阅读说明：本技术 一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂及其制备方法和应用 (Linker peptide mediated enzyme immobilized BaPAD catalyst and preparation method and application thereof ) 是由 丁少军 李璐璐 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂及其制备方法和应用,属于催化剂的制备与应用领域。该方法首先将对沸石特异性吸附的连接肽通过Nco I/Xho I限制性酶切位点插入到含有编码酚酸脱羧酶BaPAD基因的质粒pET28a-bapad载体上,然后通过融合酶在经过预处理的Na-Y沸石载体上固定化得到酶固定化BaPAD催化剂,其中酚酸脱羧酶BaPAD来自萎缩芽孢杆菌。本发明所制备的生物催化剂用于催化FA生产4-VG,和全细胞催化FA生产4-VG相比,在相同的条件下,将4-VG浓度和生产率提高到1.97M和22.8g/L/h；且具有很好的重复使用性,能够实现4-VG的工业化生产需求。(The invention discloses a connecting peptide mediated enzyme immobilized BaPAD catalyst and a preparation method and application thereof, belonging to the field of preparation and application of catalysts. The method comprises the steps of firstly inserting connecting peptide which is specifically adsorbed on zeolite into a plasmid pET28 a-bad carrier containing a gene coding phenolic acid decarboxylase BaPAD through Nco I/Xho I restriction enzyme cutting sites, and then immobilizing the connecting peptide on a pretreated Na-Y zeolite carrier through a fusion enzyme to obtain an enzyme immobilized BaPAD catalyst, wherein the phenolic acid decarboxylase BaPAD is from Bacillus atrophaeus. Compared with the whole-cell catalysis of FA for producing 4-VG, the biocatalyst prepared by the invention is used for catalyzing FA to produce 4-VG, and the concentration and the productivity of the 4-VG are improved to 1.97M and 22.8g/L/h under the same conditions; and the reusability is good, and the industrial production requirement of 4-VG can be met.)

一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于催化剂的制备与应用领域，具体涉及一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂及其制备方法和应用。

背景技术

由于产物4-乙烯基愈创木对细胞膜毒性很大，全细胞作为催化剂在两相体系中生产4-乙烯基愈创木酚(4-Vinylguaiacol，4-VG)的过程中细胞发生裂解或死亡，导致在长时间的反应中转化效率逐渐降低甚至丧失，无法重复利用。另外，全细胞的细胞膜/壁可能是底物或产物扩散的屏障，在催化过程中会引起传质限制。相比较而言，酶作为催化剂可以直接进入反应环境，而且反应条件较简单，但是，游离酶的工业应用往往受到长期操作稳定性差，酶的回收和再利用面临技术阻碍的挑战。此外，酶纯化的高成本也是影响该工艺经济可持续性的另一个关键因素。因此，在下游生产过程中回收这些催化剂，提高操作稳定性是非常关键的，同时提高回收率和稳定性可以降低成本，并提高整个生物反应的效率。为了实现这些目标，固定化技术成为最具创新性和研究最为广泛的生产方法之一，以实现具有更高生产力的工业规模。

固定化酶在各个领域的应用已经引起人们的极大兴趣和不同程度的研究。将酶固定化于固体载体的方法有很多，其中最常用的是吸附法，但是传统的吸附法存在酶和固体载体表面吸附不牢，选择性较差的缺点，通过在BaPAD的N-端或C-端添加特异性的连接肽是改善这些缺点的一个方法。来自萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶BaPAD在催化阿魏酸制备4-乙烯基愈创木酚方面具有很大的应用价值，但是建立的全细胞作为催化剂生产4-VG的方法还存在细胞在反应中裂解死亡，无法重复利用的问题，有机相沸点与产物4-VG沸点相差不大导致下游分离纯化困难等缺点。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂，本发明所要解决的另一技术问题是提供连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂的制备方法；本发明所要解决的最后一个技术问题是提供上述催化剂的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂的制备方法，包括以下步骤：首先将对沸石特异性吸附的连接肽通过Nco I/Xho I限制性酶切位点***到含有编码酚酸脱羧酶BaPAD基因的质粒pET28a-bapad载体上，然后通过融合酶在经过预处理的沸石载体上固定化得到酶固定化BaPAD催化剂，酚酸脱羧酶BaPAD来自萎缩芽孢杆菌。

