大麦条纹病致病性基因pgssk1及其应用
阅读说明：本技术 大麦条纹病致病性基因pgssk1及其应用 (Barley stripe disease pathogenicity gene pgssk1 and application thereof ) 是由 王化俊 梁倩倩 汪军成 姚立蓉 孟亚雄 马小乐 李葆春 司二静 杨轲 边秀秀 陈 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供大麦条纹病致病性基因pgssk1及其应用,属于生物技术工程领域,具体提供了一个来源于大麦条纹病菌-麦类核腔菌的新基因pgssk1。pgssk1基因可以调控大麦条纹病菌丝的生长及发育,通过pgssk1基因干扰突变体,培育大批量抗大麦条纹病病菌的突变体植株,可高效解决大麦条纹病病害的侵袭,实现了简单、易行、高效培育抗大麦条纹病植株的目的。新基因pgssk1基因加强了大麦条纹病菌对戊唑醇的敏感性。(The invention provides a barley stripe disease pathogenicity gene pgssk1 and application thereof, belongs to the field of biotechnology engineering, and particularly provides a novel gene pgssk1 derived from barley stripe pathogen-wheat sclerotinia sclerotiorum. The pgssk1 gene can regulate the growth and development of barley stripe disease hypha, and the pgssk1 gene interference mutant can be used for cultivating a large batch of barley stripe disease germ-resistant mutant plants, so that the attack of barley stripe disease can be efficiently solved, and the aim of simply, easily and efficiently cultivating barley stripe disease-resistant plants is fulfilled. The sensitivity of barley stripe germ to tebuconazole is enhanced by the new gene pgssk 1.)
技术领域
本发明属于生物技术工程领域，具体涉及大麦条纹病新基因pgssk1及其调控菌丝生长，渗透压敏感性及抑菌剂耐受性，细胞壁完整性及致病性方面的应用。
背景技术
大麦条纹病(Barley leaf stripe)对大麦的危害严重，是造成大麦减产的主要原因。该病是由种子带菌引起的系统侵染的真菌性病害，而不同丝状真菌中一些信号蛋白具有不同的功能，酵母双组份信号通路中的反映调节剂蛋白RR就是其中之一。在玉米小斑病菌中，RR信号蛋白ChSSK1和ChSKN7都有助于对苯吡咯杀菌剂咯菌腈的渗透适应和敏感性。在红色面包霉中，RR信号蛋白具有多种功能，RRG-1控制营养细胞完整性、高渗敏感性、杀真菌剂抗性，RRG-2只参与氧化应激反应。在稻瘟病菌中，除了对渗透胁迫和氟二氧嘧啶杀菌剂的耐受性增强外，RR信号蛋白还参与了致病性。但是到目前为止，大麦条纹病病原菌中RR蛋白的功能还未研究。本专利主要通过RNAi的方式研究一种编码RR蛋白的pgssk1基因及其在大麦条纹病菌中的功能，旨在为大麦条纹病菌的抗病育种奠定基础。
现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病(麦类核腔菌)pgssk1基因及功能的报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgssk1，通过RNAi干扰技术获得pgssk1突变体，进一步提供了该基因在调控菌丝生长分化，渗透胁迫，抑菌剂耐受性，细胞壁完整性及致病性等方面的功能。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
1.一种大麦条纹病致病性基因pgssk1，该基因全长序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因克隆及其基因功能验证方法，包括如下步骤：
(1)pgssk1基因克隆及序列分析；
(2)pgssk1基因的干扰载体构建；
(3)原生质体制备及载体的遗传转化；
(4)菌丝生长实验；
(5)渗透压敏感性及抑菌剂耐受性实验；
(6)细胞壁完整性实验；
(7)大麦条纹病致病性的测定。
3.一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因在调控菌丝生长速率中的应用。
4.一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因在调节渗透压及真菌抑制剂敏感性方面的应用。
5.一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因在参与细胞壁完整性的应用。
6.一种大麦条纹病致病基因pgssk1在调控大麦条纹病菌致病性方面的应用。
本申请至少具有以下有益效果：
(1)本申请提供了一个来源于大麦条纹病菌-麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)新的基因pgssk1。
(2)pgssk1基因可以调控大麦条纹病菌丝的生长及发育，通过pgssk1基因干扰突变体，培育大批量抗大麦条纹病病菌的突变体植株，可高效解决大麦条纹病病害的侵袭，实现了简单、易行、高效培育抗大麦条纹病植株的目的。
(3)新基因pgssk1基因加强了大麦条纹病菌对戊唑醇的敏感性。
附图说明
图1pgssk1基因的序列
