含有Hdac3突变的载体及其在基因***中的应用
阅读说明：本技术 含有Hdac3突变的载体及其在基因***中的应用 (Vector containing Hdac3 mutation and application thereof in gene therapy of tumor ) 是由 杨衡 李利利 刘俊骁 马瑜婷 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本公开提供一种含有Hdac3突变的载体及其在基因治疗肿瘤中的应用。具体来说,本公开涉及一种表达盒,含有所述表达盒的重组载体和重组腺相关病毒。与此同时,本公开还涉及含有上述成分的药物组合物、载体及其应用,并且进一步提供了缓慢持续杀伤细胞的方法。本公开提供的载体具有良好地抑制肿瘤的效果。(The present disclosure provides a vector containing a mutation of Hdac3 and its use in gene therapy of tumors. In particular, the present disclosure relates to an expression cassette, a recombinant vector and a recombinant adeno-associated virus containing the expression cassette. Meanwhile, the disclosure also relates to a pharmaceutical composition containing the components, a carrier and application thereof, and further provides a method for slowly and continuously killing cells. The carrier provided by the disclosure has good tumor inhibition effect.)
技术领域
本公开属于生物技术领域。具体来说，本公开涉及含有Hdac3突变的载体及其在基因***中的应用。
背景技术
肿瘤疾病是影响人类健康的重要疾病之一，长时间以来一直困扰着人们，每年在全球都有成千上万的人死于癌症[1]。科学工作者们也一直在探索寻求良好的治疗方案，探索癌症发生发展的原因。目前的肿瘤治疗方案有手术切除，化疗放疗以及免疫治疗方法等等，这些肿瘤治疗方法都是比较成熟并且有一定效果的治疗方法。
近几年，在肿瘤治疗方面，肿瘤免疫治疗方法有了突飞猛进的发展，也在肿瘤的治疗上取得了***的成果。比如PD-1，CTLA-4等免疫检测点抑制剂的发现与相关抗体在临床上的应用[2,3]。癌症患者在使用免疫检测点的阻断剂以后，会激活机体的抗肿瘤免疫。但是，抗体药物的毒副作用也比较大，通常会引起患者的自身免疫疾病以及机体的炎症反应。
随着研究的深入，科研工作者发现表观遗传学在癌症治疗中发挥着巨大的作用，应用表观遗传学的原理，对肿瘤细胞内某个基因的调控(比如组蛋白去乙酰化酶3，histonedeacetylase 3，Hdac3)[4]，使肿瘤细胞内的信号通路发生变化，增强肿瘤细胞的免疫原性，以此来激活免疫系统，从而达到杀伤肿瘤细胞和治疗癌症的目的[5,6]。
近些年，科研工作者们发现溶瘤病毒在肿瘤治疗方面发挥巨大作用，其中腺相关病毒(AAV)就是一种非常好的病毒，腺相关病毒是无包膜的，游离的和拥有溶解性的dsDNA的病毒。
AAV独特的特征在于，其作为例如在基因治疗中将外源DNA递送至细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，並且人类及其他动物的自然感染是沉默的及无症状的。而且，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许活体內靶向许多不同组织的可能性。而且，AAV转导缓慢***和非***细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA 具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组 (编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用如含有启动子、感兴趣的DNA和多腺苷酸化信号的基因盒等外源DNA替代。rep蛋白和cap蛋白可以以反式提供。AAV的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。
与此同时，腺相关病毒具有广泛的组织嗜性，属于用于基因治疗和溶瘤的研究最深入的病毒载体。腺相关病毒除了具有强大的裂解活性外，在药理应用方面还具有许多显着优势。腺相关病毒基因组易于进行基因操作。在病毒制造方面，腺相关病毒可以高滴度产生，并且颗粒具有优异的物理化学稳定性[7]。关于腺相关病毒的临床适用的安全性方面，它的肿瘤选择性复制已被认为是，它可以有效防止腺相关病毒对非靶标的健康组织过度损伤[8]。
但是，在临床上，现有的肿瘤治疗方案有手术切除肿瘤，化疗或放疗治疗，肿瘤免疫学治疗方案(免疫检测点阻断，比如PD-1抗体在临床上的应用)。但是，这些治疗方案在临床上面都有或多或少的问题，无法满足病人希望得到良好治疗的希望。例如，手术切除治疗，存在切除不彻底的现象；化疗或放疗治疗方案，牵一发而动全身，对病人的身体伤害比较大；免疫检测点阻断的治疗方式，所使用的免疫检测点阻断的抗体药物，其毒副作用比较大，通常会引起患者的自身免疫疾病以及机体的炎症反应。
与此同时，现有技术中并未公开任何组蛋白去乙酰化酶3整合入腺相关病毒，用于***疾病的报道。
非专利文献
1.Torre,L.A.,et al.,Global Cancer Incidence and Mortality Rates andTrends—An Update.2016.25(1):p.16-27.