进一步的，连接肽由n个重复序列VKTQATSREEPPRLPSKHRPG和VKTQTAS串联而成，连接肽中单字母符号代表的氨基酸残基的定义如下：V为缬氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，Q为谷氨酰胺，A为丙氨酸，S为丝氨酸，R为精氨酸，E为谷氨酸，P为脯氨酸，L为亮氨酸，H为组氨酸，G为甘氨酸；沸石载体为Na-Y沸石。

进一步的，n为4。

进一步的，连接肽加在萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶BaPAD的N-端，连接在N-端的连接肽与his标签处在BaPAD的同一端。

进一步的，沸石载体的预处理为：10mg载体用800μL wash buffer洗三次，然后用200mM，pH 7.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液洗三次，每个过程涡旋振荡，8500rpm离心3min去净上清；wash buffer包括10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1％Triton X-100，pH为7.5。

进一步的，酶固定化BaPAD催化剂在0.5-5％的Tween20溶液中稳定，2％的SDS溶液能够将固定的酶全部解吸附。

上述方法制备的连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂。

连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂在催化阿魏酸生成4-VG中的应用。

连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂在生物反应器中含有等体积甲苯的两相体系中催化FA生成4-VG中的应用。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：本发明以BaPAD为对象，通过添加沸石特异性结合的连接肽将酶与Na-Y沸石固定化作为生物催化剂用于催化FA生产4-VG，浓度和生产率大大超过全细胞和游离酶作为生物催化剂的结果，和全细胞催化FA生产4-VG相比，在相同的条件下，将4-VG浓度和生产率提高到1.97M和22.8g/L/h；且本发明所制备的[email protected]沸石在含甲苯的两相体系中具有很好的重复使用性，在重复催化FA反应10个循环后，活性降为原来的73％，能够实现4-VG的工业化生产需求，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是构建pET28a-bapad-2/3/4lp的示意图；

图2是构建pET28a-2/3/4lp-bapad的示意图；

图3是pET28a-bapad-1/2/3/4lp(A)和pET28a-1/2/3/4lp-bapad(B)阳性克隆的筛选图；

图4是BaPAD及融合酶的表达(A)和纯化(B)的SDS-PAGE分析图；

图5是pH和温度对游离和固定化的4LP-BaPAD活性的影响图；

图6是细胞裂解液中BaPAD及融合酶对Na-Y沸石的选择性结合(15mg/g)图；

图7是Na-Y沸石固定化BaPAD和4LP-BaPAD在两相体系中酶解脱羧阿魏酸的重复操作稳定性图；

图8是用固定化酶在两相体系中催化阿魏酸制备4-乙烯基愈创木酚图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法。

实施例1BaPAD与连接肽融合的融合酶的构建

(1)pET28a-bapad-lp和pET28a-lp-bapad的构建

以pET28a-bapad为模板，分别以BaPAD-F、BaPAD-LP-R1、BaPAD-LP-R2和LP-BaPAD-F1、LP-BaPAD-F2、BaPAD-R(表1)为引物进行PCR，反应体系为：5×fastPfu buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，pET28a-bapad 1μL，BaPAD-F或LP-BaPAD-F1 1μL，BaPAD-LP-R1或BaPAD-R1μL，fastPfu DNA polymerase(10U/μL)1μL，ddH₂O 32μL。将反应体系配好混匀放入PCR仪中，设置反应条件为：95℃预变性1.5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃，10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。使用北京Trans Gen公司快速PCR产物纯化试剂盒(EasyPure PCR Purification Kit)回收纯化扩增得到含有NcoI/XhoI酶切位点的bapad-lp和lp-bapad基因片段。

表1本申请用到的引物

bapad-lp和lp-bapad基因片段和表达质粒pET28a的双酶切：bapad-lp、lp-bapad基因片段的双酶切体系为：NcoI 1.25μL，XhoI 1.25μL，10×Buffer D 5μL，bapad-lp或lp-bapad 20μL，ddH₂O 22.5μL。表达质粒pET28a的双酶切体系为：NcoI 1.25μL，XhoI 1.25μL，10×Buffer D 5μL，pET28a 10μL，ddH₂O 32.5μL。将含有双酶切位点的bapad-lp和lp-bapad基因片段和表达质粒pET28a分别双酶切，反应条件为37℃温育30min，然后用PCR产物纯化试剂盒将酶切产物分别进行回收纯化。

