具有增强的蛋白质表达的因子vⅲ突变体表达载体
阅读说明:本技术 具有增强的蛋白质表达的因子vⅲ突变体表达载体 (Factor VIII mutant expression vectors with enhanced protein expression ) 是由 胡成炫 朴秀振 于 2018-12-05 设计创作,主要内容包括:本公开涉及携带编码凝血因子VIII突变体的多核苷酸并增加蛋白质表达的表达载体,以及包含该表达载体的用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物。本公开的因子VIII突变体是通过在因子VIII中缺失一部分B结构域(残基784至1667)和一部分a3区域(残基1668至1671)而得到的,其结果是携带编码因子VIII突变体的多核苷酸的表达载体的蛋白质表达能力显著增加。(The present disclosure relates to an expression vector carrying a polynucleotide encoding a factor VIII mutant and increasing protein expression, and a pharmaceutical composition for preventing or treating a bleeding disease or bleeding comprising the expression vector. The factor VIII mutants of the present disclosure were obtained by deleting a portion of the B domain (residues 784 to 1667) and a portion of the a3 region (residues 1668 to 1671) in factor VIII, which resulted in a significant increase in protein expression capacity of expression vectors carrying polynucleotides encoding the factor VIII mutants.)
技术领域
本公开涉及一种表达载体,其包含编码凝血因子VIII突变体的多核苷酸并具有增加的蛋白质表达,以及包含该表达载体的用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物。
背景技术
血友病A(HA)是一种严重的遗传疾病。血友病是一种与X染色体上的基因有关的疾病,每5000名男性中有1名出现血友病。它是由血浆糖蛋白因子VIII(FVIII)的变化引起的,该因子是血液凝固过程中的重要组成部分。因子VIII(以下称为FVIII)编码2351个氨基酸,并具有六个结构域(A1-A2-B-A3-C1-C2)。异二聚体由包含A1、A2和B结构域的重链和包含A3、C1和C2结构域的轻链形成。
在1980年代之前,血友病患者接受从他人血浆中提取的因子VIII用于治疗。但是,该方法存在严重的问题,例如病毒感染。自1980年代以来,为了解决该问题,一直使用通过重组蛋白技术在CHO细胞等中产生的全长因子VIII。后来,众所周知,B结构域缺失的因子VIII(F8-BDD)能够以高蛋白生产率生产而没有活性差异,这种基于双链F8-BDD的重组蛋白(分别表达重链和轻链)已被开发和使用。与双链F8-BDD相比,由于其优异的体内稳定性,最近开发的截短的单链F8-BDD重组蛋白被证明显示出AUC增加2倍至4倍。
尽管因子VIII重组蛋白显示出优异的治疗效果,但为了防止血友病患者内部出血,它在体内的浓度应始终保持在5%或高于5%。为此,应每天或每周2次至3次施用蛋白质。为了克服该缺点,在2000年代早期开发了基于重组病毒的基因治疗剂。基于重组病毒的基因治疗剂使用大小小于4.4kb的B结构域缺失的因子VIII(以下称为“F8-BDD”),而不是大小为7kb或大于7kb的全长因子VIII。特别地,大多数治疗剂使用单链F8-BDD基因而不是双链F8-BDD基因。