2.Sharma,P.and J.P.J.S.Allison,The future of immune checkpointtherapy.2015. 348(6230):p.56-61.
3.Hodi,F.S.,et al.,Improved Survival with Ipilimumab in Patients withMetastatic Melanoma.2010.363(8):p.711-723.
4.HuLl,E.E.,M.R.Montgomery,and K.J.J.B.R.I.Leyva,HDAC Inhibitors asEpigenetic Regulators of the Immune System:Impacts on Cancer Therapy andInflammatory Diseases.2016.2016:p.8797206.
5.Eckschlager,T.,et al.,Histone Deacetylase Inhibitors as AnticancerDrugs.2017. 18(7):p.1414.
6.West,A.C.and R.W.J.J.o.C.I.Johnstone,New and emerging HDACinhibitors for cancer treatment.2014.124(1):p.30-39.
7.Niemann,J.and F.J.V.G.Kuhnel,Oncolytic viruses:adenoviruses.2017.53(5):p. 700-706.
8.Hill,C.and R.J.E.O.o.D.D.Carlisle,Achieving systemic delivery ofoncolytic viruses. 2019.16(6):p.607-620.
发明内容
发明要解决的问题
本公开的目的是通过腺相关病毒的载体来承载酶活性位点突变的Hdac3的基因序列进入肿瘤组织，从而起到抑制组蛋白去乙酰化酶3(Hdac3)的作用，进而激活抗肿瘤免疫，抑制肿瘤的生长，达到治疗癌症的目的。
在一种实施方式中，本公开提供了一种肿瘤的治疗方法。具体来说，把Hdac3抗肿瘤治疗的靶点与腺相关病毒载体在肿瘤治疗方面的优势结合起来，制作成载有酶活性位点突变的Hdac3序列的腺相关病毒，进而对肿瘤病人进行治疗。
用于解决问题的方案
本公开提供了如下技术方案。
(1)一种表达盒，其中，所述表达盒包含编码突变的Hdac3蛋白的序列。
(2)根据(1)所述的表达盒，其中，所述突变的Hdac3蛋白和野生型Hdac3蛋白相比，具有至少降低或者消失的野生型Hdac3蛋白活性；
其中，编码所述野生型Hdac3蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的序列。
(3)根据(1)-(2)任一项所述的表达盒，其中，所述突变的Hdac3蛋白的序列和如SEQ ID NO：1所示的序列相比，具有90％以上的同源性；可选的，编码所述突变的Hdac3 蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示的序列。
(4)一种重组载体，其包含(1)-(3)任一项所述的表达盒的序列。
(5)根据(4)所述的重组载体，其中，所述重组载体选自重组病毒载体。
(6)根据(5)所述的重组载体，其中，所述重组病毒载体为重组腺相关病毒载体。
(7)一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据(4)-(6)任一项所述的重组载体。
(8)根据(7)所述的药物组合物，其还含有药学上可接受的载剂；可选的，所述药物组合物还含有放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂。
(9)(4)-(6)任一项所述的重组载体或(7)-(8)任一项所述的药物组合物在制备用于杀死细胞的药物中的应用。
(10)根据(9)所述的应用，其中，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
(11)(4)-(6)任一项所述的重组载体或(7)-(8)任一项所述的药物组合物在制备用于***患者的药物中的应用。
在一个具体的实施方式中，所述治疗为基因治疗。
(12)一种缓慢持续杀伤细胞的方法，包括将所述细胞与(4)-(6)任一项所述的重组载体或(7)-(8)任一项所述的药物组合物接触。
(13)一种治疗疾病的方法，包括向患者施用(4)-(6)任一项所述的重组载体或(7)-(8)任一项所述的药物组合物；可选的，所述疾病为肿瘤或癌症。
在本公开的一种实施方式中，本公开通过基因治疗的手段，对于肿瘤或癌症相关疾病进行治疗。
发明的效果
在一个实施方式中，我们利用腺相关病毒为载体，搭载酶活性位点突变的组蛋白去乙酰化酶3的序列，应用此腺相关病毒感染小鼠肿瘤组织。结果发现，此时肿瘤组织的生长得到抑制，说明酶活性位点突变的组蛋白去乙酰化酶3在进入肿瘤组织的细胞后，干扰到了肿瘤细胞内正常的Hdac3的功能，从而起到了抑制肿瘤的效果。
附图说明
图1示出了构建HDAC3敲除的MCA205细胞系，以及此细胞系的动物模型实验结果。其中，A部分示出了应用CIRSPR/Cas9技术敲除Hdac3之后，用Western blot的实验方法验证细胞中Hdac3基因是已经敲除的。B部分示出了应用基因测序的方法验证 Hdac3基因的敲除。C部分示出了肿瘤细胞系的小鼠皮下移植瘤动物模型实验结果，在 C57/BL6小鼠皮下注射野生型与Hdac3基因缺失的MCA205细胞，其肿瘤生长情况的统计图。
图2示出了Hdac3基因的缺失增强肿瘤细胞抗原提呈的能力。其中，A部分是检验肿瘤细胞抗原提呈的ELISPOT实验，我们使用过表达OVA蛋白的MCA205 WT细胞与过表达OVA蛋白MCA205 Hdac3 KO细胞与OT-1小鼠的外周血混配的方式，检验Hdac3 基因的缺失对肿瘤细胞抗原提呈的影响。B部分是对A部分实验结果的统计图。
