于大肠杆菌，仅观察到0.08对数的去除，这表明低pH值对大肠杆菌具有轻微的灭活作用，而对病毒没有作用。一些作者描述了对微生物细胞的小的，低pH灭活作用，因为膜阻止了质子的渗透，但是由于膜的磷脂双层的化学修饰，低pH使膜对其他物质如CO₂更具渗透性[38,39]。Cheng等[14]观察到，对于3种不同的病毒(MS2，Qβ和φX174)在不同pH条件(pH 4、4.5、5和5.5)下，灭活几乎没有变化。他们认为H⁺不能像CO₂分子那样容易地进入衣壳。

因此，当将CO₂鼓泡进入BCE时，认为pH值降低与观察到的高病毒和细菌灭活作用无关。

2.不同气体对病毒和细菌灭活的影响

在这些实验中，MS2病毒(ATCC 15597-B1)和大肠杆菌(ATCC 15597)的失活率在鼓泡塔蒸发器中以200℃(对于病毒)和150℃(对于大肠杆菌)鼓泡进气通过0.17M NaCl溶液时确定。对空气中存在的不同气体(氮气，氧气，CO₂和氩气)进行了相同的实验。99％的空气是氮气和氧气的混合物，另外1％的气体包含氩气和CO₂(还有其他气体)。

最后，用来自发生器的燃烧气体在大约60℃的温度灭活最初的MS2病毒和后来的大肠杆菌(MS2病毒实验中的燃烧气体温度为60℃，在大肠杆菌实验中为58℃)。

这些实验的结果如图5和6所示。

发现在200℃的气体中MS2病毒的灭活率非常相似，除外CO₂和燃烧气体。当使用150℃的气体灭活大肠杆菌时，氧气产生的灭活率最高，其次是CO₂和燃烧气体。

在先前的研究[32][17]中，当将CO₂,Ar,N₂和空气通过水鼓泡时，由于CO₂在水中可溶，其在气泡pH值的变化和zeta电势方面与其余气体不同。

Enomoto等[17]发现，当使用***性分解系统时，与使用不易溶于水的其他气体(如Ar或N₂)相比，在水中高度溶解的气体(如CO₂和N₂O)可实现更高的啤酒酵母灭活率。Tabor等[32]证明，CO₂防止气泡聚结的效果比其他气体好得多。气泡聚结抑制是BCE性能中非常重要的变量，因为它会增加气/水界面面积，这就是为什么所有实验均在0.17M NaCl溶液中进行的原因[4]，以确保所有气体对塔溶液中气泡聚结的抑制程度相似。

与这些实验中使用的其他气体相比，二氧化碳具有较高的水溶性，可产生较低的大肠菌和病毒Zeta电位，并降低pH值(参见表1)。

从文献值(http://www.engineeringtoolbox.com)获得所用不同气体在52℃(对于病毒)和43℃(对于大肠杆菌)的溶解度。在实验期间测量pH值并在实验期间测量Zeta电位值，病毒浓度为每ml 10⁸，大肠杆菌浓度为每ml 10⁷。

＊对于大肠杆菌，气体在43℃在水中的溶解度，以及对于病毒，气体在52℃在水中的溶解度。在1atm溶解在1Kg水中的气体的克数

表1：在对病毒和细菌的研究中的气体的溶解度、微生物Zeta电位、pH、热容量、实验结束时的水温、气泡周围加热层的厚度以及该层的平均温度。

表1中的“水温”是实验结束时的水溶液温度(对于大肠杆菌实验，对于所有气体这是指在10min后；对于病毒实验，则对于除二氧化碳气体和燃烧气体以外的所有气体在37.5min后而对于二氧化碳气体和燃烧气体在4min后)。对于所有实验，除了使用二氧化碳气体或燃烧气体的病毒实验外，实验结束时的温度均为平衡溶液温度(即，当进一步的气泡通过所述溶液时，温度保持恒定与该温度)。在这些实验中，所述水溶液通常在约5min后达到平衡溶液温度。表1中报告的气泡周围的加热层的平均温度是根据表1中报告的水温按以下方法计算的。