本公开的发明人已努力开发具有进一步改善的稳定性的因子VIII基因治疗剂。为此,开发了与单链F8-BDD基因相比在真核细胞中表现出改善的稳定性和增加的蛋白质表达的单链F8-BDD突变体,以及表达该突变体的表达载体。此外,已经确定,通过使用内源性启动子,例如延伸因子-1α(EF-1α)和密码子优化(CO)单链F8-BDD突变体可以进一步改善表达和稳定性,并完成了本公开。
[相关技术的参考]
[专利文件]
(专利文件001)KR 10-1542752 B。
公开
技术问题
本公开涉及提供具有增加的蛋白质表达的因子VIII突变体表达载体。
本公开还涉及提供用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物,其包含表达载体。
技术方案
本公开提供了包含编码因子VIII突变体的单链多核苷酸的因子VIII突变体表达载体,其中氨基酸Asp784至Arg1671从由SEQ ID NO 1表示的因子VIII中缺失。
在本公开的示例性实施方案中,因子VIII突变体可以具有由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列。
在本公开的示例性实施方案中,载体可以选自pCDNA3.1、pGP和pEF。
在本公开的示例性实施方案中,与包含编码由SEQ ID NO 1表示的因子VIII、B-结构域缺失的因子VIII或单链因子VIII的多核苷酸的表达载体相比,表达载体可以具有增加的蛋白质表达。
另外,本公开提供了用于表达因子VIII突变体的表达系统,其包括表达载体。
另外,本公开提供了用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物,其包含表达载体。
在本公开的示例性实施方案中,出血性疾病可以是血友病A或血友病B,血友病A是由针对因子VIII或因子VIIIa的抑制性抗体引起或并发的血友病。
在本公开的示例性实施方案中,出血性疾病可以选自新生儿凝血病、重度肝病、血小板减少症、因子V、VII、X或XI的先天性缺乏和具有针对血管性假血友病因子的抑制剂的血管性血友病。
在本公开的示例性实施方案中,出血可以由与高风险外科手术相关的失血、创伤性失血、骨髓移植或脑出血引起。
在本公开的示例性实施方案中,药物组合物可以用于基因治疗。
有益效果
包含编码本公开的因子VIII突变体的多核苷酸的表达载体缺失了因子VIII的B结构域的一部分(残基784至1667)和a3区域的一部分(残基1668至1671),其具有显著的蛋白质表达增加。
具体实施方式
图1示意性地示出了根据本公开的示例性实施方案的设计因子VIII突变体的过程。
图2显示了pCDNA3.1载体的酶切割图。
图3显示了pGP载体的酶切割图。
图4显示了pEF载体的酶切割图。
图5显示了使用从制备实施例1的pCDNA3.1质粒转染的细胞中获得的样品测量蛋白表达水平的结果。
图6显示了使用从制备实施例1的pCDNA3.1质粒转染的细胞中获得的样品测量凝血活性的结果。
图7显示了使用从制备实施例2的pGP质粒转染的细胞中获得的样品测量蛋白质表达水平的结果。
图8显示了使用从制备实施例3的pEP质粒转染的细胞中获得的样品测量蛋白质表达水平的结果。
最佳实施方式
在下文中,详细描述本公开。
在一个方面,本公开提供了包含编码因子VIII突变体的单链多核苷酸的因子VIII突变体表达载体,其中氨基酸Asp784至Arg1671从由SEQ ID NO 1表示的因子VIII中缺失。
因子VIII突变体
在本说明书中,术语“凝血因子VIII”、“因子VIII”、“FVIII”和“F8”可互换使用。成熟的人类因子VIII由2351个氨基酸(包括信号肽)组成,并具有以下结构域:
信号肽:残基1至19,
A1:残基20至355,
A2:残基392至729,
B:残基760至1667,
A3:残基1709至2038,
C1:残基2039至2191和
C2:残基2192至2351。
另外,存在三个酸性结构域a1(356至391)、a2(730至759)和a3(1668至1708)。已知酸性结构域a3参与因子VIII分子与血管性假血友病因子(vWF)的结合,vWF在血液凝固中起重要作用。在分泌过程中,因子VIII在B结构域和a3酸性结构域之间裂解,产生异二聚体多肽。因子VIII异二聚体由大小可变的轻链(包括A3、C1和C2)和重链(包括A1、A2和B)组成。由于B结构域内有限的蛋白水解,重链是异源的。在异二聚体B结构域缺失的因子VIII的情况下,“重链”包括A1和A2,但是缺少部分或全部B结构域。