将双酶切的目的基因bapad-lp和lp-bapad和pET28a用T4连接酶进行连接，连接体系为：bapad-lp或lp-bapad 5.25μL，pET28a 1.75μL，10×T4 Buffer 2μL，T4 DNA Ligase1μL。配好反应液混匀，16℃金属浴30min。得到重组质粒pET28a-bapad-lp和pET28a-lp-bapad。

(2)pET28a-bapad-2/3/4lp和pET28a-2/3/4lp-bapad融合酶的构建

在bapad片段两端引入相同的酶切位点：以pET28a-bapad模板，分别以BaPAD-F、BaPAD-NcoI-R和2/3/4LP-BaPAD-F、2/4LP-BaPAD-R或2/3/4LP-BaPAD-F、3LP-BaPAD-R(表1)为引物PCR，反应体系：5×fastPfu buffer 10μL，d NTP(2.5mM)4μL，pET28a-bapad 1μL，上、下游引物各1μL，fastPfu DNA polymerase(10U/μL)1μL，ddH₂O 32μL。反应条件为：95℃预变性1.5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃，10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。使用PCR产物纯化试剂盒回收纯化扩增得到的基因片段。分别命名为bapad-XhoI和bapad-NcoI。

单酶切以上PCR产物bapad-XhoI/bapad-NcoI和pET28a-2/3/4lp：分别用限制性内切酶XhoI和NcoI单酶切pET28a-2/3/4lp和两端含有相同酶切位点的片段bapad-XhoI和bapad-NcoI。bapad-XhoI和bapad-NcoI基因片段的单酶切体系为：NcoI或XhoI 1.5μL，10×Buffer D 5μL，bapad-XhoI或bapad-NcoI 20μL，ddH₂O 23.5μL。pET28a-2/3/4lp的单酶切体系为：NcoI或XhoI 1.5μL，10×Buffer D 5μL，pET28a-2/3/4lp 10μL，ddH₂O 33.5μL。

将经过XhoI单酶切的bapad-XhoI和pET28a-2/3/4lp用T4连接酶进行连接，将经过NcoI单酶切的bapad-NcoI和pET28a-2/3/4lp用T4连接酶进行连接，bapad-XhoI或bapad-NcoI 5.25μL，pET28a-2/3/4lp 1.75μL，10×T4 Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 1μL。按反应体系配好反应液混匀于16℃反应30min，得到重组质粒pET28a-bapad-2/3/4lp(图1)和pET28a-2/3/4lp-bapad(图2)。

(3)重组质粒阳性克隆的筛选

将提前制备好的大肠杆菌top10感受态细胞冰上解冻。

将bapad-lp和lp-bapad的PCR片段与载体pET28a连接；将分别用NcoI和XhoI单酶切的bapad和pET28a-2/3/4lp的片段连接，分别转入大肠杆菌top10感受态。

将导入连接产物的大肠杆菌top10感受态细胞冰浴30min，随后在42℃热击2min，在无菌操作台加入0.5mL LB培养基，于37℃，200rpm，摇床培养约1小时。

将培养好的含有连接产物的菌液在4000rpm离心2min，去除上清液约400μL，剩余菌体重悬涂布在LBK平板，置于37℃培养箱中过夜培养。

从过夜培养的LBK培养基上随机挑取几个单菌落作为模板，以pET28a载体上的上下游通用引物T7/T7ter进行菌落PCR。具体操作如下：从培养平板上随机挑取几个白色单菌落于20μL无菌水中，混匀后取出10μL作为模板，反应体系：2×Hieff^TM PCR Master Mix 13μL，通用上游引物T71μL，通用下游引物T7ter 1μL，模板(单菌落水溶液)10μL。反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃，10min。

PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，选择700bp以上的条带对应的菌落进行摇管并测序。

实施例2BaPAD与融合酶重组蛋白的表达与纯化

(1)重组蛋白的表达和纯化

选择测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，方法同转化top10感受态。涂布含有50μg/mL卡那霉素的LBK平板，于37℃培养箱过夜培养。