图3示出了敲除Hdac3的MCA205细胞的肿瘤组织的免疫组分分析实验结果。其中，在小鼠皮下做移植瘤模型的肿瘤组织，在小鼠皮下移植肿瘤细胞7天的时候，取下肿瘤组织，A部分是肿瘤组织的免疫荧光实验的统计图，统计的是，在激光共聚焦显微镜下， 600*600um的范围内，野生型与Hdac3基因敲除组CD4+T细胞，CD8+T细胞的数量。B 部分为免疫组分分析的流式检测的实验结果，具体示出了野生型与Hdac3基因敲除组 CD4+T细胞，CD8+T细胞占肿瘤组织细胞的比例以及可以分泌IFN-γ的细胞的比例。
图4示出了肿瘤坏死因子(TNF-α)对Hdac3缺失的肿瘤细胞的影响。其中，A部分示出了在TNF-α的作用下，野生型细胞与Hdac3缺失的肿瘤细胞发生不同程度的凋亡, 用流式检测的结果。B部分是对A部分结果的统计图。C部分示出了把TNF-α作用后的细胞提取蛋白质，用WB的方法验证凋亡的发生的结果。D部分示出了TNF-α激活凋亡信号通路。我们用Caspase的阻断剂Z-VAD来处理细胞，在此条件下，TNF-α对Hdac3 缺失的肿瘤细胞的影响。E部分是对D部分的结果的统计图。
图5示出了酶活性位点突变的Hdac3基因对肿瘤的生长起抑制作用。其中，A部分示出了构建过表达酶活性突变的Hdac3基因序列(其中将组蛋白去乙酰化酶3的134-135，143-144，170，172，259，266，296，298，424位点突变为丙氨酸)的MCA205的肿瘤细胞系，用此细胞系与野生型的细胞系在小鼠皮下做移植瘤动物实验结果，结果显示过表达了酶活性位点突变的Hdac3序列的肿瘤细胞在小鼠体内生长明显变慢。B部分示出了把酶活性位点突变的组蛋白去乙酰化酶3的基因序列加载到腺相关病毒内，注射到小鼠肿瘤组织内部***，对肿瘤有明显的治疗效果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
本公开中的载体接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。
本公开中的术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。
本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的载体给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。
本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。
本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-***和选择性***受体调节剂、抗-孕酮、***受体下调剂、***受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。
本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、 TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab) 和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对PD-L1、 PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
在本公开中，术语“药学上可接受的制剂”、“生理学上可接受的制剂”或“药学上可接受的载剂”意谓生物学上可接受的制剂、气体、液体或固体或其混合物，其适合一种或多种给药途径、体内递送、体外递送或接触，且可包括针对其他疾病的疗法(例如针对其他眼部疾病的基因疗法或细胞疗法)中所用的制剂或载剂。“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”组合物为一种非在生物学上或其他方面非所欲的材料，例如该材料可施用至个体而不引起实质性非所欲的生物效应。因此，此药学组合物可用于例如施用蛋白质、多核苷酸、质粒、病毒载体或纳米颗粒至细胞或受试者。这些组合物包括但不限于与药物施用或体内或体外接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如，水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散及悬浮介质、包衣、等张剂及吸收促进剂或延迟剂。水性及非水性溶剂、溶液及悬浮液可以包括悬浮剂、润滑剂及增稠剂。这些药学上可接受的载剂包括锭剂(有包衣或无包衣)、胶囊(硬的或软的)、微珠、粉末剂、颗粒剂及晶体。亦可在组合物中掺入补充性活性化合物(例如，防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂及抗真菌剂及免疫抑制剂)。如本文中所阐述或熟习此项技术者所知，可以将药学组合物配制成与特定的给药或递送途径相容。因此，药学组合物包括适合于借由各种途径给药的载剂、稀释剂或赋形剂。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”。在本公开中，术语“突变”是指氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
如本公开所使用的，在两种核酸或多肽比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。
如本公开所使用的，两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸或缺失核苷酸而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸或缺失氨基酸而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
