具体实施方式

本发明提供对细胞凋亡和剪切应力具有改良的抗性的细胞系(例如HEK293细胞系)。这些细胞系显示在生物反应器(例如种子培养生物反应器)中展现稳定效能且允许在搅拌罐生物反应器中以35L试验规模长期培养人类细胞系或提高10L波状袋生物反应器中的产量。因而，本发明的细胞系可用于例如细胞培养物和细胞培养方法(诸如重组多核苷酸、重组多肽和病毒载体产生方法)中。

在一方面，本文中提供产生重组多肽的方法，该方法包括在适合产生该多肽的条件下培养HEK293细胞系，该细胞系包含(a)人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变及(b)编码该重组多肽的多核苷酸。

在另一方面，本文中提供产生病毒载体的方法，该方法包括在适合产生该病毒载体的条件下培养HEK293细胞系，该细胞系包含(a)人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变；(b)病毒基因组；及(c)一种或多种编码病毒衣壳的多核苷酸。

在另一方面，本文中提供细胞培养物，其包含细胞培养基和多个HEK293细胞，其中该多个细胞中的各细胞包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变。

在另一方面，本文中提供包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的HEK293细胞系(例如经分离的HEK293细胞系)。

I.定义

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定组成物或生物系统，由此固然可变化。也应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意欲具有限制性。

除非上下文另外清楚指示，否则如本说明书和所附申请专利范围中所使用，单数形式“一”和“该”包括多个指示物。因而，例如，提及“一个分子”任选地包括两个或更多个此种分子及其类似物的组合。

如本文中所使用的术语“约”是指此技术领域中的技术人员容易获知的各别值的通常误差范围。本文中提及“约”某一值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施例。最多，本文中在提及某一值时所使用的术语“约”涵盖该值的90％至110％(例如，约1.0至约3.0的第一和第二TIR相对转译强度是指介于0.9与3.3之间的范围内的相对转译强度)。

应理解，本文中所描述的本发明的方面和实施例包括“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”的方面和实施例。

术语“多核苷酸”当以单数或复数形式使用时一般是指任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。因而，例如，如本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包括单链和双链区域的DNA、单链和双链RNA以及包括单链和双链区域的RNA、包含可能为单链或更典型地为双链或包括单链和双链区域的DNA和RNA的杂合分子。另外，如本文中所使用的术语“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA与DNA二者的三链区。此类区域中的链可来自相同分子或来自不同的分子。该区域可包括一个或多个分子的全部，但更典型地仅包括一些分子的区域。三螺旋区域的分子之一通常为寡核苷酸。术语“多核苷酸”尤其包括cDNA。该术语包括含有一个或多个经修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。因而，具有出于稳定性或出于其他原因而经修饰的主链的DNA或RNA为如本文中所指的术语“多核苷酸”。此外，包含异常碱基(诸如肌苷)或经修饰碱基(诸如氚化碱基)的DNA或RNA包括在如本文中所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可为线性或分枝的，其可包含经修饰的氨基酸，且其可能间杂非氨基酸。该术语也涵盖经天然或通过干预加以修饰的氨基酸聚合物；该干预为例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他处理或修饰，诸如与标记组分或毒素结合。该定义内也包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及此项技术中已知的其他修饰的多肽。如本文中所使用的术语“多肽”和“蛋白质”明确涵盖抗体。

基因中的“功能丧失突变”是指基因中减少或消除相应基因产物的一种或多种功能的基因操纵或突变(例如，替代、缺失、插入、复制、框移或易位)。在一些实施例中，功能丧失突变为消除相应基因产物的一种或多种功能的无效突变，例如移除一些或所有编码序列的缺失。在一些实施例中，功能丧失突变是指引起基因表达降低的基因操纵，例如通过RNAi(例如siRNA或shRNA)、CRISPRi、miRNA、吗啉基等敲低。

术语“重组”当用于修饰多核苷酸、多肽或病毒载体时是指已引入宿主细胞中或由其产生的多核苷酸/多肽/病毒载体，该宿主细胞在天然情况下并不含有或产生多核苷酸/多肽/病毒载体。多核苷酸、多肽或病毒载体本身可为非天然存在的(例如人类化抗体)，或其可能存在于自然界中而非宿主细胞中(例如，由自然界中通常不产生抗体的人类细胞类型产生的人类抗体)。

如本文中所使用，术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)意指已进行基因改变或能够通过引入外源或非天然多核苷酸(诸如重组质体或载体)而进行基因改变的细胞。应理解此类术语意欲不仅指特定目标细胞，而且指此种细胞的子代。因为由于突变或环境影响而可能在后代中存在某些修饰，故此种后代实际上可能与亲本细胞不一致，但仍包括在如本文中所使用的术语“宿主细胞”的范畴内。

如本文中所使用，“HEK293细胞系”是指其谱系最终可追溯回原始HEK293细胞系，例如由ATCC目录号CRL-1573^TM表示和/或在如所描述(Graham等人,(1977)J.Gen.Virol.36:59-74)用5型腺病毒DNA片段对人类胎肾细胞进行转型后产生的细胞系的任何细胞。该术语包括已例如通过在Bax和Bak基因中引入突变且任选地用重组多核苷酸转染和/或用病毒载体(例如重组病毒载体)感染而进行基因修饰的HEK293细胞系。已知HEK293细胞系为具有整合至染色体19中的4kb腺病毒基因组片段的假三倍体(Louis等人,(1997)Virology 233:423-429)。已描述HEK293基因组和转录组的特征(Lin等人,(2014)Nat.Commun.5:4767doi:10.1038/ncomms5767)。

如本文中所使用的“培养基”(术语“细胞培养基”在本文中可互换使用)是指支持本发明的细胞系的生长的任何组成物或肉汤。适合的培养基可为液体或固体且含有任何营养物、盐、缓冲剂、要素及支持细胞生长和存活率的其他化合物。培养基的常见营养物可包括氮、碳、氨基酸、碳水化合物、痕量元素、维生素和矿物质来源。这些营养物可作为个别组分(如限定培养基中)或作为复杂提取物(例如酵母提取物或植物/动物水解物或肽)的组分添加。培养基可包括动物来源的组分，诸如血清，或其可不含动物来源。培养基可为化学限定的。培养基可富含营养物以支持快速生长，或具最低限度营养物以支持较慢生长。培养基也可含有用于抑制污染生物体生长或杀死污染生物体的任何剂(例如抗生素或抗霉剂)。培养基也可含有用于控制诱导性启动子或酶的活性的任何化合物。

术语“抗体”在本文中以其最广泛意义使用且特别地涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、多株抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现所需生物活性即可。

“分离”的抗体为从其天然环境组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分为会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将抗体纯化(1)至如通过例如罗氏方法(Lowrymethod)所测定存在超过95重量％且在一些实施例中超过99重量％的抗体；(2)至足以通过使用例如旋杯式定序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)至均质(通过在还原或非还原条件下使用例如考马斯蓝(Coomassie blue)或银染色剂进行SDS-PAGE)。经分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为该抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤来制备经分离的抗体。

“天然抗体”通常为由两个一致轻(L)链与两个一致重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白。各轻链由一个共价二硫键连接至重链，而二硫键数目因不同免疫球蛋白同型的重链而变化。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。各重链具有处于一端的可变域(V_H)和继其之后的众多恒定域。各轻链具有处于一端的可变域(V_L)和处于其另一端的恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准，且轻链可变域与重链的可变域对准。据信特定氨基酸残基可在轻链与重链可变域之间形成界面。

术语“恒定域”是指具有相对于免疫球蛋白的另一部分(即可变域，其含有抗原结合位点)更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恒定域含有重链的C_H1、C_H2和C_H3结构域(统称为CH)及轻链的CHL(或CL)结构域。

抗体的“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链可变域可称为“V_H”。轻链可变域可称为“V_L”。这些结构域一般为抗体的最可变部分且含有抗原结合位点。

术语“可变”是指可变域的某些部分在序列方面因抗体而广泛不同，且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非均匀分布在抗体的可变域中。其集中于轻链和重链可变域二者中称为高变区(HVR)的三个区段内。可变域的更高度保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，主要采用β-片构型，由三个HVR连接，其形成连接β-片结构且在一些情况下形成β-片结构的一部分的环。各链中的HVR由FR区保持紧密邻近，且与来自另一链的HVR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，而是展现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”皆可基于其恒定域的氨基酸序列而分配至两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。

如本文中所使用的术语IgG“同型”或“子类”意指由其恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白子类。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可分配至不同的类别。有五种主要免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些类别中有若干种可进一步分成子类(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构和三维构型为众所周知的，且一般描述于例如Abbas等人,Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中。抗体可为由抗体与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整抗体”在本文中可互换用于指呈其实质上完整形式的抗体，而非如以下所定义的抗体片段。该术语尤其是指具有含Fc区的重链的抗体。

“裸抗体”出于本文中的目的为未结合至细胞毒性部分或放射性标记的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施例中，本文中描述的抗体片段为抗原结合片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个一致抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点；以及一个残余“Fc”片段，其名称体现其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原组合位点且仍能够使抗原交联的F(ab')₂片段。

“Fv”为含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，两条链的Fv物质由一个重链可变域和一个轻链可变域紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物质中，一个重链可变域与一个轻链可变域可通过可挠性肽连接基共价连接，使得该轻链和重链可缔合于类似于两条链的Fv物质中的结构的“二聚”结构中。在该构型中，各可变域的三个HVR相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，所述六个HVR赋予该抗体以抗原结合特异性。然而，即使单一可变域(或仅包含三个抗原特异性HVR的半Fv)也能够识别并结合抗原，但亲和力低于完整结合位点。

Fab片段含有重链和轻链可变域，且也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基末端处添加数个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH为本文中用于恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的名称。F(ab')₂抗体片段最初产生为成对的Fab'片段，在其之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶合也为已知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般而言，scFv多肽进一步包含介于VH与VL结构域之间的多肽连接基，其使得scFv能够形成供抗原结合用的所需结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthün,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York,1994),第269-315页。