从过夜培养的LBK板上挑取白色单菌落于3mL含有50μg/mL卡那霉素的LBK液体培养基中，于37℃，200rpm摇床过夜培养。

将过夜培养的菌液以2％的接种量接入50mL灭菌的LBK液体培养基中，于37℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀为0.6。

加入终浓度0.4mM的IPTG，于28℃，200rpm摇床诱导表达培养，12h后将菌液8500rpm离心10min，收集菌体细胞。

用4mL Lysis buffer分别重悬菌体，于冰水混合物上进行超声破碎，超声破碎仪设置参数为功率200w，时间10min，超声时间3s，间隔时间3s。

该实施例中Lysis buffer的配方为300mM NaCl，50mM Na₂HPO₄·2H₂O，pH为8.0。

(2)SDS-PAGE分析

将诱导表达的菌体收集后超声破碎，用SDS-PAGE分析细胞裂解液，如图4(A)所示，9条泳道的条带强度差别不大，表明连接肽对BaPAD和融合酶的表达没有明显的影响。通过Ni-NTA纯化得到的纯酶也通过SDS-PAGE分析，如图4(B)所示，可以看出分别在22，25，28，30，32，25，27，30和32kDa处有单一条带，分别对应BaPAD，BaPAD-LP，BaPAD-2LP，BaPAD-3LP，BaPAD-4LP，LP-BaPAD，2LP-BaPAD，3LP-BaPAD，4LP-BaPAD的理论分子量。

(3)BaPAD及融合酶表达水平的分析

通过Ni-NTA纯化得到的9种纯酶用BCA法对其蛋白浓度进行分析，结果如表2所示，纯酶BaPAD的浓度达到178.1μg/mL，含有连接肽的几种纯酶浓度在143-206μg/mL范围内，差别不大，与SDS-PAGE结果相对应。

表2 BaPAD及融合酶的表达水平

酶	表达水平(μg/mL)
		BaPAD	178.1
BaPAD-LP	206.2
		BaPAD-2LP	192.1
BaPAD-3LP	185.3
		BaPAD-4LP	143.5
LP-BaPAD	184.3
		2LP-BaPAD	199.0
3LP-BaPAD	174.3
		4LP-BaPAD	163.2

实施例3 BaPAD及融合酶对不同载体的吸附实验

(1)BaPAD及融合酶对不同载体的亲和性吸附

固体载体的预处理：10mg固体载体用800μL wash buffer(10mM Tris-HCl，100mMNaCl，1％Triton X-100，pH 7.5)洗三次，然后用柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(200mM，pH 7.0)洗三次，每个过程涡旋振荡，8,500rpm离心3min去净上清。固定化：9种纯酶(50μg，100μL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液)加到洗好的载体中，在冰上振荡孵育1h。

酶负载量的计算：孵育后的样品8,500rpm离心3min，分离上清，用BCA法检测固定化之前和吸附后上清的蛋白浓度，相减得到固定化酶的浓度。从而比较9种酶在不同载体上的吸附水平。

选择Na-Y沸石，ZSM-5沸石，β沸石，致密二氧化硅和介孔二氧化硅作为固体载体，设置纯酶浓度为5mg/g载体，分析9种酶的吸附性能。通过表3可以看出，BaPAD及融合酶都可以被Na-Y，ZSM-5和β沸石完全吸附(100％)。另外，这些酶对介孔二氧化硅表现出75-86％的结合亲和性，是对致密二氧化硅亲和性的2-3倍。对于两种二氧化硅材料，含有连接肽的酶的亲和性稍强于不含连接肽的BaPAD，连接肽在低酶浓度吸附二氧化硅材料中体现出了优越性。

表3低酶浓度下BaPAD及融合酶在不同载体上的负载率(％)

(2)BaPAD及融合酶在Na-Y沸石上的最大吸附

将10mg Na-Y沸石分别用800μL wash buffer(10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1％Triton X-100，pH 7.5)和柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(200mM，pH 7.0)洗三次，每个过程涡旋振荡，8,500rpm离心3min去净上清。分别向洗好的Na-Y沸石中加入200μL稀释成1000μg/ml的纯酶，使体系中酶的浓度为20mg/g载，在冰上振荡孵育1h。