图2Alternaria alternata，Stemphylium lycopersici，Diplodia seriata，Botrytis cinerea，Zymoseptoria tritici，Pyrenophora graminea和Saccharomyces.Cerevisiae序列比对
其中，黑色阴影表示相同的氨基酸，绿色或粉红色阴影表示相似的氨基酸，信号接受体领域加了下划线，缺少的氨基酸用“.”表示，组氨酸激酶同源物磷酸化的磷酸化受***点用“#”表示；
图3pgssk1基因系统发育分析
图4pgssk1基因的REC功能域
图5干扰载体pSilentpgssk1构建示意图
图6干扰载体pSilentpgssk1干扰策略图
图7pgssk1基因的RNAi载体pSilentssk1酶切及PCR验证
其中，M1：markDL2000；M2：markDL10000；1：HindⅢ酶切大小为150bp；2：KpnⅠ和BglⅡ酶切，大小为741bp；3：XhoⅠ酶切，大小为1632bp；4：HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为741bp和150bp；5：BglⅡ和XhoⅠ酶切，大小为891bp和741bp；6：pSilentpgssk1载体的PCR鉴定。
图8干扰株的PCR验证
其中，Markers：markDL10000；1：WT菌株PCR分析验证；2：质粒潮霉素PCR分析验证；3：△pgssk1-8菌株PCR分析验证；4：△pgssk1-24菌株PCR分析验证。
图9PGSSK1重组蛋白的SDS-PAGE分析
其中，M：蛋白质标准分子量；1.pET-32a；2.pET32a-pgssk1；3.pET32a-pgssk1诱导；4.纯化的PGSSK1重组蛋白
图10干扰株的RT-PCR及Westernblot验证
其中，*表示在野生株(WT)和干扰株(△pgssk1-8 and△pgssk1-24)之间的显著性(P≤0.01)；
图11野生株和干扰株在不同培养基上的生长
图12野生株和干扰株在不同渗透压培养基生长
图13野生株和干扰株在不同抑菌剂培养基生长
图14野生株和干扰株在不同细胞壁抑制剂培养基生长
图15野生株和干扰株在不同细胞壁抑制剂培养基生长率
图16野生株WT(A,B)和干扰株△pgssk1(C,D)原生质体释放分析
图17原生质体产量分析
图18几丁质含量分析
图19野生株及干扰株对大麦叶片的致病性检测
其中，(A)两周大的大麦叶片接种5mm的WT、△pgssk1-8和△pgssk1-24菌株，接种3天后拍照记录。(B)用WT、△pgpbs1、△pgssk1-8和△pgssk1-24菌株在4℃处理大麦种子20天后栽培，栽培14天后观察拍照。(C)接种WT、△pgssk1-8和△pgssk1-24菌株后大麦的感染率，星号表示野生株和干扰株之间存在显著差异(P≤0.05)。(D)感染了WT、△pgssk1-8和△pgssk1-24菌株的大麦叶片生长趋势。(E)在野生株WT中△pgssk1-8基因在mRNA的转录水平，星号表示寄生状态和非寄生状态下存在显著差异(P≤0.05)。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因pgssk1，该基因全长序列如序列表SEQID NO:1所示。pgssk1是长度为4906bp的基因，cDNA长度为4209bp，序列包含三个内含子，其中一个49bp的内含子，位于核苷酸1818bp-1866bp位置；一个590bp的内含子，位于核苷酸2203bp-2793bp位置；一个59bp的内含子，位于核苷酸4797bp-4855bp位置。pgssk1基因序列如图1所示。PGSSK1编码1403个氨基酸的蛋白质，PGSSK1的1403氨基酸序列与Alternariaalternata，Stemphylium lycopersici，Diplodia seriata，Botrytis cinerea，Zymoseptoria tritici，和Saccharomyces.cerevisiae的同源性为：69.91％，64.71％，64.88％，57.86％，56.49％和48.92％(图2)。系统发育分析结果显示，P.graminea，A.alternate和S.cerevisiae聚在一起(图3)。CDART(conserved domain architectureretrieval tool)程序(Marchler et al.2017)预测了PGSSK1中保守的CheY同源的REC信号接受体结构域(CheY-homologous receiver，REC domain)(466-620aa)，一个组氨酸激酶同源物磷酸化受***点(513aa)(图4)。
实施例2
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因克隆方法，包括如下步骤：
(1)pgssk1基因的干扰载体构建
如图5所示，按照以pgssk1为靶标的反向重复RNAi载体pSilentpgssk1构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilentpgssk1载体，依据pSilentpgssk1载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和BglⅡ酶切，大小为741bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为1632bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为741bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用BglⅡ和XhoⅠ酶切，大小为891bp和741bp(图7,泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(891bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。