在表1(病毒部分)中，根据其热容量，在实验结束时，CO₂的温度仅比稳态条件下的预期温度低，仅有46.5℃。这是因为只采用4min后水的平均温度，是因为这是使用CO₂实现病毒完全灭活所需要的时间。对于氧气，氮气，氩气和空气，使用37.5min后的平均温度，因为这是实现1.5log病毒灭活所需要的时间。对于细菌，在10min后获得平均温度，这是实现平均1.5log的大肠杆菌灭活所需的时间。

对于进气温度超过100℃时，可以使用以下公式(5)，(6)和(7)粗略估算直径1mm气泡表面周围的热水层的温度和厚度。

直径为1mm的气泡表面周围的热水层的温度可以通过以下公式粗略估算：

其中T_l(以℃为单位)是气泡周围的热水层的平均(瞬态)温度，而T_c(℃)是BCE中溶液的温度，假定热气泡从进气温度冷却到100℃。

可以通过平衡由冷却气泡提供的热量与将膜升高到该平均温度所需的热量来估计平衡瞬态加热层的厚度。

因此，膜的体积V由下式给出：

V＝4πr²z (6)

其中V是r>>z时气泡周围厚度z的层的体积。

因此，热能平衡通过下式给出：

C_pΔTV＝C_水Δt4πr²ρ_wz (7)

其中C_p，C_水分别是气体和水的热容，ρ_w是液态水的质量密度，ΔT是气泡的冷却，Δt是水层中的瞬态温度升高。

在实践中，我们可能期望冷却气泡提供的热量的大约一半将用于将水蒸发到CO₂气泡中，因此计算得出的粗略估计的膜厚将减半。

表1给出了该计算的常见结果。

3.在200℃下用不同气体灭活MS2病毒

热灭活机理

当气体进入温度为200℃时，上升的热气泡周围的瞬态热层与MS2病毒之间的碰撞会使病毒灭活。MS2病毒在高于60℃的温度会迅速失活[21，40]，因此，如果气泡周围的热层温度高于60℃，则热气泡将有效地灭活病毒。先前已证明(Garrido等人[7])，MS2病毒可以在BCE中的碰撞期间通过与150℃的热气泡进行热交换而灭活。这种机制似乎与病毒和气泡在碰撞时接近的程度有关。在较早的实验中，测试了MS2病毒存活因子，并将其与病毒和气泡之间的相互作用表面力相关联。报道的结果表明，在150℃时添加的电解质可以控制病毒与气泡热表面之间的表面力，从而影响失活率。

使用BCE方法比较了几种不同气体在200℃和燃烧气体在60℃的MS2病毒存活因子，并且结果如图5所示。进气温度为200℃的空气，氧气，氮气和氩气被发现具有非常相似的病毒灭活率，处理37.5分钟后降低1.33和1.67-log。当烧结炉表面形成热气泡时，会在气泡表面周围短暂地形成一薄层的热水，且该薄层具有相似的平均温度，范围为73℃至76.9℃，并且对于这四种气体的厚度值约为55至91nm(参见表1)。不受理论的束缚，据信围绕上升的热气泡的瞬态热层与MS2病毒之间的碰撞是这4种气体使病毒失活的基本机制。

CO₂灭活机理

相比之下，当分别使用200℃和60℃的CO₂(100％CO₂)和燃烧气体(根据教科书“燃烧基础知识”第2章[41]，CO₂为12.5％至14％)时，在实验中，病毒与热的CO₂气泡周围的热水层之间的碰撞似乎并不是导致病毒快速失活的唯一机制，在这些研究中观察到的结果是，在短短3.5min内，利用燃烧气体的失活率为2.2log，利用纯CO₂的失活率为2.7log(见图4和5)。

