阅读说明：本技术 一种利用重组纳豆芽孢杆菌提高维生素k2产量的方法 (Vitamin K is improved by utilizing recombinant bacillus natto2Method of producing ) 是由 阮月敏 区文彩 陆阳 其他发明人请求不公开姓名 于 2020-01-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用重组纳豆芽孢杆菌提高维生素K<Sub>2</Sub>产量的方法,通过组成型启动子<I>P</I><Sub><I>43</I></Sub>在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达氟他洛辛合成酶基因mqnA,在得到的菌株NA1的基础上,利用P<Sub>43</Sub>启动子在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达去氧黄嘌呤氟他洛辛合成酶的基因,在得到的菌株NA2的基础上,利用<I>P</I><Sub><I>hbs</I></Sub>启动子替换纳豆芽孢杆菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶基因的天然启动子,在得到的菌株NA3的基础上,用含有<I>P</I><Sub><I>hbs</I></Sub>启动子的来源于天蓝色链霉菌的1,4-二羟基-6-萘甲酸合酶基因替换纳豆芽孢杆菌染色体上的异分支酸基因,将所述重组菌的种子液按照3%~6%的接种量接种到发酵培养基中。本发明构建得到4株重组菌NA1~NA4,其中NA3~NA4使得维生素K<Sub>2</Sub>的产量得到了显著提高。(The invention discloses a method for improving vitamin K by utilizing recombinant bacillus natto 2 Method for production by constitutive promoters P 43 Overexpresses flutamosin synthase gene mqnA on the chromosome of bacillus natto, and utilizes P on the basis of the obtained strain NA1 43 The promoter overexpresses the gene of deoxyxanthine flutamosin synthase on the chromosome of the bacillus natto, and utilizes the obtained strain NA2 P hbs The promoter replaces the natural promoter of the O-succinylbenzoic acid-CoA ligase gene in the Bacillus natto, and the gene is prepared by adding the promoter containing the gene of the obtained strain NA3 P hbs The promoter is derived from a1, 4-dihydroxy-6-naphthoic acid synthase gene of streptomyces coelicolor to replace an isochorismate gene on a bacillus natto chromosome, and a seed solution of the recombinant bacteria is inoculated into a fermentation culture medium according to the inoculation amount of 3% -6%. The 4 recombinant bacteria NA 1-NA 4 constructed by the invention are provided, wherein NA 3-NA 4 enable vitamin K 2 The yield of (a) is significantly improved.)

一种利用重组纳豆芽孢杆菌提高维生素K2产量的方法

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，特别涉及一种利用重组纳豆芽孢杆菌提高维生素K₂产量的方法。

背景技术

维生素K₂，是维生素K的活性体之一，是由一个甲基萘醌母环和n个异戊二烯侧链连接而成的一类重要的脂溶性维生素，作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，具有半衰期长，生物利用度好的特点。在抗动脉钙化及骨关节炎，抗肿瘤，抗氧化、延缓衰老、美肤养颜，治疗肝炎，调整消化道，缓解平滑肌痉挛，治疗和预防骨质疏松症，预防肝硬化进展为肝癌，治疗维生素K₂缺乏性出血症，利尿、强肝解毒，降低血压等方面起到重要作用。由于七烯甲萘醌对人体具有更好的亲和性和更长的半衰期，得到人们更多的关注。

维生素K是一系列化合物的总称，其核心结构是2-甲基-1,4-甲萘醌环，但是侧链结构的长度和饱和度有所不同。在纳豆芽孢杆菌中，分支酸可以在mqn基因簇的作用下形成骨架结构甲萘醌，mqn基因簇主要包括mqnF，mqnD，ytxM，mqnC，mqnE，mqnB，yuxO 7个酶。然后在1,4-二羟基-2-萘甲酸七戊烯基转移酶（mqnA）的作用下生成去甲基甲萘醌-7，最后在甲萘醌甲基转移酶（mqnH）的作用下生成七烯甲萘醌。在自然界中合成核心结构主要包括两种方式，一种是mqn基因簇，另一种是存在于少量细菌比如天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）中的mqn基因簇。在Mqn基因簇中，主要包括mqna，mqnB，mqnC，mqnD四个基因。前体分支酸在Mqn基因簇的作用下能够合成前体1,4-二甲基-萘甲酸，相较于mqn基因簇具有催化步骤小，减少中间代谢物消耗等优点。

纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis）常被用在维生素K₂的生产中，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”（GRAS）安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组纳豆芽孢杆菌是高效合成维生素K₂的有效途径。然而，维生素K₂的合成途径十分复杂，且纳豆芽孢杆菌合成维生素K₂的代谢流通量不足，将严重影响维生素K₂的合成。如何调整纳豆芽孢杆菌代谢流供给，增加维生素K₂的合成是一个值得深入探讨的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用重组纳豆芽孢杆菌提高维生素K₂产量的方法，以纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）为出发菌株，利用P43启动子在纳豆芽孢杆菌的基因组上异源表达氟他洛辛合成酶基因mqnA和去氧黄嘌呤氟他洛辛合成酶基因mqnB；利用Phbs启动子在染色体上表达O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶基因mqnC和1,4-二羟基-6-萘甲酸合酶mqnD，构建得到4株重组菌NA1~NA4，其中NA3~NA4使得维生素K₂的产量得到了显著提高，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用重组纳豆芽孢杆菌提高维生素K₂产量的方法，包括如下步骤：

步骤1：构建重组菌NA1

通过组成型启动子P ₄₃ 在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达氟他洛辛合成酶基因mqnA；

步骤2：构建重组菌NA2

在步骤1得到的菌株NA1的基础上，采用与步骤1类似的方法，利用P₄₃启动子在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达去氧黄嘌呤氟他洛辛合成酶（mqnB，genebank ID：1099767）的基因；

步骤3：构建重组菌NA3

在步骤2得到的菌株NA2的基础上，采用与步骤1类似的方法，利用P _hbs 启动子替换纳豆芽孢杆菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶（mqnC，genebank ID：1099990）基因的天然启动子；

步骤4：构建重组菌BS4

在步骤3得到的菌株NA3的基础上，采用与步骤1类似的方法，用含有P _hbs 启动子的来源于天蓝色链霉菌的1,4-二羟基-6-萘甲酸合酶（mqnD，genebank ID：1099766）基因替换纳豆芽孢杆菌染色体上的异分支酸（dhbB，genebank ID：936582）基因；

步骤5：菌株发酵生产维生素K₂

将所述重组菌的种子液按照3%~6%的接种量接种到发酵培养基中。

所述P43启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述Phbs启动子的序列如SEQ IDNO.2所示。所述mqnA基因的序列如genebank ID：1099946所示；所述mqnB基因的序列如genebank ID：1099767所示；所述mqnC基因的序列如genebank ID：1099990所示；所述mqnD基因的序列如genebank ID：1099766所示。

进一步地，所述重组菌是Bacillus subtilis natto, P ₄₃ -mqnA，其是在染色体amyE位点上插入一段序列，序列包括启动子P ₄₃ 融合mqnA基因来增强氟他洛辛合成酶（mqnA，genebank ID：1099946）基因的表达，并将其命名为NA1。

进一步地，所述重组菌在NA1的基础上还做了如下改造：利用P₄₃启动子在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达去氧黄嘌呤氟他洛辛合成酶（mqnB，genebank ID：1099767）的基因，得到菌株Bacillus subtilis natto, P ₄₃ -mqnA P ₄₃ -mqnB，将其命名为NA2。

进一步地，所述重组菌在NA2的基础上还做了如下改造：利用P _hbs 启动子（序列如SEQ ID NO.2所示）在纳豆芽孢杆菌基因组上过表达O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶（mqnC，genebank ID：1099990）的基因，得到Bacillus subtilis natto,P ₄₃ -mqnA P ₄₃ -mqnB P _hbs - mqnC，将其命名为NA3。

进一步地，所述重组菌在NA4的基础上还做了如下改造：用含有P _hbs 启动子过表达1,4-二羟基-6-萘甲酸合酶（mqnD，genebank ID：1099766）基因替换纳豆芽孢杆菌染色体上的异分支酸（dhbB，genebank ID：936582）基因，得到菌株Bacillus subtilis natto,P ₄₃ - mqnA P ₄₃ -mqnB P _hbs -mqnC P _hbs -mqnD ΔdhbB，将其命名为NA4。