术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，其片段包含与轻链可变域(VL)连接于同一多肽链(VH-VL)中的重链可变域(VH)。通过使用因过短而不允许同一链上的两个结构域之间进行配对的连接基，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体可为二价或双特异性。双功能抗体更充分描述于例如以下文献中：EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。

如本文中所使用的术语“单株抗体”是指获自实质上均质抗体群体的抗体，例如，构成该群体的个别抗体除可能的突变，例如可能微量存在的天然存在突变外为一致的。因而，修饰语“单株”指示抗体的特征为并非离散抗体的混合物。在某些实施例中，此种单株抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中该靶标结合多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列的方法来获得。例如，选择过程可为从多个克隆，诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择独特的克隆。应理解，可进一步改变所选靶标结合序列，例如，以提高对靶标的亲和力、使靶标结合序列人类化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在活体内的免疫原性、以产生多特异性抗体等，而且包含经改变的靶标结合序列的抗体也为本发明的单株抗体。与典型地包括针对不同决定因素(抗原决定基)的不同抗体的多株抗体制剂相反，单株抗体制剂的各单株抗体针对抗原上的单一决定因素。除其特异性以外，单株抗体制剂的优势也在于其典型地未受其他免疫球蛋白污染。

非人类(例如鼠类)抗体的“人类化”形式为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人类化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自于受体的HVR的残基置换为来自于诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种的具有所需特异性、亲和力和/或容量的HVR(供体抗体)的残基。在一些情况下，人类免疫球蛋白的FR残基置换为相应非人类残基。此外，人类化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可进行这些修饰以进一步精化抗体效能。一般而言，人类化抗体将包含实质上所有至少一个且典型地两个可变域，其中所有或实质上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环，且所有或实质上所有FR均为人类免疫球蛋白序列的FR。人类化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步细节，参见例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。也参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利第6,982,321号和第7,087,409号。

“人类抗体”为具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或使用如本文中所公开的制造人类抗体的技术中的任一种制造的抗体。此人类抗体定义明确排除包含非人类抗原结合残基的人类化抗体。人类抗体可使用该技术领域中已知的多种技术，包括噬菌体呈现库来产生。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人类单株抗体的方法描述于以下文献中：Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。也参见van Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过向经修饰以应答于抗原攻击而产生此类抗体但内源基因座已失能的转基因动物(例如免疫异种移植小鼠)施用抗原来制备人类抗体(关于XENOMOUSE^TM技术，参见例如美国专利第6,075,181号和第6,150,584号)。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，也参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”当用于本文中时是指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构受限的环的区域。一般而言，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3呈现六个HVR的最大多样性，且特别地，据信H3在赋予抗体精细特异性方面发挥独特作用。参见例如Xu等人,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下具有功能而且稳定。参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR描绘。Kabat互补性决定区(CDR)是基于序列可变性且最常用(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR表示KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷，且由Oxford Molecular的AbM抗体模型化软件使用。“接触”HVR是基于对可用复杂晶体结构的分析。以下注明这些HVR中每一者的残基。

表1a.抗体高变区

HVR可包含如下“延伸HVR”：VL中的24至36或24至34(L1)、46至56或50至56(L2)及89至97或89至96(L3)，以及VH中的26至35(H1)、50至65或49至65(H2)及93至102、94至102或95至102(H3)。对于这些定义中的每一者，可变域残基是根据Kabat等人，同上进行编号。

“构架”或“FR”残基为除如本文中所定义的HVR残基以外的那些可变域残基。

术语“如Kabat中的可变域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指Kabat等人，同上中用于编译抗体的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用该编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于缩短或插入可变域的FR或HVR中的较少或额外氨基酸。例如，重链可变域可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入(残基52a，根据Kabat)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，残基82a、82b和82c等，根据Kabat)。对于指定抗体，可通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。

当提及可变域中的残基(大约轻链的残基1至107和重链的残基1至113)时，一般使用Kabat编号系统(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，一般使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人，同上中所报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。

表述“线性抗体”是指Zapata等人(1995Protein Eng,8(10):1057-1062)中所描述的抗体。简而言之，这些抗体包含成对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成成对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性的。

II.细胞系

本文中提供在人类Bax和Bak基因中的每一者中包含功能丧失突变的HEK293细胞系(例如经分离的HEK293细胞系)。

人类Bax基因(也称为Bcl2l4)编码促细胞凋亡Bcl-2家族成员。在细胞凋亡期间，Bax和Bak渗透线粒体膜，引起膜电位丧失和细胞色素c释放，最终引起凋亡蛋白酶蛋白活化，从而触发程序性细胞死亡(Taylor等人，(2008)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:231-241)。在细胞凋亡的线粒体或固有途径期间，需要Bax或Bak渗透线粒体外膜。在一些实施例中，人类Bax基因是指NCBI基因ID编号581描述的基因。在一些实施例中，人类Bax基因编码以下人类Bax同功异形体中的一种或多种：X1(参见例如NCBI登录号XP_016882566.1)、ξ(参见例如NCBI登录号NP_001278360.1)、λ(参见例如NCBI登录号NP_001278359.1)、γ(参见例如NCBI登录号NP_001278358.1)、1(参见例如NCBI登录号NP_001278357.1)、σ(参见例如NCBI登录号NP_620119.2)、δ(参见例如NCBI登录号NP_620118.2)、α(参见例如NCBI登录号NP_620116.2)及β(参见例如NCBI登录号NP_004315.1)。

人类Bak基因(也称为BCL2拮抗剂/杀手蛋白1、Bak1、Cdn1、Bcl2l7和类Bak)编码促细胞凋亡Bcl-2家族成员。在细胞凋亡期间，Bax和Bak渗透线粒体膜，引起膜电位丧失和细胞色素c释放，最终引起凋亡蛋白酶蛋白活化，从而触发程序性细胞死亡(Taylor等人，(2008)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:231-241)。在一些实施例中，人类Bak基因是指NCBI基因ID编号578描述的基因。在一些实施例中，人类Bak基因编码以下人类Bak同功异形体中的一种或多种：X1(参见例如NCBI登录号XP_011513082.1)、X2(参见例如NCBI登录号XP_011513081.1)和标准同功异型体(参见例如NCBI登录号NP_001179.1)。

在一些实施例中，功能丧失突变包含一个或多个取代、插入、缺失和/或框移突变。在一些实施例中，功能丧失突变包含缺失。人类Bax和Bak基因中的各种功能丧失突变为已知的。例如，已描述各种癌症中存在Bax和Bak突变；参见例如OMIM款目600040和600516以及Bax和Bak的COSMIC(癌症体细胞突变目录)款目(分别见cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis？ln＝BAX和cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis？ln＝BAK1)。在一些实施例中，Bax或Bak中的功能丧失突变减少或消除Bax或Bak的一种或多种功能(例如促细胞凋亡功能)，包括但不限于促进细胞凋亡、线粒体膜电位丧失、线粒体外膜孔隙形成和细胞色素c释放。在一些实施例中，Bax或Bak中的功能丧失突变减少或消除Bax或Bak蛋白的表达。在一些实施例中，Bax或Bak中的功能丧失突变是指减少或消除Bax或Bak蛋白表达的基因操纵，例如通过RNAi、CRISPRi、miRNA、吗啉基等。在一些实施例中，Bax中的功能丧失突变抑制Bak中具有功能丧失突变的细胞中对细胞凋亡和/或线粒体膜电位丧失、线粒体外膜孔隙形成或细胞色素c释放的敏感性，和/或Bak中的功能丧失突变抑制Bax中具有功能丧失突变的细胞中对细胞凋亡和/或线粒体膜电位丧失、线粒体外膜孔隙形成或细胞色素c释放的敏感性。例如，已显示当Bax功能受损时降低Bak功能与在正常Bax功能的情况下降低Bak功能相比对细胞凋亡敏感性的影响大得多(参见例如Chandra,D.等人,(2005)J.Biol.Chem.280:19051-19061)。

用于对人类Bax和Bak基因中的每一者中具有功能丧失突变的HEK293细胞系进行工程化的技术为已知的。在一些实施例中，如本文中所例示，可使用锌指核酸酶技术(Cost等人,(2010)Biotechnol.Bioeng.105:330-340)引入Bax和Bak中的功能丧失突变(例如缺失)。用于在人类细胞中引入突变的其他技术包括但不限于CRISPR/Cas9、TALEN、定点突变诱发(通过PCR)、化学突变诱发、插入突变诱发等等。

在一些实施例中，包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的HEK293细胞系与包含人Bax和Bak基因中每一者的功能性拷贝的HEK293细胞系或包含人Bax和Bak基因中仅一者的功能性拷贝的HEK293细胞系相比显示以下一项或多项：对细胞凋亡的抗性增加、对剪切应力的抗性增加、对星形孢菌素的抗性增加和重组多肽的产生增加(例如，在细胞培养物中)。

重组多核苷酸、多肽、抗原、酶和疫苗

在一些实施例中，本发明的细胞系(例如包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的HEK293细胞系)包含重组多核苷酸。例如，在一些实施例中，重组多核苷酸编码重组多肽(例如抗体或抗体片段的一个或多个链)。

在一些实施例中，重组多核苷酸(例如编码重组多肽的重组多核苷酸)为染色体外多核苷酸。在一些实施例中，将重组多核苷酸引入细胞系中而非将多核苷酸整合至宿主细胞基因组中。在一些实施例中，通过瞬时转染将重组多核苷酸引入至细胞系中。已知瞬时转染将重组多核苷酸引入至细胞系中而非将多核苷酸整合至宿主细胞基因组中；因而，该多核苷酸不与宿主细胞基因组一起复制并且在有限时段之后丧失(由于例如细胞分裂、降解等)。瞬时转染HEK293细胞系的方法在此项技术中为已知的(参见例如de Los MilagrosBassani Molinas等人,(2014)Cytotechnology 66:493-514)，且瞬时转染HEK293细胞的试剂盒可购自市面(参见例如由Thermo Fisher Scientific出售的瞬时HEK293细胞转染用Expi293^TM表达系统)。