成熟的野生型人凝血因子VIII的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1。特定序列中氨基酸位置的参考编号是指相应氨基酸在野生型FVIII蛋白质中的位置,并且不排除在序列的其他位置存在突变(缺失、***和/或置换)。编码SEQ ID NO 1的DNA序列是SEQ ID NO 2。
“凝血因子VIII”不仅包括野生型凝血因子VIII,而且包括具有野生型凝血因子VIII的促凝血活性的野生型凝血因子VIII的衍生物。与野生型因子VIII的氨基酸序列相比,该衍生物可以具有缺失、***和/或添加。优选的衍生物是已缺失了全部或部分B结构域的FVIII分子。本说明书全文中指出的氨基酸位置总是指(包含信号肽切割的)成熟的全长野生型因子VIII中各个氨基酸的位置。
在本说明书中,术语“突变体”包括保守或非保守的置换,氨基酸序列、核酸序列的***或缺失等。这种变化基本上不改变赋予FVIII的生物学活性的活性位点或活性结构域。
根据本公开的因子VIII突变体是其中使氨基酸Asp784至Arg1671从由SEQ ID NO1表示的因子VIII中缺失的突变体。该突变体是单链因子VIII突变体。因子VIII突变体是其中一部分B结构域(残基784至1667)和一部分a3区域(残基1668至1671)缺失的突变体,与因子VIII、B结构域缺失的因子VIII和单链因子VIII相比,该突变体具有增强的蛋白质表达以及改善的凝血活性和稳定性。因子VIII突变体具有由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列。
“单链因子VIII”是指因子VIII分子,其在表达因子VIII分子的细胞分泌过程中以单条多肽链的形式存在而未被切割成两条链(例如,重链和轻链)。
多核苷酸
本公开还涉及编码具有由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列的因子VIII突变体的多核苷酸。
在本说明书中,术语“多核苷酸”是指可以是未修饰的RNA或DNA,或经修饰的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸。本公开的多核苷酸可以是单链DNA或RNA。本说明书中使用的术语“多核苷酸”包括含有经修饰的碱基和/或不常见的碱基例如肌苷的DNA或RNA。显然,可以对DNA或RNA进行提供已知有用目的的各种修饰。本说明书中使用的术语“多核苷酸”还包括化学修饰、酶修饰或代谢修饰的多核苷酸。
本领域技术人员将理解,由于遗传密码的简并性,因子VIII突变体可由几种多核苷酸编码。也就是说,应理解,可以在本公开中使用的编码因子VIII突变体的多核苷酸序列还包括与由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列基本上具有同一性的核苷酸序列。
具体地,本公开的多核苷酸可以是分离的多核苷酸。“分离的”多核苷酸是指基本上不含其他核酸序列,例如染色体和染色体外DNA和RNA的多核苷酸,但不限于此。分离的多核苷酸可以从宿主细胞中纯化。可以使用本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法来获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
用于表达因子VIII突变体的表达系统
表达载体
在另一方面,本公开提供了表达载体,其包含编码因子VIII突变体的单链多核苷酸(下文称为“因子VIII突变体表达载体”)。
在本说明书中,术语“表达”是指细胞中因子VIII突变体的产生。
在本说明书中,术语“表达载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达因子VIII突变体的载体,并且是指含有必需调控元件的基因构建体,基因***物以待表达的方式与必需调控元件可操作地连接。