(2)原生质体干扰载体的遗传转化PCR、RT-PCR及western blot验证
在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilentpgssk1，获得36个转化子，通过引物验证获得的三株pgssk1干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，2个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk1基因的相对表达量在RNAi干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24显著下降，△pgssk1-8和△pgssk1-24突变体的相对表达量下降值分别为：46％和47％，△pgssk1-8和△pgssk1-24表达量下降与野生株的表达量呈显著差异(P≤0.01)。
进一步进行western blot验证。PGSSK1蛋白纯化结果见图9，获得152KD左右片段；获得表达结果如图10所示，与荧光定量验证结果一致，△pgssk1-8和△pgssk1-24蛋白表达量较弱。这些结果证实了本研究已经获得了pgssk1的基因干扰株。
表1 pgssk1基因克隆及功能研究用到的引物
实施例3
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因在调控菌丝生长速率中的应用，该应用的验证包括如下步骤：
(1)pgssk1基因的干扰载体构建
按照以pgssk1为靶标的反向重复RNAi载体pSilentpgssk1构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilentpgssk1载体，依据pSilentpgssk1载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和BglⅡ酶切，大小为741bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为1632bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为741bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用BglⅡ和XhoⅠ酶切，大小为891bp和741bp(图7,泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(891bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。
(2)原生质体干扰载体的遗传转化PCR、RT-PCR及western blot验证
在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilentpgssk1，获得36个转化子，通过引物验证获得的三株pgssk1干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，2个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk1基因的相对表达量在RNAi干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24显著下降，△pgssk1-8和△pgssk1-24突变体的相对表达量下降值分别为：46％和47％，△pgssk1-8和△pgssk1-24表达量下降与野生株的表达量呈显著差异(P≤0.01)。
进一步进行western blot验证。PGSSK1蛋白纯化结果见图9，获得152KD左右片段；获得表达结果如图10所示，与荧光定量验证结果一致，△pgssk1-8和△pgssk1-24蛋白表达量较弱。这些结果证实了本研究已经获得了pgssk1的基因干扰株。
(3)pgssk1与大麦条纹病菌菌丝营养生长的关系
为了确定pgssk1与大麦条纹病菌菌丝营养生长的关系，将敲除株与野生株分别置于不同的培养基进行培养，发现大麦条纹病WT中pgssk1基因的干扰突变显著影响了大麦条纹病菌的径向生长，与野生株相比，pgssk1干扰株(△pgssk1-8和△pgssk1-24)在PDA，CM，BM，V8和MM培养基上有较低的生长速度，在PDA，CM，BM，V8和MM培养基上生长速度分别为：△pgssk1-8：9.9，10.2，9.3，9.1和9.1mm/d；△pgssk1-24：9.9，9.6，9.2，9.0和9.0mm/d；WT：10.4，9.5，9.3，8.9和9.3mm/d(图11；表2)，△pgssk1-8，△pgssk1-24与野生株WT间不存在显著差异(P≤0.01)。
表2菌丝在不同培养基上的生长率
实施例4
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因在调解渗透压及真菌抑制剂方面的应用，该应用的验证包括如下步骤：
(1)pgssk1基因的干扰载体构建
按照以pgssk1为靶标的反向重复RNAi载体pSilentpgssk1构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilentpgssk1载体，依据pSilentpgssk1载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和BglⅡ酶切，大小为741bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为1632bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为741bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用BglⅡ和XhoⅠ酶切，大小为891bp和741bp(图7,泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(891bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。