在其他实施例中，将重组多核苷酸(例如，编码重组多肽的重组多核苷酸)整合至宿主细胞基因组中，例如人类细胞系的染色体上。在一些实施例中，通过稳定转染将重组多核苷酸引入至细胞系中。已知稳定转染通过稳定继承非基因组DNA或将重组多核苷酸并入宿主细胞基因组中(例如，通过整合至宿主细胞染色体上)将重组多核苷酸引入细胞系中。在一些实施例中，通过随机整合将重组多核苷酸整合至宿主细胞基因组中。例如，重组多核苷酸可编码选择标志物(例如，编码赋予对诸如嘌呤霉素、潮霉素、G418等抗生素的抗性的蛋白质)，且可经由选择标志物对经重组多核苷酸转染的细胞进行一轮或多轮选择(例如，通过使用包含诸如嘌呤霉素、潮霉素、G418等抗生素的细胞培养基来杀死不表达该选择标志物的细胞)。用于随机整合至HEK293细胞中的技术和试剂盒在此项技术中为已知的；参见例如www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/transfection-methods/stable-transfection.html。在一些实施例中，通过位点特异性或靶向性整合将重组多核苷酸整合至宿主细胞基因组中。例如，可使用诸如重组酶介导的卡匣交换(RMCE)、Cre-Lox重组或FLP-FRT重组的技术将重组多核苷酸整合至宿主细胞基因组中的靶位点中。在HEK293细胞中使用位点特异性或靶向性整合的技术和试剂盒在此项技术中为已知的(参见例如Callesen等人,(2016)PLoS One 11:e0161471)和Flp-In^TM293细胞系(Thermo Fisher Scientific)。

在一些实施例中，本发明的重组多核苷酸编码重组多肽。下文列出例示性重组多肽。在一些实施例中，由本发明的HEK293细胞系产生的重组多肽包含人类细胞中产生的一个或多个转译后修饰(例如糖基化)特征，例如，与原核生物、真菌、昆虫或非人类哺乳动物细胞中产生的相应多肽的修饰相比。例如，已记录HEK293细胞相对于CHO细胞中表达的相似蛋白质之间的糖基化差异(参见例如Croset等人,(2012)J.Biotechnol.161:336-348)。在一些实施例中，由本发明的HEK293细胞系产生的重组多肽包含糖基化修饰，其包含图4E中所示的一种或多种例示性和非限制性聚糖。

在一些实施例中，本发明的重组多核苷酸编码抗原。在一些实施例中，该抗原为多肽抗原。在一些实施例中，该抗原为肽抗原。在一些实施例中，该抗原为治疗或诊断抗原。

在一些实施例中，本发明的重组多核苷酸编码酶。在一些实施例中，该酶为治疗或诊断酶。

在一些实施例中，本发明的重组多核苷酸编码疫苗。在一些实施例中，该疫苗为肽疫苗。在一些实施例中，该疫苗为减毒灭活类毒素或次单元/重组疫苗。在一些实施例中，该疫苗针对以下一种或多种：麻疹、腮腺炎、风疹、轮状病毒、天花、水痘、黄热病、A型肝炎、B型肝炎、流感、脊髓灰质炎、狂犬病、希伯氏病(Hib disease)、人类乳头状瘤病毒、百日咳、肺炎球菌病、脑膜炎球菌病、带状疱疹、破伤风和白喉。

在一些实施例中，本发明的重组多核苷酸包含病毒基因组和/或编码病毒衣壳。如下文第IV部分中更详细描述，本发明的细胞系尤其可用于产生病毒载体的方法中。在一些实施例中，本发明的细胞系包含病毒基因组(例如，相关病毒载体的基因组)和一种或多种编码病毒衣壳的多核苷酸。例如，已修饰HEK293细胞系以在其基因组中包括AAV基因(例如Rep和Cap基因)，从而产生包装细胞系，随后可用腺病毒感染，以便产生腺相关病毒(AAV)载体(参见例如Qiao等人,(2002)J.Virol.76:13015-13027)。也已修饰HEK293细胞系以便在其基因组中包括AAV基因(例如Rep和Cap基因)以及腺病毒基因(例如E1A/E1B)，从而产生生产细胞系以用于产生腺相关病毒(AAV)载体(参见例如Yuan等人,(2011)Hum.GeneTher.22:613-624)。

在一些实施例中，重组多核苷酸包含表达载体。表达载体可包括以下元件中的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子及转录终止序列。

本发明的重组多肽不仅可直接重组产生，而且可呈与异源多肽的融合多肽形式，该异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白质或多肽N末端具有特定切割位点的其他多肽。所选异源信号序列优选为由宿主细胞识别并处理(例如，由信号肽酶切割)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。

在一些实施例中，表达载体包含复制起点。一般而言，在载体中，该序列为使载体能够独立于宿主染色体DNA进行复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(例如，通常可使用SV40起点，仅因为其含有早期启动子)。在其他实施例中，载体不包括复制起点(例如在重组多核苷酸整合至宿主细胞染色体上时)。

在一些实施例中，如以上关于稳定转染所提及，表达载体包含选择基因或选择标志物。典型选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性；(b)补充营养缺陷型缺乏或(c)提供无法获自复杂培养基的重要营养物。选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。那些经异源基因成功转型的细胞产生赋予药物抗性的蛋白质且因而通过选择方案。适用于哺乳动物细胞的选择标志物的另一实例为使得能够鉴定胜任摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志物，诸如DHFR、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白I及金属硫蛋白II，优选为灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，通过在含有DHFR的竞争拮抗剂，即氨甲叶酸(Mtx)的培养基中培养转型体来鉴定经DHFR基因转型的细胞。在这些条件下，DHFR基因连同任何其他共转型核酸一起扩增。替代地，通过在含有GS的抑制剂，即L-甲硫氨酸磺基肟(Msx)的培养基中培养转型体来鉴定经GS基因转型的细胞。在这些条件下，GS基因连同任何其他共转型核酸一起扩增。GS选择/扩增系统可与以上描述的DHFR选择/扩增系统组合使用。替代地，可通过在含有针对选择标志物的选择剂，诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)或G418的培养基中进行细胞生长来选择经相关DNA序列、野生型DHFR基因及另一选择标志物(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))转型或共转型的宿主细胞(特别地，含有内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利第4,965,199号。

在一些实施例中，表达载体包含启动子。表达和克隆载体一般含由宿主生物体识别且可操作地连接至重组多核苷酸的启动子。可通过获自诸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)的病毒的基因组或异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、热休克启动子的启动子来控制哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体转录，其限制条件为此类启动子与宿主细胞系统兼容。便利地获得呈SV40限制片段形式的SV40病毒早期和晚期启动子，该片段也含有SV40病毒复制起点。便利地获得呈HindIII E限制片段形式的人类巨细胞病毒立即早期启动子。美国专利第4,419,446号中公开使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利第4,601,978号中描述此系统的改进。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达人类β-干扰素cDNA，也参见Reyes等人,Nature 297:598-601(1982)。替代地，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

在一些实施例中，表达载体包含增强子元件。现已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，典型地将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子及腺病毒增强子。关于增强用于活化真核启动子的元件，也参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可在抗体编码序列5'或3'的位置剪接至载体中，但优选位于启动子5'的位点处。

在一些实施例中，表达载体包含转录终止子，例如终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可获自真核生物或病毒DNA或cDNA的5'及偶尔地3'非转译区。这些区域含有转录为编码抗体的mRNA的非转译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种适用转录终止组分为牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中所公开的表达载体。

抗体和抗体片段

在一些实施例中，本发明的重组多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段。例如，在一些实施例中，重组多核苷酸编码抗体或抗体片段的重链和轻链或者单链抗体或抗体片段。在以下第IV部分中更详细描述使用本发明的细胞系或细胞培养物产生抗体或抗体片段的例示性方法。

在一些实施例中，抗体(或抗体片段)为诊断抗体。例如，该抗体可用于例如通过ELISA、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫组织化学(IHC)、流式细胞术或其他免疫分析法来检测样品中的一种或多种诊断抗原。作为非限制性实例，已使用诊断抗体检测用于所使用的诊断分析法中的HER2(参见例如来自DAKO Corp.的用于鉴定过度表达HER2的肿瘤的HercepTest)、雌激素和黄体激素受体(参见例如来自DAKO Corp.的用于鉴定过度表达ER或PR的肿瘤的ER/PR pharmDx试剂盒)及PD-L1(参见例如用于鉴定表达PD-L1的肿瘤的Ventana SP263和SP142分析法)，例如在治疗各种癌症时。

在一些实施例中，抗体(或抗体片段)为治疗抗体。例示性治疗抗体包括但不限于纳武单抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、阿维鲁单抗(avelumab)(Merck)、度伐鲁单抗(durvalumab)(Astra-Zeneca/Medimmune)、阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(Genentech)；西妥昔单抗(cetuximab)(Imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(Amgen)、利妥昔单抗(rituximab)(Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech)、阿替珠单抗(atezolizumab)(Genentech)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)(Genentech)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(Genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐珠单抗美坦新(bivatuzumab mertansine)、坎妥珠单抗美坦新(cantuzumab mertansine)、西地珠单抗(cedelizumab)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西福妥珠单抗(cidfusituzumab)、西妥珠单抗(cidtuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、伊妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫托珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼洛珠单抗(nolovizumab)、奴马珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥玛珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、培福妥珠单抗(pecfusituzumab)、培妥珠单抗(pectuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、雷利珠单抗(ralivizumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、瑞西珠单抗(reslivizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、瑞维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、他卡珠单抗替塞坦(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、图妥珠单抗西莫白介素(tucotuzumabcelmoleukin)、图库珠单抗(tucusituzumab)、乌马珠单抗(umavizumab)、乌托珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)及抗白介素-12(ABT-874/J695，Wyeth Research和Abbott Laboratories)，其为经基因修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组排他性人类序列全长IgG₁λ抗体。由EMA或FDA批准用于治疗用途的单株抗体的非限制性清单可见于www.actip.org/products/monoclonal-antibodies-approved-by-the-ema-and-fda-for-therapeutic-use/。

