阅读说明：本技术 一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法 (Method for regulating gene expression at translation level by using rare codon ) 是由 霍毅欣 郑博 王宁 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：转录水平的基因表达调控需要严谨调控的启动子,同时要求启动子具有可诱导、可放大。现有基因表达调控系统诱导剂价格昂贵且需要特定培养基成分很难用于大规模发酵。将代谢途径基因中的氨基酸密码子替换成其稀有形式,可通过是否补加相应氨基酸实现该基因表达调控,诱导物相对廉价易得对细胞无毒害作用,可实现基因翻译水平更加精准的调控,减少泄露表达,且不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长。(The regulation of gene expression at the transcriptional level requires a strictly regulated promoter, while the promoter is required to be inducible and amplifiable. The existing gene expression regulation system inducer is expensive and needs specific culture medium components which are difficult to be used for large-scale fermentation. The amino acid codon in the metabolic pathway gene is replaced into a rare form, the gene expression regulation can be realized by whether corresponding amino acid is supplemented or not, the inducer is relatively cheap and easily available, has no toxic or harmful effect on cells, can realize more accurate regulation of gene translation level, reduces leakage expression, and does not interfere the expression of other genes and influence the normal growth of thalli.)

一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法

技术领域

本发明涉及一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

转录水平的基因表达调控需要严谨调控的启动子，同时要求启动子具有可诱导、可放大。现有基因表达调控系统诱导剂价格昂贵且需要特定培养基成分很难用于大规模发酵。

将代谢途径基因中的氨基酸密码子替换成其稀有形式，氨基酸缺乏条件下基因不表达，外源补加对应氨基酸可实现该基因表达。利用稀有密码子进行基因表达调控拥有诸多优势。首先，实现基因翻译水平更加精准的调控，减少泄露表达。其次，稀有密码子对基因表达的调控只作用于含有此密码子的基因中，不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长；而诱导物是氨基酸相对廉价易得，对细胞无毒害作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法，利用密码子偏好性和tRNA氨酰化水平的差异，在翻译水平上，简单有效地通过补加氨基酸实现基因表达调控，为代谢工程的基因表达调控提供新的方法。

按照本发明提供的技术方案，一种利用稀有密码子在翻译水平调控基因表达的方法，采用以下方法步骤：

1.需要确定所用菌株和所需调控的基因，确定所用菌株的密码子偏好性。

2.根据氨基酸密码子偏好性和调控基因序列，确定选用的氨基酸和其稀有密码子，将所需调控基因中的相应氨基酸的密码子替换为对应的稀有密码子，使用PCR方法重新人工合成此序列。

3.将步骤2中人工合成的基因序列与质粒载体连接，将连接产物化转至大肠杆菌中，经过PCR验证，挑选正确的单菌落，保存菌液，提取质粒。

4.将步骤3中得到的含正确质粒的菌株涂于平板上培养。

5.挑取单菌落接入培养基中，加入相应的氨基酸，检测调控基因表达量和菌体浓度。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、利用稀有密码子在翻译水平调控GFP表达的方法

以大肠杆菌DH5α(购于北京博迈德基因技术有限公司)为例，大肠杆菌DH5α翻译使用的亮氨酸密码子共有UUG，UUA，CUC，CUG，CUU和CUA六种，其中密码子CUA的使用频率最低(记载大肠杆菌密码子偏好性的非专利文献为Dong H,Nilsson L,Kurland C G.,1996，Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at differentgrowth rates.Journal of molecular biology,260(5):649-663.)。将绿色荧光蛋白GFP中的亮氨酸对应的密码子全部替换为稀有密码子CUA，采用基因全合成的方法得到序列1所示的绿色荧光蛋白基因。

基因全合成体系为：FastPfu Fly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物预混液2μL，FastPfu Fly DNA Polymerase 1μL,蒸馏水35μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20秒、55℃退火20秒、72℃延伸20秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增产物包含绿色荧光蛋白基因及其上下游各200个碱基，并将其连接到pGFP载体上。连接体系：1.5μL PCR扩增产物、1μL pGFP载体片段，7.5μL GibsonMaster Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μL DH5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激60秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。取200μL菌液涂于含有氯霉素的LB平板上，过夜培养后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明载体中***了新合成的绿色荧光蛋白及其上下游各200个碱基，证明质粒构建正确，保菌。

将上述保存的菌株涂氯霉素抗性平板，37℃过夜培养，隔天挑取单菌落接入5ml含有氯霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时，补加1g/L亮氨酸，每隔2小时取200ul菌液酶标仪检测GFP表达量、OD₆₀₀。