阅读说明：本技术 一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用 (Sulfamethazine aptamer screening method, kit and application ) 是由 乐涛 寇启明 孙琦 吴平 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：发明提供了一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选方法及其检测试剂盒,其中,试剂盒包括基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器；其中,基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器包括FAM荧光基团标记的适配体和氧化石墨烯；所述FAM荧光基团标记的磺胺二甲嘧啶核酸适配体序列为核苷酸序列表记载的No 1s。磺胺二甲嘧啶荧光检测试剂盒在检测牛奶或鸡蛋的测试样品中磺胺二甲嘧啶的定量检测的应用。(The invention provides a screening method of sulfadimidine aptamer and a detection kit thereof, wherein the kit comprises a graphene oxide-based fluorescent aptamer sensor; the graphene oxide-based fluorescent aptamer sensor comprises an FAM fluorophore labeled aptamer and graphene oxide; the sequence of the sulfamethazine aptamer marked by the FAM fluorescent group is No1s recorded in a nucleotide sequence table. Application of the sulfadimidine fluorescence detection kit in quantitative detection of sulfadimidine in a test sample for detecting milk or eggs.)

一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术和食品抗生素残留检测领域。更具体的说涉及磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用。

背景技术

磺胺二甲嘧啶，化学名为2-(对氨基苯磺酰胺基)-4,6-二甲基嘧啶，是常见的磺胺类药物，是一种广谱抗菌剂，除用于临床治疗外，还能作为兽药和饲料添加剂，广泛应用于食源性动物的饲养中，通过各种给药途径进入动物体内后，可转移到肉、蛋、奶等动物源性食品中。如果使用不当很容易在动物组织和动物源性食品中产生残留，通过食物链进入人体，对人类健康造成危害。并通过动物粪尿等途径排入外部环境，造成生态毒理污染。为了保障动物源性食品的安全性，各国政府规定了磺胺二甲嘧啶等磺胺类药物在动物源性食品中的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。国际食品法典委员会(CAC)、世界卫生组织(WHO)和美国FDA(食品及药物管理局)规定食品和饲料中磺胺类药物总量不得超过0.1mg/kg，我国规定磺胺类药物在动物源性食品中的最高残留限量为100ng/mL，各种磺胺类药物总量不得超过100ng/mL。因此，建立一种快捷、高效、精确的磺胺二甲嘧啶检测方法，对保证人类饮食健康，减少生态污染具有十分重要的意义。目前，磺胺二甲嘧啶药物的检测大多采用高效液相色谱法、色谱-质谱联用技术和酶联免疫吸附法等方法，这几种方法虽然具有很高的选择性和灵敏度，但是，色谱法的使用需要相对昂贵的分析仪器和专业的技术人员，尤其存在样品前处理过程烦琐，对低含量的目标物提取效率低，样品检测成本高，存在基质干扰，难以实现快速检测等缺点。而酶联免疫吸附法需要制备抗体，而制备药物抗体则需要合成完全抗原并免疫动物，实验周期长，且生物活性受多种因素影响而易于失活。近年来，生物传感器法用于检测药物因其操作简单、检测速度快、价格低廉等优点越来越受到广大科研工作者的关注。基于核酸适配体构建的生物传感器，检测灵敏度高、操作简单、选择性强，在抗生素药物检测中具有良好的应用前景。本发明基于氧化石墨烯对磺胺二甲嘧啶核酸适配体进行了筛选及序列优化，构建了基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器，在实际样本牛奶和鸡蛋中成功检出，线性关系好，对磺胺二甲嘧啶的检测开发产品方面奠定了基础。

核酸适配体是一类在体外通过指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选出的能与各种目标分子高亲和力、高特异结合的单链DNA或RNA片段，可以通过自身折叠形成二级或三级结构使其对特定靶标(如金属离子、小分子、蛋白、病毒、细胞等)有很强的亲和力，作为分子识别的元件，而广泛应用于医学临床诊断和治疗。

目前已有利用核酸适配体作为探针应用于食品中抗生素检测残留检测的报道，检测方法多以免疫分析法和电化学生物传感器为主，为了确保动物源性食品的质量，保障人类的饮食安全，必须加强食品和环境中磺胺二甲嘧啶残留的检测。

发明内容

：

本发明通过非固定GO-SELEX技术的筛选过程，获得了磺胺二甲嘧啶的核酸适配体，通过序列的优化，得到适配体核心识别区域，并克隆体外合成，制得的核酸适配体对磺胺二甲嘧啶具有高亲和力和特异性，构建了基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器，当体系中出现磺胺二甲嘧啶时，核酸适配体通过较强的亲和力结合到磺胺二甲嘧啶上，不通过π-π堆积作用吸附在氧化石墨烯表面。由于磺胺二甲嘧啶浓度的不同，结合的荧光基团标记适体产生不同的荧光信号。相反，在没有磺胺二甲嘧啶的情况下，氧化石墨烯可以通过π-π堆积相互作用吸附荧光团标记的适配体，猝灭荧光信号。利用这一原理，实现磺胺二甲嘧啶的定量检测。具体的发明内容为：