下文以非限制性方式描述抗体和抗体片段的特征。

某些基于抗体的方法

单株抗体可使用首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述且进一步描述于例如关于人类-人类杂交瘤的Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)中的杂交瘤方法来制造。其他方法包括例如关于由杂交瘤细胞系产生单株人类天然IgM抗体的美国专利第7,189,826号中所描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)描述于以下文献中：Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)；以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。一旦已从杂交瘤分离所需单株抗体后，便可将编码其的多核苷酸亚克隆至表达载体中，且可通过本文中所描述的任何方法在HEK293细胞系中表达来产生抗体。

库来源的抗体

可通过筛检组合库中具有所需活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，此项技术中已知用于产生噬菌体呈现库及筛检此类库中具有所需结合特征的抗体的各种方法，诸如实例3中所描述的方法。其他方法综述于例如以下文献中：Hoogenboom等人,Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，且进一步描述于例如以下文献中：McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体呈现方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因谱系且随机重组于噬菌体库中，随后可筛检抗原结合噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述。噬菌体典型地将抗体片段呈现为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫来源的库提供针对免疫原的高亲和力抗体而无需构筑杂交瘤。替代地，可克隆(例如，来自人类)天然谱系以便在不进行任何免疫的情况下提供单一抗体来源至大范围非自体以及自体抗原，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，也可通过从干细胞克隆未重排的V基因区段且使用含有随机序列的PCR引物编码高变CDR3区且实现活体外重排来合成产生天然库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人类抗体噬菌体库的专利公开案包括例如美国专利第5,750,373号及美国专利公开案第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号及第2009/0002360号。

在本文中，从人类抗体库分离的抗体或抗体片段被视为人类抗体或人类抗体片段。

嵌合抗体、人类化抗体和人类抗体

在某些实施例中，本文中提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或诸如猴的非人类灵长类动物的可变区)和人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为类别或子类相对于亲本抗体的类别或子类已发生变化的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施例中，嵌合抗体为人类化抗体。典型地，非人类抗体经人类化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。一般而言，人类化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)来源于非人类抗体，而FR(或其部分)来源于人类抗体序列。人类化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人类化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如，HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改良抗体特异性或亲和力。

人类化抗体及制造其的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，且进一步描述于例如以下文献中：Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“定向选择”方法)。

可用于人类化的人类构架区包括但不限于：使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；来源于特定轻链或重链可变区子群的人类抗体的一致序列的构架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)；及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

在某些实施例中，本文中提供的抗体为人类抗体。人类抗体可使用此项技术中已知的各种技术来产生。人类抗体一般描述于以下文献中：van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)；及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。人类抗体可例如但不限于通过本文中描述的任何方法通过在HEK293细胞系中由表达载体的表达来制造。

也可通过分离选自人类来源的噬菌体呈现库的Fv克隆可变域序列来产生人类抗体。随后可将此类可变域序列与所需人类恒定域组合。以下描述用于自抗体库选择人类抗体的技术。

抗体片段

可通过诸如酶消化的传统方式或通过重组技术来产生抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完整抗体存在诸多优势。片段的较小尺寸允许快速清除，且可改良对实体瘤的通路。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,(2003)Nat.Med.9:129-134。

已开发多种用于产生抗体片段的技术。按传统，这些片段是经由完整抗体的蛋白水解消化而获得(参见例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；及Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，现可由重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab、Fv和ScFv抗体片段均可表达于大肠杆菌中且从其中分泌，由此允许轻易产生大量的这些片段。也可从以上所论述的抗体噬菌体库中分离抗体片段。替代地，可自大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段并且化学偶联以形成F(ab')₂片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一方法，可从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')₂片段。包含补救受体结合抗原决定基残基的具有增加的活体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段描述于美国专利第5,869,046号中。用于产生抗体片段的其他技术对熟习此项技术者将显而易见。在某些实施例中，抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；及第5,587,458号。Fv和scFv为具有完整结合位点而缺乏恒定区的仅有物质；因此，其可能适合于在活体内使用期间减少非特异性结合。可构筑scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,同上。例如，抗体片段也可为“线性抗体”，例如，如美国专利第5,641,870号中所描述。此类线性抗体可为单特异性或双特异性的。

多特异性抗体

多特异性抗体对至少两个不同的抗原决定基具有结合特异性，其中抗原决定基通常来自不同的抗原。尽管此类分子通常将仅结合两个不同的抗原决定基(即，双特异性抗体、BsAb)，但此表述在用于本文中时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。

用于制造双特异性抗体的方法在此项技术中为已知的。全长双特异性抗体的传统产生是基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链配对，其中两条重链具有不同的特异性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分组，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生约10个不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一个抗体分子具有正确双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产率低。类似程序公开于WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。

一种此项技术中已知的制造双特异性抗体的方法为“钮入孔”或“突起入凹穴”方法(参见例如美国专利第5,731,168号)。在此方法中，两个免疫球蛋白多肽(例如重链多肽)各自包含界面。一个免疫球蛋白多肽的界面与另一免疫球蛋白多肽的相应界面相互作用，从而允许两个免疫球蛋白多肽缔合。这些界面可经工程改造以使得位于一个免疫球蛋白多肽的界面中的“钮”或“突起”(这些术语在本文中可互换使用)对应于位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“孔”或“凹穴”(这些术语在本文中可互换使用)。在一些实施例中，孔与钮具有一致或相似的尺寸且经适当定位以使得当两个界面相互作用时，一个界面的钮可位于另一界面的相应孔中。不希望受理论束缚，认为这可使异源多聚体稳定且有利于形成异源多聚体而非其他物质，例如同源多聚体。在一些实施例中，此方法可用于促进两个不同的免疫球蛋白多肽的异源多聚，从而产生包含对不同的抗原决定基具有结合特异性的两个免疫球蛋白多肽的双特异性抗体。

在一些实施例中，可通过将小氨基酸侧链置换为较大侧链来构筑钮状结构。在一些实施例中，可通过将大氨基酸侧链置换为较小侧链来构筑孔状结构。钮状结构或孔状结构可存在于原始界面中，或可用合成方式将其引入。例如，钮状结构或孔状结构可通过改变编码界面的核酸序列以便将至少一个“原始”氨基酸残基置换为至少一个“输入”氨基酸残基而以合成方式引入。用于改变核酸序列的方法可包括此项技术中众所周知的标准分子生物学技术。各种氨基酸残基的侧链体积示于下表中。在一些实施例中，原始残基具有小侧链体积(例如，丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸)，且用于形成钮状结构的输入残基为天然存在的氨基酸且可包括精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸。在一些实施例中，原始残基具有大侧链体积(例如，精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸)，且用于形成孔状结构的输入残基为天然存在的氨基酸且可包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及缬氨酸。

表1b.氨基酸残基的性质

^a氨基酸的分子量减水的分子量。来自Handbook of Chemistry and Physics,第43版,Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961的值。

^b来自Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972的值。

^c来自Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975的值。可及表面积定义于此参考文献的图6至图20中。

在一些实施例中，基于异源多聚体的三维结构来鉴定用于形成钮状结构或孔状结构的原始残基。此项技术中已知的用于获得三维结构的技术可包括X射线结晶学和NMR。在一些实施例中，该界面为免疫球蛋白恒定域的CH3结构域。在这些实施例中，人类IgG₁的CH3/CH3界面包括位于四个反向平行β链上的各结构域上的十六个残基。不希望受理论束缚，突变残基优选位于两个中心反向平行β链上以使钮状结构可能被周围溶剂而非搭配CH3结构域中的互补孔状结构容纳的风险最小化。在一些实施例中，形成两个免疫球蛋白多肽中的相应钮状结构和孔状结构的突变对应于下表中所提供的一个或多个配对。

表2.例示性相应钮形成突变和孔形成突变组

突变由原始残基，然后使用Kabat编号系统的位置，随后为输入残基来表示(所有残基均以单字母氨基酸代码给出)。多个突变由冒号分开。

在一些实施例中，免疫球蛋白多肽包含含有以上表2中列出的一个或多个氨基酸取代的CH3结构域。在一些实施例中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白多肽和第二免疫球蛋白多肽，该第一免疫球蛋白多肽包含含有表2左栏中所列出的一个或多个氨基酸取代的CH3结构域，该第二免疫球蛋白多肽包含含有表2右栏中所列出的一个或多个相应氨基酸取代的CH3结构域。作为钮孔形成配对的非限制性实例，在一些实施例中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白多肽和第二免疫球蛋白多肽，该第一免疫球蛋白多肽包含含有T366W突变的CH3结构域，该第二免疫球蛋白多肽包含含有T366S、L368A及Y407V突变的CH3结构域。

各半抗体可具有工程化至重链中的钮(突起)或孔(凹穴)，如美国专利第7,642,228号中所描述。简而言之，可首先产生CH3钮突变体。随后可通过随机化与搭配物CH3结构域上的钮状结构相邻的残基366、368及407来产生CH3孔突变体库。在某些实施例中，在IgG1或IgG4主链中，钮突变包含T366W，而孔突变包含T366S、L368A及Y407V。其他免疫球蛋白同型中的等效突变可由熟习此项技术者进行。此外，熟习此项技术者应容易了解，优选用于双特异性抗体的两个半抗体属于相同的同型。

第IV部分中提供用于产生多特异性(例如双特异性)抗体的例示性和非限制性技术。

涵盖具有超过两个原子价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuft等人,J.Immunol.147:60(1991)。