进一步地，所述菌株的种子培养基配方包括如下质量百分比的原料：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%；

所述发酵培养基配方包括如下质量百分比的原料：酵母提取物3%，大豆蛋白胨4%，葡萄糖3%，蔗糖2%。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明通过对维生素K2生物合成途径相关基因的改造，构建得到4株重组菌NA1~NA4，其中NA3~NA4使得维生素K2的产量得到了显著提高，分别达到了160 mg/L、220mg/L，是原始菌株的野生型纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）产量的3.2和4.4倍。

（2）本发明为构建维生素K₂的高产菌株提供了理论依据。

附图说明

图1为本发明mqnA, mqnB, mqnC, mqnD基因凝胶图；

图2为本发明NA1菌落PCR验证结果；M：marker；1：菌落PCR结果；2：菌落PCR结果；

图3为本发明增强mqn基因簇对产量的影响图；

图4为本发明过表达mqn基因簇，mqnA, mqnB, mqnC, mqnD的转录水平图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC No.10260。

表1 菌株基因型

菌株	特征
		bacillus subtilis natto	野生型
NA1	<i>Bacillus subtilis</i> natto<i>, P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnA </i>
		NA2	<i>Bacillus subtilis</i> natto<i>, P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnA P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnB</i>
NA3	<i>Bacillus subtilis</i> natto<i>, P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnA P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnB P</i><sub><i>hbs</i></sub><i>-mqnC</i>
		NA4	<i>Bacillus subtilis</i> natto<i>, P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnA P</i><sub><i>43</i></sub><i>-mqnB P</i><sub><i>hbs</i></sub><i>-mqnC P</i><sub><i>hbs</i></sub><i>-mqnD</i> Δ<i>dhbB</i>

表2 序列表

序列	编号
		<i>P</i><sub><i>43</i></sub>启动子序列	SEQ ID NO.1
<i>P</i><sub><i>hbs</i></sub>启动子	SEQ ID NO.2
		lox71-zeo-lox66盒	SEQ ID NO.3
MqnA基因片段	SEQ ID NO.4
		mqnB基因片段	SEQ ID NO.5
<i>mqnC</i>基因片段	SEQ ID NO.6
		<i>mqnD</i>基因片段	SEQ ID NO.7

实施例1：重组菌NA1的构建

通过组成型启动子P43在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达氟他洛辛合成酶基因mqnA（mqnA，genebank ID：1099946）。使用无标记的遗传修饰策略，参见文章（Yan, X., Yu, H.-J., Hong, Q., Li, S.P., 2008. Cre/lox system and PCR-based genome engineeringin Bacillus subtilis. Appl Environ Microb. 74, 5556-5562），具体构建过程如下：

（1）基因的克隆

①以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，采用引物mqnA-up.FOR和mqnA-up.REV扩增得到mqnA基因的上游同源臂序列mqnA-up。

②人工合成含有博莱霉素基因的lox71-zeo-lox66盒（序列如SEQ ID NO.3所示）。

③以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，采用引物P43.For和P43.Rev扩增得到P43启动子序列（序列如SEQ ID NO.1所示）。

④以天蓝色链霉菌基因组为模板，采用引物mqnA.FOR和mqnA.REV扩增得到mqnA基因片段（序列如SEQ ID NO.4所示）。

以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，采用引物mqnA-down.FOR和mqnA-down.REV扩增得到mqnA基因的下游同源臂序列mqnA-down。

（2）融合片段的获得

将步骤（1）中获得的五个片段mqnA-up、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、mqnA-down基因片段进行重叠延伸PCR，PCR条件：98°C，5 min预变性，然后98°C，变性10s，55°C，退火5s，72°C，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段mqnAup-lox71-zeo-lox66-P43-mqnA-mqnAdown。