当使用燃烧气体时，由于燃料中的微量成分和杂质以及不同的燃料/空气比，可能会存在除CO₂，H₂O和N₂之外的其他燃烧产物。这些气体通常包括：一氧化碳(CO)，氢气(H₂)，氧化硫(SO₂)和一氮氧化物(NOx)，如NO和NO₂[41]。这些气体的少量存在可以解释当使用200℃的纯CO₂且使用仅在60℃的进入温度的燃烧气体时获得的类似结果。例如，Richard F.等人[42]研究了SO₂的病毒灭活特性及其在水中的高溶解度。

Francis等人[43]研究了在BCE中使用不同盐水溶液的汽化潜热，并估计了干燥氮气进气温度为60℃，平衡温度为22℃。然而，燃烧气体被水饱和，且因此不使用热量将水蒸气蒸发成气泡。这解释了为什么当燃烧气体的进气温度仅为60℃时，水的平衡温度仍保持在高温39.5℃而不是22℃，如果将气体干燥的话。因此，如果不使用热气泡中的大量热量来蒸发水，则60℃的进气温度还可以通过提高水溶液的整体温度来使病毒失活。

当CO₂气体鼓泡通过烧结区时，会连续产生较大的CO₂液体接触表面。即使在鼓泡塔中压力保持在1atm左右，这也会增加溶解在溶液中的CO₂量，从而产生与在密相二氧化碳(DPCD)工艺中提高压力可以实现的效果类似的效果。许多作者已经证明，使用加压的CO₂可以灭活微生物[14-16]。解释这种失活作用的机理与其在水中的高溶解度有关。

Cheng等[14]提出了一种基于噬菌体MS2和Qβ的灭活机理，其基于高压下衣壳内CO2的渗透以及减压后的膨胀，从而破坏了衣壳。CO₂-蛋白结合也可能破坏使病毒灭活的衣壳。

4.大肠杆菌(ATCC 15597)用150℃的气体灭活的结果

热灭活机理

当在BCE中在进入温度为150℃的条件下用空气和氮气灭活大肠杆菌(ATCC15597)时，与Shahid等人[9]报道的大肠杆菌灭活结果相似(图6)，其中使用天然湖水样本。围绕上升的气泡的瞬态热层之间的碰撞以及热气泡本身与大肠菌的碰撞被认为是大肠菌灭活的基本机制[8]。在使用高温气体N₂，Ar和空气时，当前工作中的基本大肠菌灭活机理也采用了上述推定。但是，如本文报道的结果所示，当使用CO₂或燃烧气体时，这不是唯一的大肠菌灭活机制。

通过在10min的时间段中鼓泡，比较以下情况中大肠杆菌的存活因子：进入温度为150℃的空气、氧气、氮气、CO₂和氩气，进入温度为58℃的燃烧气体以及进入温度为20℃的氧气和空气，并且结果如图6所示。在150℃，处理10min后，空气和氮气的大肠杆菌灭活率非常相似，分别降低了1.43和1.74–log。在20℃的空气中未检测到灭活，仅减少了0.03log。氩气的失活速率较低，在10min后仅降低0.40log，这可能是由于其低的热容(仅为0.52kJ/kgK)，仅为氮气和空气的热容的一半(表1)。对于这3种气体，当热气泡在烧结体表面形成时，会在气泡表面周围形成薄的热水层，并且该薄层的平均温度相似，值的范围为69.3℃至72.4℃(表1)。大肠杆菌在高于60℃的温度会迅速失活[29]，因此，如果气泡周围的热层温度高于60℃，热气泡将有效地使大肠杆菌失活，因此则当鼓泡20℃的空气时，没有观察到大肠杆菌灭活(减少0.03log)，这支持了热碰撞假说并建立了基线。

CO2灭活机理

分别在150℃和58℃使用二氧化碳(100％的CO₂)和燃烧气体(根据教科书“燃烧基础知识”第2章[41]的12.5％至14％的CO₂)，肠杆菌和热的CO₂气泡之间的碰撞大似乎不是解释较高灭活率的唯一机制，所述的较高灭活率为在10min后对于燃烧气体为2.63log且对于纯CO₂为2.84log(见图6)。