从表4可以看出，加了连接肽的融合酶，不管连接肽加在BaPAD的N-端还是C-端，随着连接肽的增长，Na-Y沸石固定化的酶量及负载率都随之增大，而相比于连在C-端的连接肽，将连接肽连在N-端更能够提高融合酶酶的负载率，最高的4LP-BaPAD的负载率可达到68.81％，相应的负载蛋白浓度为13.8mg/g载体。相反地，不加连接肽的原始BaPAD的负载率只有31.93％。这些结果表明在高酶浓度下，连接肽的添加可以增加Na-Y沸石对酶的负载，而且负载量随着连接肽的延长而增加。

表4高酶浓度下BaPAD及融合酶在Na-Y沸石上的最大负载

(3)固定化酶的生物化学性质研究

S1、固定化酶的酶活检测：

酶活测定步骤(以FA为例)：反应体系1mL，含有0.8mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(pH6.0)，100μL 50mM阿魏酸钠溶液和100μL浓度为20μg/mL的游离和固定化的酚酸脱羧酶。50℃水浴锅中反应5min，反应结束加入2mL甲醇终止。用0.22μm滤膜过滤后HPLC检测生成的4-VG的含量。以不加酶而换成100μL缓冲液并在相同条件下处理的样品为对照。

酶活的检测：利用HPLC检测反应产物的生成量，以FA为例，利用测得的峰面积根据标准曲线计算生成的4-VG的量，从而计算得到固定化酚酸脱羧酶的活性(IU/mL)。

9种以Na-Y沸石为载体的固定化酶以对香豆酸(pCA)，阿魏酸(FA)和咖啡酸(CA)为底物的酶活见表5，可以看出，固定化酶的底物特异性与游离酶相比一般没有变化，但是固定化之后的活性与游离酶相比因为连接肽位置的不同出现不同的结果，BaPAD以及BaPAD-1/2/3/4LP的活性还保留55-85％，而1/2/3/4LP-BaPAD固定化后的化活性几乎没有降低，甚至LP-BaPAD的活性比游离酶稍高，总的来讲，连接肽连在N端的融合酶固定化后活性变为游离酶的95-105％。原因可能是连在C-端的连接肽与his标签分布于BaPAD的两端，而his标签可能也对沸石材料有一定的吸附作用，这样就使得酶被锚定在载体上，不能灵活地与底物接触，导致脱羧反应变慢或者底物可及性变差，所以活性比游离酶低的多；而连接在N端的连接肽与his标签处在BaPAD的同一端，这样使融合酶只有一端被固定，相对更灵活，底物可及性更好，所以固定化后保留的活性更高。

表5游离和固定化BaPAD及融合酶对不同底物的活性

S2、pH对游离和固定化的4LP-BaPAD活性的影响：游离和固定化的4LP-BaPAD在50℃，不同的pH下以FA为底物进行酶促反应，所用缓冲液为pH 4.0-8.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，以相对活性最高为100％作图。

温度对游离和固定化的4LP-BaPAD活性的影响：在最适pH缓冲液中于不同温度下(30-60℃)进行酶促反应，以相对活性最高为100％作图。

pH和温度对游离和固定化的4LP-BaPAD活性的影响：以阿魏酸为底物检测游离和固定化的4LP-BaPAD在pH4.0-8.0和30-60℃的活性，以酶活最高为100％(如图5)，由图5(A)可以看出游离的4LP-BaPAD最适pH为5.0，固定化的4LP-BaPAD最适pH为5.5；由图5(B)可以看出游离的和固定化的4LP-BaPAD最适温度分别为50和55℃，在45-55℃区间内有较高酶活。和不含连接肽的BaPAD相比，4LP-BaPAD的最适温度和最适pH都相差不大。

实施例4用沸石材料从粗酶液中用一步法纯化和固定化目标蛋白

(1)一步纯化法

通过IPTG诱导的重组细胞超声破碎后收集的上清，即粗酶，分别稀释成3000μg/mL，0.1g用wash buffer洗过的Na-Y沸石(具体操作步骤详见固体载体的预处理)加入到0.5mL稀释好的细胞裂解液中，冰上孵育1h，8,500rpm离心3min，分离上清，用Lysis buffer(300mM NaCl，50mM Na₂HPO₄·2H₂O，pH 8.0)洗三次，收集上清液，然后沉淀用0.5mL的Lysisbuffer重悬。取相同体积的固定化前的细胞裂解液，吸附后上清和沸石固定化重悬液用SDS-PAGE方法分析。