在一些实施例中，两条链的蛋白质为多特异性抗体或双特异性抗体的一部分。多特异性抗体或双特异性抗体可含有两个或更多个本发明的单价抗体。

在一些实施例中，双特异性抗体的第一抗原结合结构域包含一个或多个重链恒定域，其中该一个或多个重链恒定域系选自第一CH1(CH1₁)结构域、第一CH2(CH2₁)结构域、第一CH3(CH3₁)结构域；且双特异性抗体的第二抗原结合结构域包含一个或多个重链恒定域，其中该一个或多个重链恒定域系选自第二CH1(CH1₂)结构域、第二CH2(CH2₂)结构域及第二CH3(CH3₂)结构域。在一些实施例中，第一抗原结合结构域的一个或多个重链恒定域中至少一个与第二抗原结合结构域的另一重链恒定域配对。在一些实施例中，CH3₁和CH3₂结构域各自包含突起或凹穴，且其中CH3₁结构域中的突起或凹穴分别可位于CH3₂结构域中的凹穴或突起中。在一些实施例中，CH3₁和CH3₂结构域在该突起与凹穴之间的界面处相遇。CH3₁和CH3₂结构域中的例示性氨基酸取代组示于本文中的表2中。在一些实施例中，CH2₁和CH2₂结构域各自包含突起或凹穴，且其中CH2₁结构域中的突起或凹穴分别可位于CH2₂结构域中的凹穴或突起中。在一些实施例中，CH2₁和CH2₂结构域在该突起与凹穴之间的界面处相遇。在一些实施例中，根据如美国专利第8,216,805号的图5中所示的氨基酸编号，IgG的CH3₁和/或CH3₂结构域在选自由347、349、350、351、366、368、370、392、394、395、398、399、405、407及409组成的组的残基处含有一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，突起包含选自由以下项组成的组的一个或多个引入残基：精氨酸(R)残基、苯丙氨酸(F)残基、酪氨酸(Y)残基及色氨酸(W)残基。在一些实施例中，凹穴包含选自由以下项组成的组的一个或多个引入残基：丙氨酸(A)残基、丝氨酸(S)残基、苏氨酸(T)残基及缬氨酸(V)残基。在一些实施例中，CH3和/或CH2结构域来自IgG(例如IgG1亚型、IgG2亚型、IgG2A亚型、IgG2B亚型、IgG3亚型或IgG4亚型)。在一些实施例中，双特异性抗体的一个CH3结构域包含氨基酸取代T366Y，而另一CH3结构域包含氨基酸取代Y407T。在一些实施例中，一个CH3结构域包含氨基酸取代T366W，而另一CH3结构域包含氨基酸取代Y407A。在一些实施例中，一个CH3结构域包含氨基酸取代F405A，而另一CH3结构域包含氨基酸取代T394W。在一些实施例中，一个CH3结构域包含氨基酸取代T366Y和F405A，而另一CH3结构域包含氨基酸取代T394W和Y407T。在一些实施例中，一个CH3结构域包含氨基酸取代T366W和F405W，而另一CH3结构域包含氨基酸取代T394S和Y407A。在一些实施例中，一个CH3结构域包含氨基酸取代F405W和Y407A，而另一CH3结构域包含氨基酸取代T366W和T394S。在一些实施例中，一个CH3结构域包含氨基酸取代F405W，而另一CH3结构域包含氨基酸取代T394S。突变由原始残基，然后使用Kabat编号系统的位置，随后为输入残基来表示。也参见美国专利第8,216,805号的图5中的编号。

单结构域抗体

在一些实施例中，本发明的抗体为单结构域抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变域或者全部或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体为人类单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，Mass.；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。在一个实施例中，单结构域抗体由抗体的全部或部分重链可变域组成。

抗体变异体

在一些实施例中，涵盖本文中所描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改良抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可通过将适当变化引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变异体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可对缺失、插入和取代进行任何组合以获得最终构筑体，限制条件为该最终构筑体具有所需特征。可在制造序列时在目标抗体氨基酸序列中引入氨基酸变化。

Fc区变异体

在某些实施例中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文中所提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变异体。Fc区变异体可包含在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)的人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

在某些实施例中，本发明设想具有一些而非所有效应功能，由此使其成为活体内抗体半衰期重要但某些效应功能(诸如补体和ADCC)不必要或不利的应用的理想候选物的抗体变异体。可进行活体外和/或活体内细胞毒性分析以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表3中。用于评定相关分子的ADCC活性的活体外分析的非限制性实例描述于以下文献中：美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；第5,821,337号(参见Bruggemann等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。替代地，可采用非放射性分析法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性分析法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA；及CytoTox非放射性细胞毒性分析法(Promega，Madison，WI)。可用于此种分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地，或另外地，可在活体内，例如在诸如Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型的动物模型中评定相关分子的ADCC活性。也可进行C1q结合分析以证实抗体不能够结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评定补体活化，可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可使用此项技术中已知的方法来进行FcRn结合和活体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应功能的抗体包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中的一个或多个处具有取代的抗体(美国专利第6,737,056号)。此种Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297及327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。

描述对FcR具有改良或减弱的结合的某些抗体变异体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)

在某些实施例中，抗体变异体包含具有一个或多个改良ADCC的氨基酸取代，例如Fc区298位、333位和/或334位的取代(EU残基编号)的Fc区。在例示性实施例中，抗体在其Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。

在一些实施例中，在Fc区中进行引起C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改良或减弱)的变化，例如，如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。

具有增加的半衰期且对负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))的新生儿Fc受体(FcRn)具有改良的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人))中。那些抗体包含其中具有一个或多个改良Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。此种Fc变异体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代，例如对Fc区残基434的取代的那些Fc变异体(美国专利第7,371,826号)。关于Fc区变异体的其他实例，也参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO 94/29351。

抗体衍生物

本发明的抗体可经进一步修饰以含有此项技术中已知且容易获得的额外非蛋白质部分。在某些实施例中，适用于对该抗体进行衍生化的部分为水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚合物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支的或非分支的。连接至抗体的聚合物数目可变化，且若连接多于一个聚合物，则其可为相同或不同的分子。一般而言，可基于诸多考虑来决定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于欲改良的特定抗体性质或功能、抗体衍生物是否将在所限定的条件下用于疗法中等等。

III.细胞培养物

本文中提供细胞培养物，其包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的HEK293细胞系(例如经分离的HEK293细胞系)。本发明的HEK293细胞系(包括以上第II部分中所描述的例示性细胞系)中的任一者可用于本发明的细胞培养物中。

在一些实施例中，本发明的细胞培养物包含多个本发明的HEK293细胞和细胞培养基。适用于培养HEK293细胞的细胞培养基在此项技术中为已知的且可购自市面；参见例如FreeStyle^TM293表达培养基(Gibco)、Expi293^TM表达培养基(Gibco)及ATCC调配的Eagle氏最低必需培养基(ATCC目录号30-2003)，任选地补充有血清。细胞培养基可根据需要补充有激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能量源。也可以适当浓度包括任何其他必需补充剂。

在一些实施例中，细胞培养物的细胞处于足以用于35L生物反应器培养物的细胞培养密度下。例如，在一些实施例中，细胞培养物的细胞在足以用于35L生物反应器培养物的细胞密度维持7、14、21、30、45或60天。在一些实施例中，细胞培养物的细胞处于介于约0.4×10⁶个细胞/mL与约6×10⁶个细胞/mL之间的细胞密度(例如在分批饲喂培养物中)。在一些实施例中，细胞培养物的细胞处于介于约0.4×10⁶个细胞/mL与约1.0×10⁸个细胞/mL之间的细胞密度(例如在灌流培养物中)。

在一些实施例中，本发明的细胞培养物在暴露于2.67×10⁷W/m³能量耗散率(EDR)的剪切应力之后维持超过50％、超过60％或超过75％细胞存活率。在某些实施例中，本发明的细胞培养物在暴露于2.67×10⁷W/m³能量耗散率(EDR)的剪切应力之后维持超过75％细胞存活率。在一些实施例中，本发明的细胞培养物的细胞在暴露于2.67×10⁷W/m³能量耗散率(EDR)的剪切应力之后维持低于50％、低于45％、低于40％、低于35％或低于30％总溶解。用于使细胞暴露于剪切应力的例示性分析法包括但不限于使细胞通过流动收缩装置(FCD；Ma等人,(2002)Biotechnol.Bioeng.75:197-203；及Mollet等人,(2007)Biotechnol.Bioeng.98:772-788)。

在一些实施例中，本发明的细胞培养物的细胞在暴露于1μM星形孢菌素70小时之后维持超过50％、超过60％、超过75％或超过80％细胞存活率。在一些实施例中，本发明的细胞培养物的细胞在暴露于1μM星形孢菌素60小时之后维持超过70％、超过75％、超过80％或超过85％细胞存活率。在一些实施例中，本发明的细胞培养物的细胞在暴露于1μM星形孢菌素50小时之后维持超过80％、超过85％或超过90％细胞存活率。在某些实施例中，本发明的细胞培养物的细胞在暴露于1μM星形孢菌素70小时之后维持超过75％细胞存活率。

在一些实施例中，本发明的细胞培养物(例如，包含产生如本文中所描述的重组多肽的本发明的HEK293细胞系)在7天内以至少约500mg/L、至少约550mg/L、至少约600mg/L或约600mg/L的效价产生重组多肽(例如抗体，诸如人类IgG1抗体)。在某些实施例中，本发明的细胞培养物(例如，包含产生如本文中所描述的重组多肽的本发明的HEK293细胞系)在7天内以约650mg/L的效价产生重组多肽。在一些实施例中，用编码重组多肽的重组多核苷酸瞬时转染HEK293细胞系。在一些实施例中，细胞培养物为30mL细胞培养物(例如以约2×10⁶个细胞/mL接种)。

IV.产生方法

本文中提供产生重组多肽的方法，包括在适合产生多肽的条件下培养包含编码重组多肽的多核苷酸的本发明的HEK293细胞系。本文中也提供产生病毒载体的方法，包括在适合产生病毒载体的条件下培养包含病毒基因组及一种或多种编码病毒壳的多核苷酸的本发明的HEK293细胞系。

本发明的细胞系(例如，如第II部分中所描述)或本发明的细胞培养物(例如，如第III部分中所描述)中的任一者皆可用于本发明的方法中。例如，在一些实施例中，细胞系为包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的HEK293细胞系。

在一些实施例中，在细胞培养基中培养本发明的细胞系。例示性和非限制性细胞培养基和细胞培养基的描述提供于以上第III部分中。

在一些实施例中，在介于约6.7与约7.3之间、介于约6.8与约7.2之间、介于约6.9与约7.1之间、介于约6.95与约7.05之间或约7的pH培养本发明的细胞系。在某些实施例中，在7.0的pH设定点与±0.03的不感带下培养本发明的细胞系。在一些实施例中，用CO₂作为酸和1M碳酸钠作为碱来控制培养物pH。