（3）同源重组

将步骤（2）中得到的融合片段转化到野生型菌株Bacillus subtilis natto感受态细胞中。由于融合片段中存在mqnA的上游序列与纳豆芽孢杆菌染色体上的amyE的上游序列基因同源，融合片段中存在mqnA下游序列基因与纳豆芽孢杆菌染色体上的amyE的下游序列基因同源，通过同源重组，融合片段中的博来霉素抗性基因zeo和P43启动子替换纳豆芽孢杆菌染色体上amyE位点，引物序列如表3。具体步骤为：

①将步骤（2）中构建好的融合片段电转化纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，融合片段添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击时间5ms，37ºC复苏5h涂布终浓度为10μg/mL的博来霉素抗性的LB平板，37ºC厌氧培养48h。博来霉素抗性呈阳性的为转化成功的纳豆芽孢杆菌。

②挑选平板上长出的单菌落，利用引物NA1 YZ.FOR 和NA1 YZ.REV进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为1000bp（参见图1）。并进行测序，测序正确的即为lox71-zeo-lox66-P43融合基因成功替换纳豆芽孢杆菌染色体上的amyE位点。最后通过Cre/lox重组系统，敲除博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis natto, P43-mqnA，将其命名为NA1。

表3 引物序列表

引物	序列（5’-3’）	编号
			mqnA-up.for	GGATGGCACGAAGCATTTCCGTTAT	SEQ ID NO.8
mqnA-up.rev	TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTTTGAAGAC	SEQ ID NO.9
			mqnA-down,for	ATTACTGAAACCGTAAGTTCCAATACGGAGAAATCCTGCAGGATA	SEQ ID NO.10
mqnA-down.rev	CCCGCTCCGATTAAAGCTACTTTAT	SEQ ID NO.11
			mqnA-YZ.for	CAATTGCGGTCGCCTTTGC	SEQ ID NO.12
mqnA-YZ.rev	TCATATTGGCGCGAAGGGCAG	SEQ ID NO.13
			mqnA.for	TAGGTAAGAGAGGAATGTACACGTGGATAATTCTAGAACACGCCCGAGA	SEQ ID NO.14
mqnA.rev	TTTCTCCGTATTGGAACTTACGGTTTCAGTAATTCAACTTTGACATC	SEQ ID NO.15

实施例2：重组菌NA2的构建

在实施例1得到的菌株NA1的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P₄₃启动子在纳豆芽孢杆菌染色体上过表达去氧黄嘌呤氟他洛辛合成酶（mqnB，genebank ID：1099767）的基因，具体构建过程为：

（1）融合片段的获得

以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，分别扩增得到mqnB基因的上游同源臂序列mqnB-up、mqnB基因片段和P₄₃启动子序列，人工合成lox71-zeo-lox66盒序列（序列如SEQ ID NO.2所示），然后将四个片段mqnB-up、lox71-zeo-lox66盒、P₄₃启动子序列、mqnB基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段mqnB _up-lox71-zeo-lox66-P₄₃-mqnB-mqnB _down。

（2）同源重组

将步骤（1）中得到的融合片段转化到BS1感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序，如图2。最后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis natto, P ₄₃ - mqnA P ₄₃ -mqnB，将其命名为NA2。

实施例3：重组菌NA3的构建

在实施例2得到的菌株NA2的基础上，采用与实施例1类似的方法，利用P _hbs 启动子（序列如SEQ ID NO.5所示）替换纳豆芽孢杆菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶（mqnC，genebankID：1099990）基因的天然启动子，具体构建过程如下：

（1）融合片段的获得

以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，分别扩增得到mqnC基因的上游同源臂序列mqnC-up、mqnC基因片段和P _hbs 启动子序列，人工合成lox71-zeo-lox66盒序列（序列如SEQ ID NO.2所示）。然后将四个片段mqnC-up、lox71-zeo-lox66盒、P _hbs 启动子序列、mqnC基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段mqnC _up-lox71-zeo-lox66-P _hbs -mqnC。

（2）同源重组

将步骤（1）中得到的融合片段转化到NA2感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis,P ₄₃ -mqnA P ₄₃ -mqnB P _hbs - mqnC，将其命名为BS3。