在本说明书中,术语“可操作地连接”是指在核酸表达控制序列和编码执行总体功能的因子VIII突变体的多核苷酸之间的功能性连接。例如,启动子可与编码因子VIII突变体的多核苷酸可操作地连接以影响多核苷酸的表达。与重组载体的可操作连接可以使用本领域众所周知的基因重组技术来实现。对于位点特异性DNA切割和连接,可以使用本领域通常已知的酶。
尽管不限于此,本公开的表达载体是使用质粒、载体或病毒载体构建的。合适的表达载体可以包括调控元件,例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸信号和增强子,并且可以根据预期用途以各种方式制备。载体的启动子可以是组成型的或可诱导的。
具体而言,表达载体可以通过使用选自pCDNA3.1、pGP和pEF的载体来制备。具体地,与编码由SEQ ID NO 1表示的因子VIII、B-结构域缺失的因子VIII或单链因子VIII的多核苷酸相比,因子VIII突变体表达载体具有显著增加的蛋白表达。特别地,证实了通过使用内源性启动子例如EF1a启动子等和通过密码子优化(CO)单链F8-BDD突变体可以进一步改善蛋白质表达和稳定性。
为了在宿主细胞中高水平产生因子VIII突变体,重组表达载体中必须有适当的调控元件,以及组装的经修饰的cDNA,重组表达载体可以根据本领域技术人员已知的方法在各种表达系统中增殖。有效的转录控制元件可以源自具有动物细胞作为天然宿主的病毒或源自动物细胞的染色体DNA。具体而言,可以使用源自猿猴病毒40、腺病毒、BK多瘤病毒、人巨细胞病毒或Rous肉瘤病毒的长末端重复序列的启动子-增强子组合,或在动物细胞中包含强组成型转录基因的启动子-增强子组合,例如β-肌动蛋白或GRP78。为了获得稳定、高水平的从cDNA转录的mRNA,转录单元应在其3′-近端部分包含编码转录终止多聚腺苷酸序列的DNA区域。具体而言,该序列衍生自猿猴病毒40早期转录区、兔β-珠蛋白基因或人组织纤溶酶原激活物基因。
因子VIII突变体的表达
表达载体可以被转染到合适的宿主细胞中,并且因此可以导致本公开的因子VIII突变体的表达和功能性蛋白质的产生。
在另一方面,本公开提供了包含多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
本公开的宿主细胞可以用于产生本公开的因子VIII突变体的方法中。该方法可以包括:(a)在可以表达因子VIII突变体的条件下培养宿主细胞的步骤;和(b)从宿主细胞或培养基中回收因子VIII突变体的步骤。
具体地,为了表达因子VIII突变体,将核苷酸如cDNA掺入合适宿主细胞的基因组中。具体而言,宿主细胞应为脊椎动物来源的动物细胞,以确保正确的折叠、二硫键形成、天冬酰胺连接的糖基化和其他翻译后修饰,并确保分泌到培养基中。其他翻译后修饰的实例包括酪氨酸的O-硫酸化和新生多肽链的蛋白水解加工。可以使用的细胞的实例包括猴COS细胞、小鼠L细胞、小鼠C127细胞、仓鼠BHK-21细胞、人胚肾293细胞和仓鼠CHO细胞。
可以以不同方式将编码相应cDNA的重组表达载体引入动物细胞。例如,重组表达载体可以从基于病毒的载体构建。实例包括基于杆状病毒、牛痘病毒和腺病毒,特别是牛***瘤病毒的载体。
也可以将编码相应DNA的转录单位与另一个重组基因一起引入动物细胞,该重组基因可以在细胞中起优势选择标记的作用,以便于分离整合到基因组中重组DNA的特定细胞克隆。优势选择标记基因的实例包括赋予对遗传霉素(G418)抗性的Tn5氨基糖苷磷酸转移酶、赋予对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶和赋予对嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素乙酰转移酶。编码这种选择标记的重组表达载体可以与编码所需蛋白质的cDNA的载体存在于同一载体上,或者可以编码在单独的载体上,该载体被同时引入并整合到宿主细胞的基因组中,这通常导致不同转录单位之间的强物理连接。