已经提出了不同的机理来解释溶解的二氧化碳的抗菌作用。在《致密相二氧化碳》[38]一书的第4章中，Osman详细介绍了加压二氧化碳的细菌灭活机理的不同步骤。当加压CO₂首先溶解到溶液中时，其pH降低。溶液的这种酸化增加了CO₂通过细胞膜的渗透。然后，细胞内部的二氧化碳会导致细胞内pH下降，从而超过细胞的缓冲能力，从而导致细胞失活[38,39]。但是，碳酸氢根离子也可能与脂质头基结合，从而改变其水合度和头基曲率、孔结构，进而改变其存活力。

当使用燃烧气体时，由于燃料中的微量成分和杂质以及不同的燃料/空气比，可能会存在除CO₂，H₂O和N₂之外的其他燃烧产物。这些气体通常为：一氧化碳(CO)，氢气(H₂)，氧化硫(SO₂)和一氮氧化物(NOx)，如NO和NO₂[41]。这些气体的少量存在也可能导致细菌失活。

氧化/燃烧机理

在BCE中，使用含有大肠杆菌的0.17M NaCl溶液在150℃时产生的热氧气气泡产生了最佳的灭活效果，仅3.5min后，降低了2.90log(图6)。纯热氧可以通过直接接触或通过150℃产生的活性氧种类来氧化和燃烧大肠杆菌。众所周知，H₂O₂的氧化特性可以使大肠杆菌失活，并且这种灭活效果随着H₂O₂浓度的增加而增加[43]。蛋白质，脂质和核酸也可以被呼吸过程中O₂的不完全还原而被活性氧种类所氧化[44]。大肠杆菌呈直径1.1-1.5μm，长度2.0-6.0μm的直圆柱杆状[24]。与气泡的大小1-3mm相比，并且因此这些细胞可以轻松穿透氧气气泡周围的薄热水层(表1)并直接接触热氧气。

相比之下，发现使用热氧气(在150℃)作为进样气体对大肠杆菌所获得的结果要比对MS2病毒(进入温度为200℃)的结果要有效得多，所述MS2病毒具有为13nm的小得多的流体力学半径约[22]。因此，在150℃的进入温度使用氧气时，氧气在水中的较低溶解度(表1)、病毒的灭活时间(37min)相比于大肠杆菌(10min)以及大肠杆菌的0.65log减少量(图6)，支持通过与气相直接接触来进行大肠杆菌氧化/燃烧的假说，这种情况在小得多的病毒中不太可能发生。

5.大肠杆菌和病毒的热灭活机理的比较

世界卫生组织(WHO)在其饮用水水质准则中[40]比较了热液体中不同类型细菌和病毒的热灭活率。他们得出的结论是，高于60℃的温度可以有效地灭活病毒和细菌。当温度范围介于60℃和65℃之间时，细菌灭活比病毒灭活快。这些研究表明，在60℃的水温，大肠杆菌需要300秒才能达到1.5log的降低，而肠病毒，埃可病毒6，柯萨奇病毒B4，柯萨奇B5的病毒要达到4log的降低需要1800秒[40]。

在我们的实验中，当在150℃的氮气或空气中起泡时，大肠杆菌在10min内达到1.5log失活(图6)(其中10分钟中溶液温度对于氮气为43℃，对于空气为45℃)，并且MS2病毒在200℃的空气、氧气或氮气中大约15至37min后达到1至1.5log失活(37.5分钟中的溶液温度对于空气为52℃，对于氧气为50℃，对于氮气为54℃)(图5)。但是，当鼓泡150℃的CO₂或58℃的燃烧气体时，大肠杆菌在10min内达到2.6log失活(图6)(其中，10分钟中溶液温度对于CO₂为43℃，对于燃烧气体为40℃)，并且利用200℃的CO₂或60℃的燃烧气体的MS2病毒在5分钟内达到2.0log失活(4分钟的溶解温度对于CO₂为47℃，对于燃烧气体为30℃)(图5)。建议在该方法中使用进入温度超过约100℃的气体，当病毒和细菌与加热的气泡(无论是气泡周围的热水层或气泡内部的热气)碰撞时，病毒和细菌会被灭活。这些结果与WHO的数据相一致，即在相似的水温下，细菌的灭活速度要比病毒快。但是，当利用具有包含按体积计至少10％CO₂的气体的BCE时，这种现象会大大且令人惊讶地得到增强。