实施例4：重组菌BS4的构建

在实施例3得到的菌株NA3的基础上，采用与实施例1类似的方法，用含有P _hbs 启动子的来源于天蓝色链霉菌的1,4-二羟基-6-萘甲酸合酶（mqnD，genebank ID：1099766）基因替换纳豆芽孢杆菌染色体上的异分支酸（dhbB，genebank ID：936582）基因。具体构建过程如下：

（1）融合片段的获得

以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，分别扩增得到dhbB基因的上游同源臂序列dhbB-up、dhbB下游同源臂序列dhbB-down、P ₄₃ 启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列（序列如SEQ ID NO.2所示）；以天蓝色链霉菌基因组为模板，扩增得到mqnD基因序列，然后将五个片段dhbB-up、lox71-zeo-lox66盒、P ₄₃ 启动子序列、mqnD基因序列、dhbB-down基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段dhbB _up-lox71-zeo-lox66-P ₄₃ -entC-dhbB _down。

（2）同源重组

将步骤（1）中得到的融合片段转化到NA3感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组系统，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis , P43-mqnF P43-mqnBPhbs-mqnC Phbs-mqnD ΔdhbB，将其命名为NA4。

实施例5：菌株发酵生产维生素K₂

种子培养基配方（质量百分比）：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%。

发酵培养基配方（质量百分比）：酵母提取物3%，大豆蛋白胨4%，葡萄糖3%，蔗糖2%。

（1）种子液制备

将野生型菌株纳豆芽孢杆菌及实施例1~4中构建得到的重组菌NA1~4分别接种到种子培养基中，在37℃、220 rpm下培养12 h得到纳豆芽孢杆菌种子液。

（2）发酵培养

将步骤（1）中得到的种子液以5%的接种量转入发酵培养基，于41℃，220 rpm条件下培养4天后，取发酵液测定维生素K₂的含量（参见表4）。

表4 菌株发酵生产维生素K₂

菌株	VK2产量（mg/L）	MK-7的相对含量
			BS natto（原始菌株）	50	1
NA1	60	1.2
			NA2	80	1.6
NA3	160	3.2
			NA4	220	4.4

维生素K₂检测方法：在发酵液中加入4倍体积异丙醇和正已烷混合物（1:2 V/V），涡旋振荡提取 30 min后，滤出提取液，8000 r/min 离心 15 min。收集上清液，此时MK-7溶解于该相中，置于-80℃冰箱中冷冻，使脂类物质结晶除去，收集滤液，HPLC检测MK-7的含量。

HPLC检测维生素K₂产量：采用Thermo ODC-C18分离柱（5 μm，250×4.6mm），检测的温度在40 ℃，流动相使用甲醇：二氯甲烷（9:1，v/v），流速为1 mL/min，检测波长254 nm，进样量10 μL。

增强mqn基因簇对维生素K₂产量的影响如图3，过表达mqn基因簇，mqnA, mqnB,mqnC, mqnD的转录水平如图4。

以纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）为出发菌株，利用P43启动子在纳豆芽孢杆菌的基因组上异源表达氟他洛辛合成酶基因mqnA和去氧黄嘌呤氟他洛辛合成酶基因mqnB；利用Phbs启动子在染色体上表达O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶基因mqnC和1,4-二羟基-6-萘甲酸合酶mqnD。

P43启动子序列

TgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgatagcGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC

Phbs启动子序列

Ggatgatccgctctccatctggaattccgatatcttcggaaggtcgctgagctcaattgtgagagaagggattcaggcaaagctgtcattgatgcctgaaaacgcacggtataaattaaaagaaacattagaaagaatcataaacgaaggctctggcggcttaatcgccatcatcctgtaataccggtagacctctttatagaatgggaggtcttttttctttgctcttaataatggaaaaggatcaaggaataggatgaaaaaaggaaaaaaaggaatattcgttcggtaaatcaccttaaatccttgacgagcaagggattgacgctttaaaatgcttgatatggctttttatatgtgttactctacatacagaaattcttcactttgttggacaaacattcctcagagtgcagtttttcttaaaaagccgtttaattgtctttctcttacttgctctcatttttttctgagacaggtttagaatcagactgaactgtgaagaaatgataataaacgaactgaatgtatccttttgggaggaggtgaaaggc

lox71-zeo-lox66盒

gagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagataccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcttgatatggctttttatatgtgttactctacatacagaaaggaggaactaaacatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgaataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaaatcgtcgac

MqnA基因片段

GTGGATAATTCTAGAACACGCCCGAGAGTCGGCCATATTCAATTTCTTAACTGCCTTCCGTTATATTGGGGCTTAGCGCGCACAGGAACACTGCTTGATTTTGAACTTACAAAAGATACACCGGAAAAACTGTCAGAACAGCTGGTCAGAGGCGATTTAGATATCGGACCGGTGACACTTGTCGAATTTCTGAAAAACGCAGATGATCTGGTTGCGTTTCCGGATATTGCTGTTGGCTGCGATGGACCGGTGATGAGCTGTGTTATCGTGTCTCAAGTTCCGCTTGATCGCTTAGATGGCGCAAGAGTGGCGCTGGGATCAACAAGCCGCACATCAGTCAGACTTGCTCAATTACTGCTTAGCGAACGCTTTGGCGTGCAGCCGGATTATTATACATGTCCGCCGGATCTGTCACTTATGATGCAGGAAGCTGATGCAGCGGTTCTGATTGGAGATGCTGCCCTTCGCGCCAATATGATCGATGGCCCGAGATATGGATTAGATGTGCATGATCTGGGCGCCCTTTGGAAAGAATGGACAGGACTGCCGTTTGTTTTTGCAGTGTGGGCAGCGAGACGCGATTATGCGGAACGCGAACCGGTGATTACAAGAAAAGTCCATGAAGCTTTTCTTGCCTCTCGCAACTTATCACTGGAAGAAGTCGAAAAAGTTGCAGAACAAGCTGCCAGATGGGAAGCTTTTGATGAAGATACACTGGCCAAATACTTTACAACACTGGATTTTAGATTTGGAGCCCCGCAGTTAGAAGCAGTCACAGAATTTGCGAGACGCGTTGGCCCGACAACAGGATTTCCGGCGGATGTCAAAGTTGAATTACTGAAACCGTAA

mqnB基因片段

ATGTCCTGCTCCAGGATCTCCTTCCACAGGCTGTCTCACTGCAGGGACTTGTTGTCCGCCCGGATGTGCTCTTCCCGCTCCGCCTCCGCCGCGTCCGCCTCCCTGTCCTCTGCCGCCTTCAACAGCAGGTCCAACAACTTGATCATCTCTTCCTGTATCAGCCGCTGCTTCGCGGCCTAATCTTCCATCCGCGCCTTGATCATCTCCGACTCTATCGCCTCCGCCCACTTGAGCTCCAAGTCCGCCCACCGCTTCTTGTCTATCTCCAACTTCTGCTTCGGCTCCATCGCCAACCTGGCGTCTTCCGCGTTGATCAGCTCCGCCTCCCAGTCTTCCCGGTCCAGGTCCAGCTCCATGCTGTCCAGGGCCTCCATCTCCTGCGCCGCGTCCGGCGCCTCTCTGTTGAGCCAGAGCAACTCTAGCTCCTTGTCCTAATCTATGCAGTGCTTCGGCATCTCCTAAGCCTCCGCCGCGCACTGCATTTCTATGCTGAAATTGGGCTCTATCGCCAATGCGATCGCTTCTAGCAACCGCTCCGCCCGGTGCATCAGCTAATCTTTCGCGTCCTTGGCGGACTCCATCCGGAAGTTCGCAGCCATCTTTCAGTGTCGGAAATCTCATTAAGGCTGA