在一些实施例中，在约30％的溶解氧(DO)设定点培养本发明的细胞系。在一些实施例中，用空气和纯氧气经由开放管式喷雾器鼓泡来控制培养物DO。

在一些实施例中，在施加约13W/m³的功率输入/体积(P/V)的搅拌速率下培养本发明的细胞系。可使用下式计算功率输入/体积：

其中

P_no＝功率数值(叶轮几何结构特有)

N＝搅拌速率(转数/秒)

D＝叶轮直径(m)

ρ＝液体密度(kg/m^3)

V＝工作体积(m^3)

在一些实施例中，以至少约10L、至少约15L、至少约20L、至少约25L、至少约30L、至少约35L、至少约50L、至少约60L、至少约75L或约100L的体积培养本发明的细胞系。在一些实施例中，以介于约10L与约35L之间、介于约15L与约35L之间、介于约20L与约35L之间、介于约25L与约35L之间、介于约35L与约100L之间或介于约10L与约100L之间的体积培养本发明的细胞系。在一些实施例中，在具有至少约10L、至少约15L、至少约20L、至少约25L、至少约30L或至少约35L的体积的生物反应器中培养本发明的细胞系。在一些实施例中，以至少约20L、至少约25L、至少约30L或至少约35L的工作体积培养本发明的细胞系。在一些实施例中，以介于约10L与约35L之间、介于约15L与约35L之间、介于约20L与约35L之间或介于约25L与约35L之间的工作体积培养本发明的细胞系。设想以上生物反应器体积和工作培养物体积的所有组合，条件为生物反应器体积大于或等于工作体积。例如，在某些实施例中，在35L生物反应器培养物中以介于约20L与约35L之间的工作体积培养细胞系。

在一些实施例中，将本发明的细胞系培养至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少35天、至少50天或至少60天。在一些实施例中，将本发明的细胞系培养7天、14天、21天、28天、35天、50天或60天。设想以上生物反应器体积、工作培养物体积和培养持续时间的所有组合，条件为生物反应器体积大于或等于工作体积。在一些实施例中，在35L生物反应器培养物中将本发明的细胞系培养至少35天、至少50天或至少60天。在某些实施例中，在35L生物反应器培养物中将本发明的细胞系培养60天。在一些实施例中，在35L生物反应器培养物中将细胞系培养60天之后，本发明的细胞培养物维持至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％细胞存活率。在某些实施例中，在35L生物反应器培养物中将细胞系培养60天之后，本发明的细胞培养物维持至少85％细胞存活率。

在一些实施例中，在分批饲喂培养条件下培养本发明的细胞系。在分批饲喂培养下，在培养期间将一种或多种化合物或营养物添加至细胞培养物中。在产生之后，收集培养物并回收产物。

在一些实施例中，在灌流培养条件下培养本发明的细胞系。在灌流培养下，将新鲜培养基馈入培养物中，并连续移除废物/副产物。已知灌流培养物允许在高于分批饲喂培养的细胞密度进行培养。

在一些实施例中，本发明的方法进一步包括从本发明的细胞系分离产物，例如重组多肽和/或病毒载体。下文更详细描述产物分离和纯化的例示性及非限制性方法。

下文以非限制性方式描述细胞培养物和重组多核苷酸/多肽产生的技术。

选择和转染宿主细胞

可在培养期间通过各种方式，包括使用以上第II部分中所描述的例示性选择标志物来选择宿主细胞。

适用于转染人类细胞系(例如，HEK293细胞系)的技术在此项技术中为已知的。在一些实施例中，通过使用聚乙烯亚胺(PEI)将DNA引入细胞中来转染HEK293细胞。用于对HEK293细胞进行PEI转染的例示性方法描述于本文中且在此项技术中为已知的(参见例如www.addgene.org/protocols/transfection/)。

培养宿主细胞

可在多种培养基中培养本发明的宿主细胞。市售培养基，诸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良Eagle氏培养基((DMEM)，(Sigma)适合培养宿主细胞。另外，可使用以下文献中所描述的培养基中的任一者作为宿主细胞的培养基：Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再版专利30,985。这些培养基中的任一者皆可根据需要补充有激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能量源。

生物学活性多肽的纯化

可使用例如羟磷灰石层析、疏水性相互作用层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的重组多肽(例如抗体)组成物，其中亲和层析为通常优选纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配位体的适合性根据抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同型而定。蛋白A可用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同型和人类γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配位体所连接的基质最通常为琼脂糖，但可利用其他基质。机械上稳定的基质，诸如受控孔隙玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含C_H3结构域时，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)适用于纯化。根据欲回收的抗体，也可利用其他蛋白质纯化技术，诸如在离子交换管柱上分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅上层析、在肝素SEPHAROSE^TM上层析、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸管柱)上层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

一般而言，用于制备供研究、测试和临床使用的抗体的各种方法为此项技术中充分确立的，与以上描述的方法一致和/或由熟习此项技术者认为适于特定相关抗体。

纯化病毒载体

根据例如所产生的病毒载体的类型，可使用各种方式纯化由细胞制备的病毒载体。纯化病毒载体制剂是指缺乏粒子天然存在或最初制备时也可能存在的其他组分中的至少一些的病毒载体/粒子制剂。因而，例如，可使用纯化技术使其相对于来源混合物(诸如培养物溶解物或生产培养物上清液)增浓来制备经分离的病毒载体/粒子。可用多种方式测量增浓，诸如通过溶液中存在的DNA酶抗性粒子(DRP)或基因组复本(gc)的比例，或通过感染性，或者其可相对于来源混合物中存在的第二潜在干扰物质(诸如污染物，包括生产培养物污染物或过程中污染物，包括辅助病毒、培养基成分及其类似物)加以测量。

众多用于产生腺病毒载体/粒子的方法在此项技术中为已知的。例如，对于肠腺病毒载体，可将腺病毒载体基因组和辅助腺病毒基因组转染至包装细胞系(例如293细胞系)中。在一些实施例中，辅助腺病毒基因组可含有侧接其包装信号的重组位点，且两个基因组皆可转染至表达重组酶的包装细胞系中(例如，可使用Cre/loxP系统)，从而比辅助腺病毒更有效地包装相关腺病毒载体(参见例如Alba,R.等人,(2005)Gene Ther.12增刊1:S18-27)。可例如通过人类293细胞的三质体共转染来产生AAV载体，如先前所描述(Xiao等人,(1998)J.Virol.72:2224-2232)。对于例示性分离/纯化方法，可如先前所描述对AAV载体进行管柱纯化(Passini等人,(2001)J.Virol.75:12382-12392)。

用于产生慢病毒载体/粒子的众多方法在此项技术中为已知的。例如，对于第三代慢病毒载体，可将含有相关慢病毒基因组与gag和pol基因的载体连同含有rev基因的载体一起共转染至包装细胞系(例如293细胞系)中。相关慢病毒基因组也含有在不存在Tat时促进转录的嵌合LTR(参见Dull,T.等人,(1998)J.Virol.72:8463-71)。可使用各种方法收集并纯化慢病毒载体(例如Segura MM等人,(2013)Expert Opin Biol Ther.13(7):987-1011)。

用于产生HSV粒子的众多方法在此项技术中为已知的。可使用标准方法收集并纯化HSV载体/粒子。例如，对于复制缺陷型HSV载体，可将缺乏所有立即早期(IE)基因的相关HSV基因组转染至提供病毒产生所需的基因(诸如ICP4、ICP27和ICP0)的互补细胞系中(参见例如Samaniego,L.A.等人,(1998)J.Virol.72:3307-20)。可使用多种方法收集并纯化HSV载体(例如Goins等人,(2014)Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology1144:63-79)。

实例

通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，这些实例不应被视为限制本发明的范畴。应理解，本文中描述的实例和实施例仅用于说明性目的，且根据其进行的各种修改或变化将建议给熟习此项技术者并且将包括在本申请案的精神和权限以及所附申请专利范围的范畴内。

实例1：产生并测试更稳定的HEK293细胞系

如以上所描述，当在生物反应器中培养时，HEK293细胞对剪切应力敏感且倾向于产生低存活率。假定对细胞凋亡具有抗性的细胞系在生物反应器中将展现较高生产率和更稳定效能。通过使用锌指核酸酶技术使促细胞凋亡基因Bax和Bak缺失对抗细胞凋亡HEK293细胞系(HEK293 DKO)进行工程化(Cost等人,(2010)Biotechnol.Bioeng.105:330-340)。在细胞凋亡期间，Bax和Bak渗透线粒体膜，最终引起凋亡蛋白酶蛋白活化，从而触发程序性细胞死亡(Taylor等人,(2008)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:231-241)。先前已显示CHO细胞系中缺失Bax和Bak与更高培养物存活率及转染效价相关(Macaraeg等人,(2013)Biotechnol.Prog.29:1050-1058)。已报告利用抑制或缺失Bax和Bak提高培养物存活率及生产率(Cost等人,(2010)Biotechnol.Bioeng.105:330-340；Lim等人,(2006)Metab.Eng.8:509-522；Grav等人,(2015)Biotechnol.J.10:1446-1456)。这些研究报告与野生型相比在CHO DKO生产培养物中观测到更高存活率(Cost等人,(2010)Biotechnol.Bioeng.105:330-340；Macaraeg等人,(2013)Biotechnol.Prog.29:1050-1058；Lim等人,(2006)Metab.Eng.8:509-522)、更高DNA摄取水平(Macaraeg等人,(2013)Biotechnol.Prog.29:1050-1058)、更高转染效率(Macaraeg等人,(2013)Biotechnol.Prog.29:1050-1058)、更大线粒体质量(Misaghi等人,(2013)Biotechnol.Prog.29:727-737)以及改良的线粒体膜电位(Misaghi等人,(2013)Biotehcnol.Prog.29:727-737)。

测试并表征HEK293 DKO，以便产生在生物反应器中展现更高生产率和稳定效能的HEK293细胞系。

方法

细胞培养物

通过使用锌指核酸酶技术(Cost等人,(2010)Biotechnol.Bioeng.105:330-340)来产生HEK293 DKO细胞系。使用表1中的种子培养基如先前所描述(Bos等人,(2015)Biotechnol.Bioeng.112:1832-1842)在摇瓶中将HEK293细胞和HEK293 DKO细胞培养为种子培养物。

表1.用于HEK293和HEK293 DKO瞬时转染的种子培养基和生产培养基.