6.CO₂气泡温度对病毒灭活的影响

使用图1所示的设备，使用进入温度为205℃，150℃，100℃，11℃或20℃的CO₂气体进行了进一步的实验。结果显示在图7中。在该过程开始时，水溶液的温度约为室温(约22℃)，图7中报告的溶液温度是在实验结束时使用的相关气体的温度(例如，对于进入温度为100℃的CO₂，经过6分钟后，所述水溶液的整体温度为34℃)。

对于进入温度为100℃或更高的气体，当在烧结体表面上形成热气泡时，会在气泡表面周围形成一薄层的热水。这种薄而短暂的层的厚度和温度可能是病毒灭活的重要参数。不希望受到理论的束缚，据信这些热气泡和大肠菌之间的碰撞能够使大肠菌灭活。进一步认为，当病毒在热水层内与气泡表面足够接近时，类似的机制对于灭活病毒也是有效的。

当在室温产生CO₂气泡时，仅在10分钟内即可减少1log病毒(图7和8)。在较高的进入温度，病毒灭活也增加，在150℃的进入CO₂温度7分钟后减少2.3log，在200℃3分钟后降低3log(图7)。

Isenschmid等，1995[45]认为在溶液温度超过18℃时，溶解的压缩CO₂浓度是细胞死亡的关键参数。这可以解释为什么在9℃的CO₂塔温6.5分钟后、进入温度为11℃的情况下，只有0.1对数降低才没有明显的CO₂灭活效果(图7)。如果溶液温度升高超过18℃，无论在气泡周围的一层还是溶液的整体温度，则CO₂通过衣壳的渗透率会增加，从而导致CO₂对MS2病毒灭活的影响。在CO₂气体进入温度超过约100℃时，病毒的灭活显然是由这种CO₂灭活作用和病毒与热气泡碰撞的热作用的组合引起的。

7.使用CO2时气体流速对病毒灭活的影响

图8比较了在22min内使用2种不同的CO₂流速运行10分钟时对病毒灭活的影响。从这些结果可以清楚地看出，尽管最初27l/min的CO₂气体灭活病毒比使用20l/min更有效，但2分钟后的灭活速度几乎翻了一番，减少了0.35log和0.62log，在接近10分钟时，两种灭活速率几乎相同，减少了约1log。

结论

在大气压力下使得包含按体积计至少10％CO₂的气体通过水性液体鼓泡，可用于有效灭活常见水生病原体(包括病毒和细菌)，取决于进气温度其似乎可以通过两种不同的机制。

热失活机制基于碰撞期间热气泡和病原体之间的热传递。当气体温度超过约100℃时，认为该机理是有效的。

利用包含按体积计至少10％CO₂的气体，第二种灭活机制似乎开始起作用，该机制似乎是基于二氧化碳分子通过细菌膜和病毒衣壳的渗透。鼓泡包含按体积计至少10％CO₂的气体会在大气压下产生高密度的CO₂气体，可有效地灭活水中的病毒和细菌，而如空气、氮气和氩气等其他气体只会产生有限的灭活效果。发现由于二氧化碳鼓泡而导致的pH降低与使用二氧化碳鼓泡获得的高病毒和细菌灭活作用无关。似乎包含按体积计至少10％CO₂的气体气泡通过水溶液会产生较高的液-气界面面积，并且由于CO₂在水中的溶解度较高，因此在病毒和细菌灭活中起重要作用。当气体温度为18℃或更高时，此机制有效。

应当理解，如果在本文中引用了任何现有技术出版物，则该引用并不意味着承认该出版物在澳大利亚或任何其他国家构成了本领域公知常识的一部分。

在所附权利要求和本发明的先前描述中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另外需要，否则词语“包括”或诸如“包括”或“包含”的变体以包括性含义使用，即，在本发明的各种实施方案中，指定所陈述的特征的存在但不排除其他特征的存在或增加。

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