(2)原生质体干扰载体的遗传转化PCR、RT-PCR及western blot验证
在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilentpgssk1，获得36个转化子，通过引物验证获得的三株pgssk1干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，2个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk1基因的相对表达量在RNAi干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24显著下降，△pgssk1-8和△pgssk1-24突变体的相对表达量下降值分别为：46％和47％，△pgssk1-8和△pgssk1-24表达量下降与野生株的表达量呈显著差异(P≤0.01)。
进一步进行western blot验证。PGSSK1蛋白纯化结果见图9，获得152KD左右片段；获得表达结果如图10所示，与荧光定量验证结果一致，△pgssk1-8和△pgssk1-24蛋白表达量较弱。这些结果证实了本研究已经获得了pgssk1的基因干扰株。
(3)pgssk1基因与渗透压及真菌抑制剂的相关性
为检测pgssk1基因在适应渗透压中扮演的角色，野生株和干扰株(△pgssk1-8和△pgssk1-24)菌株在以下类型培养基培养：离子胁迫(Na+)，氧化胁迫(H2O2)，重金属胁迫(CoCl2)，渗透压胁迫(山梨醇)和真菌抑制剂胁迫(二甲酰亚胺类真菌抑制剂异丙脲和***类真菌抑制剂戊唑醇)。
在山梨醇胁迫下野生株和干扰株WT，△pgssk1-8和△pgssk1-24的径向生长率是8.7，6.1和6.1mm/d，干扰株的生长率显著下降(P≤0.05)；在离子胁迫(Na+)下干扰株生长率显著下降(△pgssk1-8，2.9％和△pgssk1-24，2.7％对WT，3.7％)(P≤0.05)。在氧化胁迫(H2O2)、重金属胁迫(CoCl2)和甘油胁迫下没有显著差异(图12，表3)。以上结果说明pgssk1基因与金属离子(Na+)及渗透压(Sorbitol)胁迫相关。
表3野生株和干扰株在不同胁迫培养基上的生长率
真菌抑制剂敏感性实验表明，干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24对戊唑醇的敏感性显著性高于野生株WT(P≤0.05)(图13；表4)。△pgssk1-8和△pgssk1-24在戊唑醇的径向生长率为2.9和2.9mm/d，野生株在戊唑醇的径向生长率为3.6mm/d。干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24在戊唑醇平板的生长率百分比为8.5和8.5％，显著低于野生株WT 11.3％(P≤0.05)。以上结果说明pgssk1基因加强了大麦条纹病菌对戊唑醇的敏感性。
表4野生株和干扰株在不同抑菌剂培养基上的生长率
实施例5
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk1基因在参与细胞壁完整性的应用，该应用的验证包括如下步骤：
(1)pgssk1基因的干扰载体构建
按照以pgssk1为靶标的反向重复RNAi载体pSilentpgssk1构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilentpgssk1载体，依据pSilentpgssk1载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和BglⅡ酶切，大小为741bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为1632bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为741bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用BglⅡ和XhoⅠ酶切，大小为891bp和741bp(图7,泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(891bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。
(2)原生质体干扰载体的遗传转化PCR、RT-PCR及western blot验证
在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilentpgssk1，获得36个转化子，通过引物验证获得的三株pgssk1干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，2个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk1基因的相对表达量在RNAi干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24显著下降，△pgssk1-8和△pgssk1-24突变体的相对表达量下降值分别为：46％和47％，△pgssk1-8和△pgssk1-24表达量下降与野生株的表达量呈显著差异(P≤0.01)。
进一步进行western blot验证。PGSSK1蛋白纯化结果见图9，获得152KD左右片段；获得表达结果如图10所示，与荧光定量验证结果一致，△pgssk1-8和△pgssk1-24蛋白表达量较弱。这些结果证实了本研究已经获得了pgssk1的基因干扰株。
(3)pgssk1基因与细胞壁完整性的相关性