磺胺二甲嘧啶荧光检测试剂盒，包括基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器；其中，基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器包括FAM荧光基团标记的适配体和氧化石墨烯；所述FAM荧光基团标记的磺胺二甲嘧啶核酸适配序列为核苷酸序列表记载的No.1、No.2、No.3、No.4、No 5、No.6、No 1s或No 5s之一。将上述ssDNA进行修饰和改造得到的核酸适配体衍生物等也属于本发明保护范围。

所述FAM荧光基团标记的磺胺二甲嘧啶核酸适配序列为核苷酸序列表记载的No1s或No 5s之一。

所述FAM荧光基团标记的磺胺二甲嘧啶核酸适配序列为核苷酸序列表记载的No1s。

1)采用非固定GO-SELEX技术的筛选磺胺二甲嘧啶核酸适配体；

2)通过序列的优化，得到适配体核心识别区域，并克隆体外合成，制得对磺胺二甲嘧啶具有高亲和力和特异性的核酸适配体；

磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：

1)采用非固定GO-SELEX技术筛选磺胺二甲嘧啶核酸适配体；

2)通过序列的优化，得到适配体核心识别区域，并克隆体外合成，制得对磺胺二甲嘧啶具有高亲和力和特异性的核酸适配体。

基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器的构建方法为：通过制备得到的对磺胺二甲嘧啶具有高亲和力和特异性的核酸适配体构建了基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器。

磺胺二甲嘧啶荧光检测试剂盒在检测牛奶测试样品中磺胺二甲嘧啶的定量检测的应用。

磺胺二甲嘧啶荧光检测试剂盒在检测鸡蛋组织测试样品中磺胺二甲嘧啶的定性检测的应用。

本发明的有益技术效果是：本发明针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、操作繁琐，以及免疫分析方法需要通过实验动物制备抗体周期性长的等缺点，建立基于氧化石墨烯适配体传感器荧光检测方法，可用于食品中磺胺二甲嘧啶残留的快速、高灵敏度定量检测，克服了上述检测方法的缺陷。为抗生素检测提供了新方法。具有检测操作简单、靶标非固定、筛选轮数短等优点，为食品安全检测和产品开发奠定基础。

附图说明

图1：核酸适配体亲和力测定；

图2：荧光适配体传感器特异性分析；

图3：利用不同浓度标准品，在发射波长520nm处所绘制的荧光标准曲线。

具体实施方式

实施例1

1.筛选磺胺二甲嘧啶的核酸适配体的GO-SELEX过程

1)文库复变性处理：取500nM文库(5'-FAM-GACAGGCA GGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3'；N为随机序列)置于金属浴95℃加热10min，随后迅速置于冰上放置10min，取出后避光于室温平衡25min，以使文库中大量的ssDNA折叠形成复杂多样的三维结构。并测定荧光值。

2)第一轮筛选：取磺胺二甲嘧啶溶液(4μg/mL)7μL，加入到200uL Lib中，置于25℃，250rpm摇床上避光孵育1h，ssDNA自适应形成三维结构，一部分ssDNA形成的三维结构可以与磺胺二甲嘧啶结合，形成ssDNA－磺胺二甲嘧啶复合物。加入一定比例的GO，置于25℃，250rpm摇床上避光孵育20min，游离的ssDNA通过π-π堆积作用均匀吸附于氧化石墨烯上，ssDNA－磺胺二甲嘧啶复合物不能结合在氧化石墨烯上。后15000rpm，25℃离心10min，弃掉沉淀，回收上清液。上清液中含有能与磺胺二甲嘧啶结合的ssDNA，用酶标仪上测定荧光强度(492nm激发，520nm发射)，计算回收率。

取适量孵育后所收集上清液为模板,以带荧光标记的前向引物和带生物素的后向引物按上述反应条件进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。

3)回收率计算：每一轮筛选孵育后计算回收率，回收率＝(F_{回收的ssDNA}/F_{投入的ssDNA})×100％。随着筛选的进行，不能与磺胺二甲嘧啶结合的ssDNA逐步被筛掉，能与磺胺二甲嘧啶高亲和的ssDNA不断得到富集，回收率不断增加，直到回收率趋于平稳，磺胺二甲嘧啶的亲和力适配体得到富集，筛选过程基本结束。