从图6可以看出，不含有连接肽的BaPAD与Na-Y沸石一起孵育后，主要存在于吸附后上清(未结合)中，只有非常少量的残余BaPAD存在结合蛋白(固定化)的部分，可能是由于Na-Y沸石的非特异性吸附造成的。大多数加了连接肽的融合蛋白在与Na-Y沸石孵育后都存在于结合部分，而且随着连接肽的延长这部分的条带增强，对于BaPAD-4LP和4LP-BaPAD，只有很少量存在于未结合部分。另外从SDS-PAGE图上可以看出所有8种融合蛋白都表现出明显的单一条带，而且和理论分子量大小一致。这些结果表明加了连接肽的融合酶可以通过Na-Y沸石一步法从细胞裂解液中纯化固定目的蛋白。

(2)BaPAD及融合酶在Na-Y沸石上的吸附选择性

方法同一步纯化法，除了最后SDS-PAGE的步骤。将每一步骤的样品以阿魏酸为底物测酶活，通过计算上清液和Na-Y沸石固定的酶活比例得到BaPAD及融合酶对Na-Y沸石吸附的选择性(％)。

吸附选择性是通过计算固定化酶的活性与原始总酶活性的比值来定义的。从表6可以看出BaPAD的初始总酶活最高，达到318IU，但是其对Na-Y沸石吸附的选择性只有14％，而含有连接肽的融合酶对Na-Y沸石的选择性吸附都高于原生BaPAD，而且随着连接肽长度的增加，选择性逐渐提高，连接肽连在N-端选择性高于连在C-端。4LP-BaPAD虽然原始总酶活最低，但是对Na-Y沸石的吸附选择性最高，达到86％。

表6 BaPAD及融合酶对Na-Y沸石吸附的选择性

	原始总酶活性(IU)	固定化酶的活(IU)	选择性(％)
				BaPAD	318.19±8.42	45.76±3.14	14.38
BaPAD-LP	312.15±5.68	85.42±0.33	27.36
				BaPAD-2LP	248.35±3.51	128.27±3.48	51.64
BaPAD-3LP	193.54±3.17	137.59±3.06	71.09
				BaPAD-4LP	191.25±0.53	135.52±2.32	70.86
LP-BaPAD	201.83±5.43	128.36±3.68	63.59
				2LP-BaPAD	186.42±4.98	155.63±2.37	83.48
3LP-BaPAD	185.84±3.76	150.57±2.22	81.02
				4LP-BaPAD	173.72±9.12	149.87±2.18	86.27

实施例5 4LP-BaPAD吸附Na-Y沸石的稳定性及重复负载研究

(1)吸附稳定性

将100μL 4LP-BaPAD以10mg/g载体的浓度固定于洗过的Na-Y沸石，通过测定吸附前后的上清蛋白浓度得到固定化酶的量。之后用不同条件的缓冲液洗脱固定化酶，通过检测洗脱液的蛋白浓度和活性来考察固定化4LP-BaPAD在不同条件下的稳定性。

结果如表7所示，在浓度范围为0.5％至5％的吐温20(pH 7)中，未发现有固定蛋白被洗脱，而且该固定化酶在pH3.0～9.0的范围内也是稳定的，但是，5M NaCl溶液可以从载体上部分洗脱固定化的酶。[email protected]沸石在可以破坏疏水作用的吐温20溶液处理时是稳定的。SDS对固定化酶有较好的解吸效果，经2％SDS处理后可100％解吸。

表7 [email protected]沸石在不同条件处理下的稳定性

洗脱条件(pH/NaCl浓度，M)	洗脱蛋白质，％
		pH3.0-9.0	0
3.0/5	0
		4.0/5	0
5.0/5	16.76
		6.0/5	49
7.0/5	38.6
		8.0/5	32.8
9.0/5	36.4
		7/0.5％Tween 20	0
7/1％Tween 20	0
		7/2％Tween 20	0
7/3％Tween 20	0
		7/4％Tween 20	0
7/5％Tween 20	0
		7/1％SDS	96
7/2％SDS	100