为了进一步确定pgssk1基因与细胞壁完整性的相关性，将野生株和干扰株接种到几种细胞壁抑制剂CR(100μg/mL)、SDS(0.01％)和CFW(200μg/mL)平板(图14)，CFW是通过与菌丝的细胞壁的几丁质结合，抑制真菌细胞壁组装几丁质和β-1,4-葡聚糖。CR通过与细胞壁中的β-1,3-葡聚糖结合，阻碍了细胞壁成分的正常组装；SDS可降低细胞膜稳定性，细胞壁受损可使真菌敏感性增加。干扰株菌丝的增长率在刚果红(CR)平板的生长与WT类似。然而，在SDS和CFW平板上，△pgssk1-8和△pgssk1-24相对增长率明显低于WT(△pgssk1-8：37.0％和8.2％，△pgssk1-24：36.8％和8.3％；对比WT：42.9％和12.3％；P≤0.05)(图15)。
为进一步验证细胞壁完整性，本研究对野生株WT和干扰株(△pgssk1-8、△pgssk1-24)进行了酶解细胞壁释放原生质体实验，结果见图16和图17，原生质体释放率为干扰株△pgssk1-8的4.6×108个/g、△pgssk1-24的4.3×108个/g，野生株1.05×108个/g，干扰株(△pgssk1-8、△pgssk1-24)原生质体释放率显著高于野生株原生质体释放率(P≤0.05)，这说明比较野生株WT干扰株细胞壁更容易被酶解。
CFW平板上干扰株相对生长速度显著低于野生株，其中CFW是通过与菌丝的细胞壁的几丁质结合，抑制真菌细胞壁组装几丁质和β-1,4-葡聚糖，几丁质主要分布在细胞壁中，本研究假设干扰株细胞壁几丁质含量有变化，本研究对细胞壁几丁质含量进行了测定，发现干扰株中△pgssk1-8和△pgssk1-24的几丁质含量低于WT(0.85％和0.82％对比0.96％；P≤0.05)差异显著(图18)。这些结果表明，pgssk1是细胞壁完整性的影响基因。
实施例6
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk1在调控大麦条纹病菌致病性方面的应用，该应用的验证包括如下步骤：
(1)pgssk1基因的干扰载体构建
按照以pgssk1为靶标的反向重复RNAi载体pSilentpgssk1构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilentpgssk1载体，依据pSilentpgssk1载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和BglⅡ酶切，大小为741bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为1632bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为741bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用BglⅡ和XhoⅠ酶切，大小为891bp和741bp(图7，泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(891bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。
(2)原生质体干扰载体的遗传转化PCR、RT-PCR及western blot验证
在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilentpgssk1，获得36个转化子，通过引物验证获得的三株pgssk1干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，2个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk1基因的相对表达量在RNAi干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24显著下降，△pgssk1-8和△pgssk1-24突变体的相对表达量下降值分别为：46％和47％，△pgssk1-8和△pgssk1-24表达量下降与野生株的表达量呈显著差异(P≤0.01)。
进一步进行western blot验证。PGSSK1蛋白纯化结果见图9，获得152KD左右片段；获得表达结果如图10所示，与荧光定量验证结果一致，△pgssk1-8和△pgssk1-24蛋白表达量较弱。这些结果证实了本研究已经获得了pgssk1的基因干扰株。
(3)pgssk1基因与大麦条纹病菌致病性的相关性
为了评估pgssk1的致病性，本研究将野生株及干扰株的菌栓接种大麦叶片。接种WT菌株的大麦叶片呈现严重感染的症状，出现黄褐色病斑。对应的，接种干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24菌株的大麦叶片症状较少，没有形成完整的病斑(图19-A)。接种野生株及干扰株的大麦种子播种20天后观察大麦生长趋势(图19-D)。大麦感染WT菌株大麦植株生长较弱，表现出现条纹叶表面(图19-B)。感染△pgssk1-8和△pgssk1-24菌株的大麦较强壮，大麦叶片条纹病的发病率和△pgssk1-8(4％)和△pgssk1-24(4.3％)显著低于WT(20.1％)(P≤0.05)(图19-E)。因此，干扰株△pgssk1-8和△pgssk1-24致病性比WT弱。与非寄生期相比，WT寄生期pgssk1转录水平显著降低(P≤0.01)，寄生菌株pgssk1相对表达上升3.74倍(图19-E)。这些结果表明，pgssk1基因与大麦条纹病病原菌致病性密切相关。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110> 甘肃农业大学
<120> 大麦条纹病致病性基因pgssk1及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 4906
<212> DNA
<213> 大麦条纹病菌-麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）
<400> 1
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