4)负筛选：当回收率趋于平稳后，进行一轮负筛选。将上一轮制备的次级文库经复变性处理后分别加入与文库等摩尔量的磺胺喹噁啉，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，25℃，250rpm摇床上避光孵育1h，加入文库与氧化石墨烯质量比1:24的氧化石墨烯，25℃，250rpm摇床上避光孵育20min，能够与磺胺喹噁啉，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶结合的ssDNA游离在液体中，不能与它们结合的ssDNA吸附在氧化石墨烯上，15000rpm，25℃离心10min，弃掉上清液。向含有氧化石墨烯沉淀的离心管中加入结合缓冲液，离心弃掉上清液，重复此操作3次，彻底除去能与磺胺喹噁啉，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶结合的ssDNA。加入结合缓冲液200μL，再加入等摩尔量的磺胺二甲嘧啶，25℃，250rpm摇床上避光孵育1h，与磺胺二甲嘧啶特异结合的ssDNA形成的复合物从氧化石墨烯上解吸下来，离心取上清液，用酶标仪测定荧光强度。

5)终轮筛选：负筛选后得到的ssDNA再重复正筛选过程，计算回收率，后进行一轮正筛，使磺胺二甲嘧啶适配体得到富集。

2.次级文库的制备

1)清洗磁珠：取2管600μLPromega磁珠，1×PBS(0.1mg/mLBSA)，1mL/次，清洗3次；

2)重悬磁珠：分别用800μL 1×PBS(0.1mg/mLBSA，0.2M NaCl，pH 7.4)重悬；

3)提取dsDNA：将PCR产物分别加到800μL磁珠混悬液中，25℃，280rpm，避光震摇1h，DNA通过生物素与链霉亲和素的作用连接在链霉亲和素磁珠上；

4)分离dsDNA：用磁力架分离去除上清，并用1mL 1×PBS(pH 7.4)清洗3次，除去未结合在磁珠上的DNA，最后并合两管磁珠，去除上清；

5)ssDNA再生：加入50μL 0.05MNaOH，涡旋反应2min，使正义链与反义链在碱性条件下分离，带生物素的那条ssDNA链连在磁珠上，没有携带生物素的另外一条链碱裂解下来，后加入25μL ddH₂O和100μL 2×Tris-HCl继续涡旋振荡1min。磁分离小心收集上清，向收集液中加入25μL 0.1M HCl中和NaOH，得200μL次级文库。最后用酶标仪测荧光强度(492nm激发，520nm发射)，重复测3次，并根据标准曲线计算次级文库浓度。将次级文库进行适当稀释后按照第一轮的复变性处理，加入磺胺二甲嘧啶进入下一轮筛选。

3.克隆和测序

经过7轮筛选得到的ssDNA使用非标记的前向引物、后向引物进行PCR扩增，挑选克隆子测序。测序结果见表1所示。

表1

4.核酸序列分析与优化

首先利用软件DNAMAN对测序所得序列进行序列比对和同源性分析，分析每条核酸序列的特点；然后用Mfold在线预测核酸序列的二级结构；对No 1和No 5进行亲和力测定，再根据二级结构对核酸序列进行适当截短，亲和力得到提高，得到两条裁剪后的核酸适配体No 1s和No 5s，具体见表2所示。

表2

No1s	CGTTAGACG
		No5s	GCTGATAGC

5.亲和力测定

氧化石墨烯不仅可以吸附ssDNA，而且具有很好的荧光淬灭效果，可以猝灭荧光基团。将梯度浓度(12.5，25.0，50.0，75.0，100.0，150.0，200.0nmol/L)的5'-FAM荧光标记的候选适配体分别与等摩尔量的磺胺二甲嘧啶混合，25℃避光孵育1h。然后，以不同的ssDNA/GO质量比加入氧化石墨烯溶液，充分混合，继续25℃避光孵育20min。15000rpm，25℃，离心10min，吸取含磺胺二甲嘧啶-适配体复合物的上清液，用酶标仪测定其荧光强度(492nm激发，520nm发射)。同时，每个浓度的候选适配体序列分别与不同质量比的GO混合孵育(不加靶标磺胺二甲嘧啶)作为阴性对照，消除候选适配体序列从GO表面自解吸附产生的影响。用GraphPad Prism 5.0软件对每条序列进行非线性回归分析，以候选适配体浓度为横坐标，实验组和对照组的荧光强度差值(ΔF)为纵坐标绘制结合饱和曲线，并计算解离常数(K_d)。如图1显示，No 1，No 5，No 1s，NO 5s亲和力分别为：167.8nM，185.7nM，76.4nM，81.3nM。