可以与所需蛋白质的cDNA结合使用的其他类型的选择标记基因是基于编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的各种转录单位。将这种类型的基因引入缺乏内源性DHFR活性的细胞,通常为CHO细胞(DUKX-B11、DG-44)后,将使细胞能够在缺乏核苷的培养基中生长。例如,培养基可以是不含次黄嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham′s F12。可以将DHFR基因与因子VIII cDNA转录单位一起引入CHO细胞,并在同一载体或不同载体上连接,从而生成产生重组蛋白的DHFR阳性细胞。
如果细胞在细胞毒性DHFR抑制剂甲氨蝶呤的存在下增殖,则会产生对甲氨蝶呤有抗性的新细胞。由于连接到DHFR的转录单位的数量增加,这些细胞可以更快速地产生重组蛋白。当这些细胞增殖并同时增加甲氨蝶呤的浓度(从1nM至10000nM)时,可以非常快速地获得产生所需蛋白质的新细胞。
可以通过悬浮培养或在各种固体载体上大规模增殖产生所需蛋白质的细胞。载体的实例包括基于葡聚糖或胶原蛋白基质的微载体,或中空纤维或各种陶瓷材料形式的固体载体。当通过悬浮培养或在微载体上增殖时,可以通过浴培养或灌注培养进行细胞培养,从而在更长的时间内连续产生条件培养基。因此,根据本发明,上述细胞非常适合于开发用于生产所需重组突变蛋白质的工业方法。
药物组合物
另外,本公开提供了用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物,其包含如上所述的表达载体。
出血性疾病可以是血友病A或血友病B,血友病A是由针对因子VIII或因子VIIIa的抑制性抗体引起或并发的血友病。另外,出血性疾病可以选自新生儿凝血病、重度肝病、血小板减少症,因子V、VII、X或XI的先天性缺乏和具有针对血管性假血友病因子的抑制剂的血管性血友病。
并且,出血可以由与高风险外科手术相关的失血、创伤性失血、骨髓移植或脑出血引起。
本公开的药物组合物可以用于基因治疗。
因子VIII突变体的纯化
从上述细胞分泌并在上述细胞的培养物中积累的因子VIII突变体可以通过各种生化和色谱方法,包括利用所需蛋白质和在细胞培养基中其他物质的大小、电荷、疏水性、溶解性、比亲和力等的差异的方法来浓缩和纯化。
具体地,可以将本公开的因子VIII突变体纯化至80%或高于80%,更具体地95%或高于95%的纯度。特别地,期望突变体处于药学上纯的状态,相对于污染大分子,特别是其他蛋白质和核酸,其纯度高于99.9%,并且没有感染物质和热原。具体地,本公开的分离或纯化的突变体基本上不含其他无关的多肽。
作为这种纯化的一个实例,在将因子VIII突变体吸附到固体载体上之后,进行洗涤和解吸,然后可以基于其性质通过各种色谱技术进一步纯化该蛋白质。根据步骤的能力或选择性、载体的稳定性或其他方面来选择纯化步骤的顺序。优选的纯化步骤包括例如离子交换层析、免疫亲和性层析、亲和性层析、疏水相互作用层析、染料层析和尺寸排阻层析步骤,但不限于此。
为了使病毒污染的理论风险最小化,该方法中可以包括其他步骤,以有效地灭活或消除病毒。这样的步骤是例如液态或固态热处理、溶剂和/或表面活性剂处理、可见光谱或UV光谱中的光辐照、γ辐照或纳滤。
本公开的经修饰的多核苷酸(例如,DNA)也可以掺入用于人类基因治疗的转移载体中。
本说明书中描述的各个方面可以彼此组合。在下文中,将通过举例的方式更详细地描述本公开。将结合附图阐述本公开的某些方面的描述。
制剂
本公开中描述的***蛋白质可以配制成用于治疗用途的药物制剂。将纯化的蛋白质溶解在常见的生理学上可接受的缓冲水溶液中,并且可以任选地向其中添加药物赋形剂以提供药物制剂。
药学上的载体和赋形剂以及合适的药物制剂是本领域众所周知的(例如,“Pharmaceutical Formulation of Peptides and Proteins”,Frokjaer等人,Taylor和Francis(2000)或“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第3版,Kibbe等人,Pharmaceutical Press(2000))。特别地,可以将包含本公开的突变体的药物组合物配制成冻干形式或稳定的液体形式。本公开的突变体可以通过本领域已知的多种方法冻干。冻干的制剂可以在使用前通过添加一种或多于一种药学上可接受的稀释剂例如注射用无菌水或无菌盐水来重构。