星形孢菌素分析

将摇瓶中的HEK293和HEK293 DKO种子培养物以0.8×10⁶个细胞/mL接种且未加处理或用1μM星形孢菌素(Sigma，目录号S6942)处理。每天对培养物取样以得到存活率。

流动收缩装置(FCD)

使用FCD(Mollet等人,(2007)Biotechnol.Bioeng.98:772-788)评定剪切应力对HEK293和HEK293 DKO细胞的影响。简而言之，使用注射泵(Harvard Apparatus，型号33)使细胞以70mL/min的流速或2.67×10⁷W/m³的能量耗散速率(EDR)通过FCD。在通过FCD之前，将全细胞样品(阳性对照)用含0.2g/L皂苷(Amresco，目录号0163)的水进行1:1稀释以溶解细胞并储存在-80℃下。通过FCD之后，将培养物以830×g离心且用0.2g/L皂苷对上清液进行1:1稀释并储存在-80℃下。将样品解冻并使用Cedex Bio HT分析仪(Roche)分析乳酸盐脱氢酶(LDH)。使用以下方程式1计算FCD后的总溶解(％)。在通过FCD前后，也对培养物取样以得到活细胞密度(VCD)和存活率。

转染

在50mL旋转管或125mL摇瓶中以30mL工作体积、在22L波状袋中以10L工作体积或在ambr15微生物反应器中以12mL工作体积进行瞬时转染。

对于30mL转染，将细胞以2×10⁶个细胞/mL接种于50mL旋转管(OptimumProcessing，目录号SV92050)或125mL无挡板摇瓶(Corning，目录号431143)中的25.5mL生产培养基(参见表1)中，并且平衡2小时，随后在分别处于225rpm与50mm轨道直径下(Kuhner，型号ISF1-X)或处于125rpm与25mm轨道直径下(例如Kuhner，Innova)的振荡培育箱中在37℃、5％CO₂下进行转染。使用编码标准人类IgG1(huIgG1)抗体的DNA进行所有转染。为了转染，将所指示量的DNA和7.5mM 25kDa线性PEI(Polyplus-transfection，目录号101)在3mL无血清培养基(例如，Opti-MEM I减血清培养基(ThermoFisher，目录号31985062))中培育15分钟，随后添加至平衡的细胞。转染后24小时添加2.6mL含有水解产物、氨基酸和盐以及葡萄糖的溶液。针对更小或更大工作体积按比例缩放此过程。

细胞计数、效价和产物品质测量

每1至4天对培养物取样以得到活细胞密度(VCD)、存活率、代谢产物、pH和/或气体，并使用Vi-CELL细胞计数器(Beckman Coulter)、BioProfile FLEX分析仪(NovaBiomedical)或ABL90 FLEX(辐射仪)进行测量。使用蛋白A HPLC分析测定上清液样品的HuIgG1抗体效价。分别使用尺寸排阻HPLC、成像毛细管等电聚焦(icIEF)和亲水性相互作用液相层析(HILIC)HPLC测定HuIgG1抗体产物质量属性，包括聚集水平、酸性和碱性变异体以及各种糖型。

N:P实验

如以上所描述进行转染。为了确定产生最高效价的条件，全因子实验测试PEI:DNA(N:P)比率5、7.5、10和12.5以及DNA浓度0.75、1.0、1.25和1.5μg/mL。N:P比率7.5和DNA浓度1μg/mL产生最高效价(图2A)，且因此用于所有后续转染。

2L和35L生物反应器种子培养

在两个受控2L生物反应器(Applikon)中将HEK293 DKO细胞培养为种子培养物，维持25天。第1号生物反应器使用pH设定点7.0与不感带±0.03及DO设定点30％空气饱和度，而第2号生物反应器使用pH设定点7.0与不感带±0.4及DO设定点60％空气饱和度。使用CO₂作为酸和1M碳酸钠作为碱来控制培养物pH，并且用空气和纯氧气经由开放管式喷雾器鼓泡来控制DO。将温度维持在设定点37℃，且使用斜叶式叶轮以275rpm搅拌。

随后，使用pH设定点7.0与不感带±0.03及DO设定点30％空气饱和度，在35L生物反应器(Chemglass)中将HEK293 DKO细胞培养为种子培养物，维持60天。控制培养物pH及DO与2L生物反应器中相同。将温度维持在设定点37℃，且使用平叶式叶轮以50rpm搅拌。

ambr15微生物反应器系统

如以上所描述，在ambr15微生物反应器系统(Sartorius Stedim Biotech；参见Hsu,W.T.等人,(2012)Cytotechnology 64:667-678)中在12mL最终工作体积、温度设定点37℃和DO设定点30％空气饱和度下进行转染。重复实验中4个案例的全因子实验评估搅拌速率630相对于1400rpm(使用斜叶式叶轮)和设定点7.0附近的pH不感带±0.03相对于±0.3。使用CO₂作为酸和0.5M碳酸钠作为碱来控制培养物pH，并且用空气和纯氧气经由鼓泡管鼓泡来控制DO。每1至2天，向各ambr15生物反应器添加消泡剂(Dow Corning)。

波状袋生物反应器系统

波状袋生物反应器系统由加热摇动平台(GE Healthcare，型号20/50EHT)、气体混合箱(Dasgip，型号MX4/4)及具有入口和出口气体过滤器以及取样口的22L标称体积波状袋(例如，Thermo或Meissner；定制物品)组成。如以上所描述在10L最终工作体积、37℃温度设定点、20rpm摇动速率、8°摇摆角度和无直接pH控制下，在流速为27标准公升/小时(slph)的5％CO2/空气的气体覆盖下进行转染。

结果

测试HEK293 DKO细胞系对进行细胞凋亡的敏感性和其对剪切应力的敏感性。为了诱导细胞凋亡，将星形孢菌素添加至HEK293和HEK293 DKO培养物。在星形孢菌素添加后，HEK293 DKO细胞与HEK293细胞相比维持较高存活率(图1A)。由此，推断HEK293 DKO细胞对细胞凋亡更具抗性。

为了评定剪切应力的影响，使HEK293和HEK293 DKO培养物通过流动收缩装置(FCD；Ma等人,(2002)Biotechnol.Bioeng.75:197-203；Mollet等人,(2007)Biotechnol.Bioeng.98:772-788)。FCD通过使细胞以受控流速通过狭窄流动通道而使细胞经受急剧水动力和等效于2.67×10⁷W/m³能量耗散速率(EDR)的增高剪切应力。在流过FCD之后，HEK293 DKO细胞与HEK293细胞相比展现更高细胞密度、更高存活率和减少的溶解(图1B至图1D)，指示HEK293 DKO细胞与HEK293细胞相比对剪切应力更具抗性。因而，HEK293 DKO细胞系因缺失Bax和Bak而显示所需表型性质。

PEI(N)与DNA(P)的比率以及PEI和DNA的量可显著影响瞬时转染生产率(Delafosse等人,(2016)J.Biotechnol.227:103-111；Macaraeg等人,(2013)Biotechnol.Prog.29:1050-1058；Choosakoonkriang等人,(2003)Journal ofPharmaceutical Sciences 92:1710-1722；Bertschinger等人,(2008)Mol.Biotechnol.40:136-143)。为了确定产生最高效价的HEK293 DKO瞬时转染条件，将30mL旋转管生产培养物以2×10⁶个细胞/mL接种，并且进行全因子实验以测试众多N:P比率(5、7.5、10和12.5)及DNA浓度(0.75、1.0、1.25和1.5μg/mL)。N:P比率7.5和DNA浓度1μg/mL产生最高效价(图2A)。

使用此优化条件，将HEK293 DKO瞬时转染效能与30mL旋转管中的HEK293进行比较。两种细胞类型在转染中显示类似的生长和存活率，其中HEK293 DKO和HEK293培养物的最后一日存活率分别为68.5％和74.9％(图2B)。此表明这些转染培养物中的存活率下降是由坏死而非细胞凋亡诱致。关于生产率，HEK293 DKO培养物表达比HEK293培养物高40％的效价(图2C)。不希望受理论束缚，认为生产率差异可能由于剪切应力对HEK293培养物的次致死作用或缺失Bax和Bak的生物学作用所致。优化N:P比率7.5和DNA浓度1μg/mL用于所有进一步HEK293 DKO转染，以30mL规模作为按比例扩大/缩小的对照组。

总之，HEK293 DKO细胞系与HEK293亲本细胞系相比对细胞凋亡和剪切应力更具抗性。此性质使得HEK293 DKO细胞系有利于重组蛋白质的高通量瞬时生产以及潜在其他HEK293应用，诸如生技医物、病毒载体和疫苗的稳定生产。

实例2：按比例扩大HEK293种子培养

为了有效地产生细胞群以支持大规模(10L)转染，在35L受控生物反应器而非多个摇瓶中培养HEK293 DKO种子培养物。工作体积为20至35L的定期继代(即，每3至4天分裂一次)种子培养生物反应器将提供足以开始每周两次以2×10⁶个细胞/mL接种的40至70L转染的细胞。由此能够定期执行高通量大规模瞬时生产运作。

在35L生物反应器中测试HEK293 DKO种子培养物之前，首先在两个2L生物反应器中评估不同的pH和溶解氧(DO)受控条件。第1号生物反应器使用pH设定点7.0与不感带±0.03及DO设定点30％；这些为CHO稳定细胞系培养物的典型条件(Li等人,(2010)mAbs.2:466-477；Li等人,(2012)Biotechnol.Bioeng.109:1173-1186；Yuk等人,(2011)Biotechnology Progress 27:1397-1406)。第2号生物反应器使用pH设定点7.0与不感带±0.4及DO设定点60％以更紧密地趋向于摇瓶的pH及DO条件。同时在摇瓶和2L生物反应器中使HEK293 DKO细胞每3至4天继代，总计25天，并监测其生长和代谢产物。