将上述DNA片段进行修饰和改造的到的核酸适配体衍生物等也属于本发明保护范围。

6.核酸适配体与磺胺二甲嘧啶的结合特异性实验

取磺胺二甲嘧啶同类的磺胺类药物：磺胺二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉和不同类抗生素硝基呋喃、沙咪珠利，对筛选得到的适配体的特异性进行测定。将100nmol/L适配体分别与磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹噁啉，磺胺二甲氧嘧啶，硝基呋喃和沙咪珠利结合反应60min，加入相同质量比的氧化石墨烯，轻微震荡孵育20min，用酶标仪测上清液的荧光强度，通过候选药物的荧光强度(发射波长520nm)来分析核酸适配体的特异性。由图2显示，相比其他的抗生素，磺胺二甲嘧啶的荧光强度最高，说明No 1s适配体对磺胺二甲嘧啶具有高特异性。

7.标准曲线建立

将FAM荧光标记的适体(100nM)与一系列浓度为0.4-500ng/mL的磺胺二甲嘧啶在200μL的结合缓冲液中于25℃黑暗中孵育1h，GO加入混合物中，在室温黑暗中孵育20min，酶标仪在发射波长520nm处测定荧光强度，并绘制标准曲线。如图3是在不同浓度的磺胺二甲嘧啶(0.4ng/mL～500ng/mL)与No 1s适配体的荧光强度的关系。

实施例2实际样本磺胺二甲嘧啶的测定

从当地超市购买的牛奶和鸡蛋样品，先前经过HPLC分析，证实不含SMZ化合物。取10毫升牛奶样品，首先在4℃的14，000转/分下离心20分钟。上清液用结合缓冲液稀释至100mL，用0.22-μm微孔滤膜过滤。对于鸡蛋样品，充分混合和均质后，向离心管中加入2g鸡蛋样品。然后加入4mL乙酸乙酯摇匀3min。在室温下5000×g离心5min后，将上清液在80℃水浴中吹干或在氮气中吹干，用结合缓冲液稀释至500μL。为了评价所建立的基于氧化石墨烯荧光适配体传感器的回收率，分别用不同浓度的磺胺二甲嘧啶(2.0、10.0、25.0、50.0和100.0ng/mL)添加样品，用所构建的适体传感器进行检测。按照步骤七的操作方法绘制曲线，进行实验和结果的分析。

最低检测限(LOD)计算公式为：LOD＝3*SD/斜率，其中SD表示分别测定20份空白样本(牛奶和鸡蛋)的荧光值的标准偏差。代入方程，计算样本检测限。实验结果：在测试磺胺二甲嘧啶在牛奶和鸡蛋样本中，样本的检测限分别为1.37μg/kg、3.15μg/kg。

回收率如表3，牛奶样本回收率在94.4％～108.8％之间，鸡蛋样品的回收率在93.9％～106.7％之间。该方法在牛奶、鸡蛋中检测变异系数范围分别为：5.4～12.7，5.1～8.8。由变异系数和回收率的结果看，该方法的重复性、准确度较好，可以满足食药现场检测的需要。具体见表3所示。

表3.鸡蛋和牛奶中添加磺胺二甲嘧啶的准确度和精密度(n＝5).

序列表

<110> 重庆师范大学

<120> 一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用

<130> 2019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> No.1

<400> 1

gacaggcagg acaccgtaac gttagacgct ggaccgcgtg tgatcgggtc agctgcaatt 60

ctgctacctc cctcctcttc 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> No.2

<400> 2

gacaggcagg acaccgtaac gctctgggct ggcgatgggc agtgttaaat ttgtgccacc 60

ctgctacctc cctcctcttc 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> No.3

<400> 3

gacaggcagg acaccgtaac gcttgggctg gggatgcccg ataaggagat gcgtccacgc 60

ctgctacctc cctcctcttc 80

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> No.4

<400> 4

gacaggcagg acaccgtaac tgatgtcgat cgtcacttcg acgggataaa cggtataaga 60

ctgctacctc cctcctcttc 80

<210> 5

<211> 80

<212> DNA

<213> No.5

<400> 5

gacaggcagg acaccgtaac taccgggtaa tatgcacaca tgctgatagc aagcaatgca 60

ctgctacctc cctcctcttc 80

<210> 6

<211> 80

<212> DNA

<213> No.6

<400> 6

gacaggcagg acaccgtaac ttacctctct gaggtttcgg ttaggggaag tatagactga 60

ctgctacctc cctcctcttc 80

<210> 7

<211> 9

<212> DNA

<213> No.1s

<400> 7

cgttagacg 9

<210> 8

<211> 9

<212> DNA

<213> No.5s

<400> 8

gctgatagc 9