组合物的制剂通过任何药学上合适的施用方式递送给对象。多种递送系统是已知的,并且可以用于通过任何方便的途径来施用组合物。通常,全身施用本公开的组合物。在全身施用的情况下,将本公开的***蛋白质配制用于肠胃外(例如,静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内或透皮)递送或肠(例如,口服、***或直肠)递送。最优选的施用途径是静脉内和皮下施用。这些制剂可以通过输注或团注连续施用。一些制剂包括缓释系统。
本公开的***蛋白质可以治疗有效量施用于患者,该治疗有效量未达到引起不可接受的副作用的剂量,并且足以产生所需的作用,同时防止或减轻待治疗的病症或症状的严重性或发展。确切的剂量取决于多种因素,包括体征、制剂和施用方法,每种适应症应通过临床前和临床试验确定。
本公开的药物组合物可以单独施用或与其他治疗剂组合施用。这样的试剂可以包含在相同的制剂中。这种制剂的实例是血管性假血友病因子。
治疗方法
本公开还涉及治疗患有血友病A、血友病B或出血性疾病例如获得性血友病的对象的方法。该治疗方法可以包括将有效量的包含本公开的表达载体的药物组合物施用于需要其的对象的步骤。或者,它可以包括将有效量的本公开的宿主细胞施用于对象的步骤。
根据本公开的示例性实施方案,本公开的因子VIII突变体可以以10ng至100mg的量施用,并且编码蛋白质的多核苷酸可以以1μg至100mg的量施用。当因子VIII突变体或编码该因子VIII突变体的多核苷酸施用一次以上时,每次施用剂量可以相同或不同。
以下会通过实施例详细地描述本公开。然而,以下实施例仅出于说明目的,并且本公开的范围不受实施例限制。
实施例
实施例1.因子VIII突变体(F8M)的构建
通过使用SEQ ID NO 1表示的全长因子VIII基因作为模板并使用引物1和2,通过聚合酶链反应(PCR)制备由SEQ ID NO 5表示的片段1。通过制备2μL模板DNA、1μL的10pmol/μL的每种引物、2.5μL的2.5mM的dNTP、1μL的Pfu酶混合物(Enzynomics,韩国)和2.5μL的10x缓冲液,通过添加灭菌的三倍蒸馏水至50μL来制备混合溶液,并重复在95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下30秒的40个循环进行PCR。使用引物8和3通过PCR以相同的方式制备由SEQ IDNO 6表示的片段2。然后,通过使用引物9和10与片段1和2进行重叠PCR来制备单链因子VIII突变体。除了添加2μL的DNA片段以外,以与上述相同的方式进行重叠PCR。
实施例2.因子VIII突变体CO(F8M CO)的构建
在使用OptimumGeneTM算法基于实施例1中制备的因子VIII突变体的碱基序列建立了密码子优化的碱基序列之后,通过Genscript基于该碱基序列合成了由SEQ ID NO 4表示的因子VIII突变体CO。
对比例1.因子VIII(F8)的构建
由SEQ ID NO 1(NM_000132.3)表示的全长因子VIII(F8)基因购自OrigeneTechnologies(MD,USA)。
对比例2.B结构域缺失的因子VIII(F8 BDD)的构建
通过使用由SEQ ID NO 1表示的全长因子VIII基因作为模板并使用引物1和4,通过聚合酶链反应(PCR)制备由SEQ ID NO 7表示的片段3。通过制备2μL的模板DNA、1μL的10pmol/μL的每种引物、2.5μL的2.5mM的dNTP、1μL的Pfu酶混合物(Enzynomics,韩国)和2.5μL的10x缓冲液,通过添加灭菌的三倍蒸馏水至50μL来制备混合溶液,并重复在95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下30秒的40个循环进行PCR。使用引物8和5通过PCR以相同的方式制备由SEQ ID NO 8表示的片段4。然后,通过使用引物9和10与片段3和4进行重叠PCR制备B结构域缺失的因子VIII(F8 BDD)。除了添加2μL的DNA片段以外,以与上述相同的方式进行重叠PCR。
对比例3.单链因子VIII(sc F8)的构建