两个2L生物反应器HEK293 DKO种子培养与摇瓶种子培养相比皆生长至类似的峰值细胞密度且维持类似的存活率(图3A)。这与种子培养的类似葡萄糖消耗和乳酸盐产生相关(图3B)。第2号生物反应器显示与摇瓶类似的pH和DO趋势(图3C和图3D)。每周使用来自种子培养的细胞进行30mL旋转管转染，维持4周。令人感兴趣的是，与源自于摇瓶种子培养的细胞的效价相比，从源自于模拟摇瓶pH和DO条件的第2号生物反应器的细胞观测到适度较低效价，且从源自于在更紧密控制下的第1号生物反应器的细胞观测到类似效价(图3E)。摇瓶种子培养中的不同混合可解释细胞的高生产率。在生物反应器中，有可能狭窄pH不感带条件影响种子培养细胞和/或其废培养基，从而使其更顺应于转染。这可能需要进行生物学修饰以便(1)在瞬时转染过程中使DNA/PEI复合物与细胞表面发生更多最佳静电荷相互作用；(2)促进DNA/PEI复合物细胞内运输至细胞核；或(3)增强重组蛋白质的转录、转译和分泌。

随后，使用第1号生物反应器条件(pH设定点7.0与狭窄不感带±0.03及DO设定点30％)且匹配我们的2L生物反应器的功率输入/体积(13W/m³)将HEK293 DKO种子培养按比例扩大至35L生物反应器。同时使HEK293 DKO摇瓶和35L生物反应器种子培养物每3至4天继代，总计60天，并定期监测其生长和代谢产物。尽管HEK293 DKO细胞显示相当的转染生产率直至解冻后150天，但针对生物反应器选择60天持续时间以平衡生物反应器开启/启动的频率(劳力密集型操作)，从而确保生物反应器玻璃壁上的细胞碎片不会因在生物反应器中连续继代而在液体-空气界面处积聚。这与每次继代皆使用新摇瓶的摇瓶种子培养程序相反。

生物反应器HEK293 DKO种子培养与摇瓶种子培养相比达成稍高峰值细胞密度和较低存活率(图4A)。正如所料，由于pH控制，生物反应器种子培养比摇瓶消耗更多葡萄糖且产生更多乳酸盐(图4B)。该葡萄糖消耗不同于2L生物反应器种子培养(图3B)且可能由于规模差异所致，包括鼓泡和混合。除了生物反应器继代期间的pH尖峰外，生物反应器种子培养维持其pH处于7.0，不感带为±0.03(图4C)。生物反应器维持其DO设定点30％，趋势类似于类似的2L生物反应器。每周将来自种子培养的细胞用于30mL旋转管转染，持续9周。尽管生物反应器种子培养与摇瓶种子培养之间存在以上指出的差异，但在转染9周后，源自于摇瓶和35L生物反应器的细胞产生类似的效价(图4D)和产物品质(图4E至图4N)。HEK293 DKO细胞系在种子培养生物反应器中展现稳定效能。生物反应器种子培养生长至峰值细胞密度，使得能够使用≤50％种子培养物来接种生产培养物(以2×10⁶个细胞/mL)，由此将生产中的废培养基体积减至最少。携带>50％废培养基与种子培养物至生产中显示对瞬时蛋白质表达具有负面影响(Tuvesson等人,(2008)Cytotechnol.56:123-136)。

这些数据显示，可在35L生物反应器中培养HEK293 DKO种子培养物直至60天以提供每周转染。这为描述以试验规模(35L)在搅拌罐式受控生物反应器中长期培养HEK293种子培养物的第一报告。尽管有报告称在1.8L生物反应器中培养HEK293细胞10天(Liste-Calleja等人,(2015)Appl.Microbiol.Biotechnol.99:9951-9960)，但本文中显示的种子培养策略支持35L培养长达60天，从而提供常规高通量大规模瞬时转染。

许多手稿描述由以高密度接种的转染达成高效价(Rajendra等人,(2015)Biotechnol.Bioeng.112:977-986；Backliwal等人,(2008)Biotechnol.Bioeng.99:721-727；Rajendra等人,(2011)J.Biotechnol.153:22-26；Blaha等人,(2015)ProteinExpr.Purif.109:7-13；Sun等人,(2008)Biotechnol.Bioeng.99:108-116；Jain等人,(2017)Protein Expr.Purif.134:38-46)。然而，在这些报告中，生产培养物在不同的日期多次接种或稀释并依赖于离心和培养基交换来获得高培养物密度。这不同于本文中所描述的仅在转染当天通过用培养基稀释种子培养物来接种生产培养物的转染方法(一种更有利于高通量操作的方法)。

实例3：优化及按比例扩大HEK293转染和产生

Ambr15生物反应器已用于CHO稳定细胞系方法开发(Wales和Lewis,(2010)Bioprocessing J.9:22-25)。然而，目前尚无报告描述ambr15生物反应器中HEK293培养物的转染生产条件的优化。

为了鉴定最佳参数并评定在受控生物反应器中转染HEK293 DKO细胞的可行性，如以上所描述在ambr15微生物反应器中以不同的搅拌和pH条件进行转染。重复实验中4个案例的全因子实验评估搅拌速率630相对于1400及设定点7.0附近的pH不感带±0.03相对于±0.3。基于2种按比例扩大/缩小策略选择高搅拌和低搅拌(Hsu,W.T.等人,(2012)Cytotechnology 64:667-678)：(1)630rpm匹配2L生物反应器的功率输入/体积(P/V)(13W/m³)；以及(2)1400rpm匹配2L生物反应器的最大剪切力(以叶轮尖端速度表示)(0.26m/s)。选择pH不感带来模拟生物反应器和摇瓶条件。监测转染培养物的生长和代谢物。由于设备限制，对于对照案例，使用30mL摇瓶替代旋转管。

在30mL规模下，摇瓶和旋转管产生相当的效价(数据未显示)。较高活细胞密度和存活率与在630rpm下进行ambr搅拌和pH控制在严格±0.03pH不感带附近相关(图5A)。尽管所有容器间具有类似的葡萄糖消耗，但ambr生物反应器培养物与摇瓶培养物相比具有较低最终乳酸盐水平(图5B)，指示HEK293 DKO细胞的代谢与pH控制不同：乳酸盐在接近生产结束时消耗。由于较少碱添加，宽pH不感带±0.3与较低渗透压度水平相关且显示与摇瓶培养物类似的pH趋势(图5C)。正如所料，氧含量最高且最类似于在1400rpm下进行ambr搅拌的摇瓶(图5D)。在ambr生物反应器中，在630rpm搅拌及宽pH不感带±0.30下出现最高产率(图5E)。不希望受理论束缚，认为这些较高效价可能由于(1)在630rpm下剪切应力水平较低，从而允许DNA/PEI复合物在转染过程中与细胞发生更多最佳相互作用或对蛋白质表达更有益的条件；以及(2)宽±0.3pH不感带，从而引起碱添加减少，从而在接近生产结束时维持pH值，这与较低渗透压度和较低最终乳酸盐直接相关。

接下来，已知宽±0.3pH不感带与ambr生物反应器中的高产率相关，故按比例扩大HEK293 DKO细胞的转染并且在10L波状袋及30mL旋转管中在无直接pH控制的情况下进行评估。在无直接pH控制的情况下，在5％CO₂/空气的气体覆盖下操作波状袋和旋转管。监测转染培养物的生长和代谢物。

30mL旋转管中的经转染细胞与10L波状袋相比达到更高的细胞密度与更高的最终存活率(图6A)。然而，这些细胞计数可能因细胞凝块而混淆。HEK293 DKO 10L波状袋转染与30mL旋转管培养物相比显示更显著凝块(数据未显示)、更高的最后一天乳酸盐水平(图6B)和更低的氧含量(图6D)。尽管细胞凝块、乳酸盐和氧存在差异，但来自两种容器类型的细胞以类似的速率消耗葡萄糖(图6B)，展现类似的渗透压度和pH概况(图6C)，且产生相当的最终效价(图6E)。这些数据显示，HEK293 DKO转染方法在大规模10L波状袋和30mL旋转管中产生类似的效价。使用所描述的波状袋系统替代搅拌罐式生物反应器用于生产消除了对探针和在线测量以及在生产运行之间进行清洁和灭菌步骤的需要。这为执行高通量大规模转染以产生用于生技医药研究工作以鉴定治疗候选物的材料提供重要资源节约和操作益处。

总之，本文中所描述的优化HEK293 DKO 35 L生物反应器种子培养和10L瞬时转染方法使得能够高通量产生重组蛋白质以支持鉴定治疗临床候选物的研究性研究。

已确定HEK293细胞的瞬时转染为快速产生用于抗体和大分子发现活动的重组蛋白质以鉴定治疗候选物的方法。通过缺失促细胞凋亡基因Bax和Bak对抗细胞凋亡HEK293细胞系进行工程化。HEK293 Bax Bak双敲除(HEK293 DKO)细胞系对细胞凋亡和剪切应力具有抗性，且该细胞可用于优化和实施35L生物反应器种子培养和10L高效价瞬时生产过程。当使用pH设定点7.0、狭窄pH不感带±0.03及DO设定点30％时，定期继代的生物反应器种子培养物(即，每3至4天分裂一次)最具生产力。35L生物反应器种子培养提供足以起始每周两次70L转染持续长达60天的细胞。认为这是在试验规模生物反应器中长期培养HEK293种子培养物以提供常规转染用来源细胞的首个报告。为了优化瞬时生产过程，使用ambr15微生物反应器测试pH和搅拌参数，且发现当使用pH设定点7.0、宽pH不感带±0.4和630rpm搅拌时出现最高效价。类似pH值靶向宽pH不感带，在无直接pH控制的情况下将瞬时生产过程按比例扩大至10L波状袋。所有测试规模下的HEK293 DKO瞬时转染在7天内产生高抗体效价，高达650mg/L。开发HEK293 DKO 35L生物反应器种子培养和10L高效价生产方法使得能够有效、高通量产生重组蛋白质以供研究和临床前研究用。