(2)重复负载

用2％的SDS溶液100μL与固定化于Na-Y沸石的4LP-BaPAD振荡混匀，用涡旋仪涡旋振荡20s，8,500rpm离心3min，重复三次使固定的蛋白完全解吸附(通过分光光度计在280nm检测来验证)，之后用柠檬酸-Na₂HPO₄(pH 7.0)洗沸石上残留的SDS，再进行下一轮吸附，重复三个循环，通过检测每个循环吸附前后的蛋白浓度，比较解吸附后Na-Y沸石重复负载4LP-BaPAD的量的变化。

2％SDS溶液用于4LP-BaPAD从Na-Y沸石上解吸附。一个典型的循环包括吸附和解吸附，三个循环后发现沸石重新负载的蛋白量几乎不变，表明4LP-BaPAD在Na-Y沸石上优越的可再生性能。

(3)固定化BaPAD和4LP-BaPAD的可重复使用性

在本实施例中，BaPAD和4LP-BaPAD-Na-Y沸石复合物作为生物催化剂在含甲苯的两相反应体系中的操作稳定性通过连续反应10个循环来评估。在连续反应过程中4-乙烯基愈创木酚的产量如图7所示。可以看出固定化的BaPAD和4LP-BaPAD转化效率随着反应的持续进行而逐渐降低，在第一个循环，200mM底物阿魏酸分别在固定化的BaPAD和4LP-BaPAD催化下产生175和180mM 4-乙烯基愈创木酚，第二个循环这组数据降低到145和175mM，而在第十个循环，与第一次反应相比，4-乙烯基愈创木酚的生成量降低为初始的36％和73％。因此含有连接肽的酚酸脱羧酶固定化后的操作稳定性远高于不含连接肽的酶，固定化的4LP-BaPAD可以作为催化能力和稳定性极其出色的催化剂来应用。

实施例6在生物反应器中用[email protected] zeolite转化FA生成4-VG

(1)融合酶4LP-BaPAD的制备

准备200mL×8瓶灭菌的LBK培养液，按照2％的体积比接入活化的4LP-BaPAD种子细胞液，在37℃培养至OD₆₀₀＝0.6左右，加入终浓度0.4mM的IPTG，于28℃诱导培养12h。4℃，8,000rpm离心10min，去除上清，用4mL Lysis buffer重悬菌体，于冰上超声破碎。4℃，10,000rpm离心10min，收集上清液约200mL，即为粗酶，通过BCA法检测粗蛋白总量约为700mg。

其中，LBK培养液为LB液体培养基在121℃灭菌20分钟后，冷却至60℃左右加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素。

(2)催化剂[email protected]的制备

称取70g Na-Y沸石，用Lysis buffer(pH 8.0)洗三次，加入200mL粗酶液，于冰上磁力搅拌1h，离心后检测上清液的蛋白浓度，计算总的未吸附的蛋白量约220mg，使用的催化剂为固定了480mg总蛋白的70g [email protected] zeolite。

(3)以阿魏酸(Ferulic Acid，FA)为底物制备4-VG

反应体系：5L发酵罐中含有1L甲苯和1L包含了初始浓度为200mM的FA和固定了480mg总蛋白的70g [email protected] zeolite催化剂。

反应条件：通过发酵罐自带的水循环系统调节反应温度为30℃，水相和有机相各一个搅拌转子，转速为150rpm，反应过程中通过仪器控制面板的pH值的变化补加阿魏酸粉末，使其pH控制在6.5±0.1的范围内。每小时取样，样品10,000rpm离心5min充分分离有机相和水相。

检测方法：将有机相和水相分别用甲醇稀释后HPLC检测，根据标准曲线计算生成的4-VG和残余FA的浓度。

在以甲苯为有机相的两相生物转化体系中，以阿魏酸为底物制备了高浓度4-乙烯基愈创木酚。HPLC分析表明在13个小时的连续反应后，如图8所示，共生成了1.97M产物，转化率为98.95％，生产率为22.8g/L/h。