mqnC基因片段

GTCACAGAAAAAGCGGATCTTCAACCGATTTTAGATAGAGCAGCTGCTGGCGGAAGAATCACACCTGAAGAAGCGCTTGATTTATATAGAGATGCCCCGTTACATGCACTGGGAGCTGCAGCTGATGCTGTTAGACGCAGACGCTATGCCGGAACAGAACATATCGCAACATACATCATCGAAAGAAACATCAACTATACAAATGTTTGCGTGACAGCGTGCAAATTTTGTGCTTTTTATGCTGCCCCGAAAGATACAAAGAAAGGCTGGAGCCGCGATCTGGATGATATTCTTAGACGCTGTGCCGAAACAGTCGAATTAGGCGGAACACAAATCATGTTTCAGGGCGGACATCATCCGGATTACGGCGTTGAATACTACGAAGAACATTTTGCAGCGATTAAGAAAGAATTTCCGCAACTTGTTATCCATTCTTTAGGAGCCTCAGAAGTGGAACATATGGCAAGAATTTCAAAAGTCAGCGTTGAAGAAGCTATTAGACGCATCCATGCTGCCGGCCTTGATTCATTTGCAGGCGCGGGAGCTGAACTGCTTCCGGAAAGACCGCGCAAAGCCATCGCACCGCTTAAAGAAAGCGGAGAAAGATGGTTAGAAATTATGGAAATCGCGCATGGCCTGGGAGTTGAAAGCACATCTACAATGCTTATGGGCACAGGAGAAACAAATGCTGAACGCATTGAACATCTTAGAATGATCCGCGATGTGCAGGATAGAACAGGCGGATTTCGCGCCTTTATTCCGTACACATACCAACCGGAAAACAACCATCTGAAAGGCAGAACACAGGCAACACTGTTTGAATACCTGAGAATGATCGCGATCGCTCGCGTGTTTTTAGATAACGTCGCGCATATTCAAGGATCTTGGCTGACAACAGGCAAAGAAGTGGGACAGCTGAGCCTTCATTATGGCGCTGATGATCTGGGATCTATTATGCTTGAAGAAAATGTTGTGTCAAGCGCCGGCGCAAAACATAGATCAAACCGCCTGGAAATCATCGATCTGATCAGAAAAGCTGGAAGAGTGCCTGCTCAGAGAGCTACAACATATGAACATCTGGTCGTTCATGATGATCCGGCAAATGATCCGGTCGATGAACGCGTGGTCTCTCATATTTCTTCAACAGCGATCGAAGGCGGAACAGCTCATCCGGAACTTAAATTACTGGCACCGAACTAA

mqnD基因片段

ATGCGCAGAAACGCCTTGTAAATCGCGAACGCCGCCTGCTCTCACAACTCCTTCATCTTCAACGCCTTCTCCGACCGCTGCATTTCTCGCGCCTCCGCCTTCCACATGGCCTTCTCTGACATCCACATCGCCCACTGCATGTCCTAAGGCAGCAAGCTGAACATGTTCAAGATGTCTGACGCCATGTTGTCCCACATCTTCGACCACCGGTCTCTGTTGTCCAGCTGCAGCTCTCTGTGCAGGAGCAGCTGCTCTCTGATGTTGTCCCGGCAGGCGAACTCTGACTTGGGCCGGAGCGCGATGTCTATGGCCAGCTAAGCGTCTGCGTCCGACCTGTTGTTCCGGCTGAGGTCTGCGCACTCCATGTCCAGCAGGATGTGCTAAATCATCATCATGGCGTTCGACAAGATCATGTCTGCCATGCGGCACCGGAAGATCAACTCTGGCCTGATGATCCACTAAGCCAGCTTCGCGAACAAGAACGACCGGTTGGACCAGTTCTCCCACATGGGCCAGCACCGGTAAAACTCCGCCCGGTTGGCGATCTCTTTCAGCGCGATCATCTCTCGGGGCTTACTGAGCTCTGCGTCTTTGTCCCGGTTCGCGCACTCTATGTGCGCCTCTATCTGCTCTTCCAGGCACAACTCTCAGTCTTCCAGGTCCCACATCATGTAAGACGCGAAGCAGATGAACTCTGCCATCTCCCACCAGAACATCCGGCTGGACATCCACAAGTTCTCCGCCGACTTCCGCCAGAACTGCGACGCGTCTATCGCTGGCCTGTTGGCCAGCGCGTCTTCCAAGTGATTCATATCTTCCTTCAGCGCGAACTCTTTGGCGTTCTCTCAG。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。