通过使用由SEQ ID NO 1表示的全长因子VIII基因作为模板并使用引物1和6,通过聚合酶链反应(PCR)制备由SEQ ID NO 9表示的片段5。通过制备2μL的模板DNA、1μL的10pmol/μL的每种引物、2.5μL的2.5mM的dNTP、1μL的Pfu酶混合物(Enzynomics,韩国)和2.5μL的10x缓冲液,通过添加灭菌的三倍蒸馏水至50μL来制备混合溶液,并重复在95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下30秒的40个循环进行PCR。使用引物8和7通过PCR以相同的方式制备由SEQ ID NO 10表示的片段6。然后,通过使用引物9和10与片段5和6进行重叠PCR制备单链因子VIII突变体(sc F8)。除了添加2μL的DNA片段以外,以与上述相同的方式进行重叠PCR。
实施例和比较实施例中使用的引物见表1。
[表1]
制备例
制备例1.表达载体(pCDNA3.1)的构建
将从Genscript购买的每个pCDNA3.1(由SEQ ID NO 12表示)以及在实施例和比较例中制备的蛋白质分别用NheI和NotI酶裂解1小时,然后通过在琼脂糖凝胶上电泳来分离片段。使用T4连接酶将分离的片段连接30分钟,然后引入大肠杆菌。在培养大肠杆菌过夜后,第二天通过微量制备从培养的菌落中分离出DNA,然后使用NheI和NotI进行研究。
制备例2.表达载体(pGP)的构建
在参考Lee等人(Lee Y,等人Improved expression of vascular endothelialgrowth factor by naked DNA in mouse skeletal muscles:implication for genetherapy of ischemic diseases.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002;272(1):230-235)合成pCK载体之后,通过使用表1中所述的引物11和12如上所述进行PCR来获得片段。使用EcoRI酶,使片段在37℃下反应1小时,然后使用Expin Gel SV试剂盒(GeneAll,韩国)纯化DNA。然后,使用T4连接酶连接30分钟并引入大肠杆菌,然后在培养大肠杆菌过夜后,第二天通过微量制备从培养的菌落中分离DNA,构建了由SEQ ID NO 13表示的pGP载体。
将每个制备的pGP载体和实施例和比较例中制备的片段分别用NheI和NotI酶切割1小时,然后通过在琼脂糖凝胶上电泳分离片段。使用T4连接酶将分离的片段连接30分钟,然后引入大肠杆菌。在培养大肠杆菌过夜后,第二天通过微量制备从培养的菌落中分离出DNA,然后使用NheI和NotI进行研究。
制备例3.表达载体(pEF)的构建
将购自ThermoFisher Scientifics的每个pEF载体(由SEQ ID NO 14表示)以及在实施例和比较例中制备的DNA片段用NheI和NotI酶切割1小时,然后通过在琼脂糖凝胶上电泳分离片段。使用T4连接酶将分离的片段连接30分钟,然后引入大肠杆菌。在培养大肠杆菌过夜后,第二天通过微量制备从培养的菌落中分离出DNA,然后使用NheI和NotI进行研究。
制备的表达载体总结在表2中。
[表2]
测试实施例
样品的制备
根据标准方案(Qiagen)纯化在制备例中制备的表达载体。首先,将每个质粒DNA转化到大肠杆菌中后,将大肠杆菌在37℃下培养过夜。用P1、P2和P3裂解大肠杆菌细胞后进行离心。使所获得的上清液通过重力流通过maxi-prep柱,并且通过使用洗脱缓冲液获得包含质粒DNA的上清液。加入0.7体积当量的异丙醇后,通过使用高速离心机以12000rpm离心30分钟来获得表达载体。根据制造商的说明,使用JetPEI(美国,Polyplus)将每种表达载体转染到5x105个293T细胞(ATCC CRL1573)中。在6小时时,将培养基替换为无血清培养基。然后,在37℃培养细胞并在第2天和第3天回收上清液后,以12000rpm离心5分钟,并将上清液保存在-80℃。
测试实施例1.包含表达载体(pCDNA3.1)的细胞的蛋白质表达水平和活性
测量从用制备例1的表达载体转染的细胞获得的样品的蛋白质表达水平和生物学活性。
使用ELISA试剂盒(Stago Asserchrom VIII:Ag,法国)测量蛋白质表达水平。首先,将第2天的样品稀释至1/5,将第5天的样品稀释至1/50。然后,将200μL的参考标准品和样品添加到96孔板中,并在18℃至25℃下孵育2小时。洗涤5次后,将所得物与第二抗体在18℃至25℃下孵育2小时。洗涤5次并与TMB溶液反应5分钟后,用1M硫酸溶液终止反应,并使用ELISA读取器在450nm处测量吸光度。结果如图5和表3所示。
[表3]
如图5和表3所示,pCDNA3.1-F8突变体(实施例1-1)在第2天和第5天都显示出明显高的蛋白质表达水平。特别是,表达水平的差异在第5天比在第2天更加明显。相反,未观察到pCDNA3.1载体的蛋白质表达(对照1)。
另外,使用凝血活性测定试剂盒(Stago,法国)测量生物活性。首先,用Owren-Koller缓冲液连续稀释1IU/mL的参考标准品以获得浓度分别为0.51IU/mL、0.25IU/mL和0.13IU/mL的溶液。然后,在样品或标准溶液中加入0.025M的CaCl2、APTT试剂活化剂和缺乏因子VIII的血浆并在37℃下孵育后,使用凝血分析仪(Stago Compact,法国)进行测量。将测量结果相对于参考标准品的活性进行归一化,结果示于图6和表4中。
[表4]
如图6和表4所示,CDNA3.1-F8突变体(实施例1-1)显示出明显高的凝血活性。
测试实施例2.包含表达载体(pGP)的细胞的蛋白质表达水平
测量从用制备例2的表达载体转染的细胞获得的样品的蛋白质表达水平。
使用ELISA试剂盒(Stago Asserchrom VIII:Ag,法国)测量蛋白质表达水平。首先,将第2天的样品稀释至1/5,将第5天的样品稀释至1/50。然后,将200μL的参考标准品和样品添加到96孔板中,并在18℃至25℃下孵育2小时。洗涤5次后,将所得物与第二抗体在18℃至25℃下孵育2小时。洗涤5次并与TMB溶液反应5分钟后,用1M硫酸溶液终止反应,并使用ELISA读取器在450nm处测量吸光度。结果如图7和表5所示。
[表5]
如图7和表5所示,pGP-F8突变体(实施例1-2)在第2天和第5天都显示出明显高的蛋白质表达水平。特别是,表达水平的差异在第5天比在第2天更加明显。相反,未观察到pGP载体的蛋白质表达(对照2)。
测试实施例3.包含表达载体(pEF)的细胞的蛋白质表达水平
测量从用制备例3的表达载体转染的细胞获得的样品的蛋白质表达水平。
使用ELISA试剂盒(Stago Asserchrom VIII:Ag,法国)测量蛋白质表达水平。首先,将第2天的样品稀释至1/5,将第5天的样品稀释至1/50。然后,将200μL的参考标准品和样品添加到96孔板中,并在18℃至25℃下孵育2小时。洗涤5次后,将所得物与第二抗体在18℃至25℃下孵育2小时。洗涤5次并与TMB溶液反应5分钟后,用1M硫酸溶液终止反应,并使用ELISA读取器在450nm处测量吸光度。结果如图8和表6所示。
[表6]
如图8和表6所示,pEF-F8突变体(实施例1-3)在第2天和第5天都显示出明显高的蛋白质表达水平。特别是,表达水平的差异在第5天比在第2天更加明显。相反,未观察到pEF载体的蛋白质表达(对照3)。
从以上结果,证实了与因子VIII(F8)相比,因子VIII突变体(F8M)可表现出更高的蛋白质表达。特别地,认为与因子VIII(F8)相比,因子VIII突变体(F8M)蛋白质具有改善的稳定性,因为在第5天该蛋白质表达水平高于第2天。另外,与因子VIII(F8)相比,因子VIII突变体(F8M)在第5天的凝血活性更高(约2.5倍)。由此可见,本发明治疗剂的因子VIII突变体(F8M)基因以更高的水平表达具有高凝血活性的蛋白质。另外,观察到当用具有EFla启动子的pEF载体进行密码子优化时,因子VIII突变体(F8M)在第5天表现出进一步改善的蛋白质表达水平和稳定性。
尽管已经示出和描述了示例性实施方案,但是本领域技术人员应理解,可以在不脱离由所附权利要求限定的本公开的精神和范围的情况下对其进行形式和细节上的各种改变。
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