示例性的，在本公开中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸或氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约10个残基的区域、至少约15个残基的区域，至少约18个残基的区域，至少约20个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
在本公开中，术语“腺相关病毒(AAV)”是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复(ITR)。现有技术中存在多种血清型AAV，并且前述AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。示例性的，AAV血清型2 (AAV-2)基因组的核苷酸序列在如由Ruffing等人《普通病毒学杂志》75:3385-3392(1994) 中提出。作为另一例子，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供； AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在 GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供； AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8 基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供(也参见涉及AAV-8的美国专利7,282,199和7,790,449)；AAV-9基因组在Gao等人，《病毒学期刊》，78:6381-6388 (2004)中提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》，13(1):67-76(2006)中提供；和AAV-11基因组在《病毒学(Virology)》，330(2):375-383(2004)中提供。
在本公开的一个实施方式中，腺相关病毒可以选自AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-4，AAV-5，AAV-6，AAV-7，AAV-8，AAV-9，AAV-10，AAV-11中的任意一种或多种。
在本公开的一个实施方案中，提供一种表达盒，其包括如本公开中所描述的核酸分子及一个或多个可操作地连接至核酸序列的调节序列。在另一实施方案中，提供一种载体，其包括如本公开中所描述的核酸分子或如本公开中所描述的表达盒。
在一些实施方案中，载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由以下载体组成的组：重组腺病毒载体、重组慢病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体、重组仙台病毒载体及重组逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体为重组腺相关病毒载体或质粒。
在另一些实施方案中，载体为质粒或非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体选自由裸核酸(naked nucleic acid)、脂质体、树状体(dendrimer)及纳米颗粒组成的群。
在本公开的一个具体的实施方案中，所述Hdac3蛋白的序列为和野生型Hdac3蛋白相比，降低或者失去原Hdac3蛋白活性的蛋白所编码的序列。
在本公开的一个具体的实施方案中，所述Hdac3蛋白的序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
在本公开中，不同序列编号所示的核苷酸或氨基酸的编号的含义如下：
SEQ ID NO：1所示的序列是野生型Hdac3蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2所示的序列是示例性的突变型Hdac3蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3所示的序列是示例性的突变型Hdac3蛋白的核苷酸序列。
本公开的实施方案
本公开中是基于拥有酶活性位点突变的Hdac3基因序列的腺相关病毒，在治疗癌症中有非常好的疗效，我们发现这一效果是有很多前期的实验证明的。
我们已知I类Hdac家族的抑制剂对肿瘤的生长有明显的抑制的作用。例如Entinostat (MS-275)强烈抑制Hdac1和Hdac3；RGFP966是一种Hdac3抑制剂等等，已经有很多的文献对此效果进行了报道，可以知道I类Hdac家族是一个非常好的肿瘤治疗的靶点。在此我们选择I类Hdac家族中的Hdac3来做肿瘤细胞的基因敲除来研究它们对肿瘤生长的作用，结果发现Hdac3的缺失对肿瘤具有非常明显的抑制效果。所以我们希望找到一个安全有效的运用Hdac3这一肿瘤治疗靶点的方法，来进行对肿瘤的治疗。
我们首先是在MCA205细胞(小鼠纤维肉瘤细胞)中应用CRISPR/Cas9技术敲除细胞中的Hdac3基因，然后用敲除Hdac3基因的细胞系，在C57/BL6小鼠身上做移植瘤模型的动物实验(皮下植瘤)，用野生型的肿瘤细胞系做对照，发现HDAC3基因敲除之后，小鼠皮下的肿瘤组织生长缓慢并且在肿瘤生长到第十天左右的时候就全部消退。根据此结果可以提示我们干扰Hdac3在肿瘤细胞中的表达可以抑制肿瘤的生长，对我们后面的研究起到了很好的提示作用。
随后为了验证Hdac3基因的缺失对肿瘤免疫原性，特别是肿瘤抗原提呈能力的影响，我们做了肿瘤细胞的酶联免疫斑点实验(ELISPOT)。首先我们在MCA205 WT细胞与MCA205 Hdac3 KO细胞上面过表达OVA蛋白，OVA蛋白表达在细胞膜的表面，然后与表达OVA蛋白受体的T细胞混配，然后检测T细胞的被激活的情况，通过ELISPOT实验检测T细胞分泌的IFN-γ的多少，来判断Hdac3基因的缺失对肿瘤细胞抗原提呈能力的影响。实验结果发现，缺失Hdac3基因的肿瘤细胞那一组实验，IFN-γ的分泌量明显比野生型细胞组的多很多，说明在肿瘤细胞中，Hdac3基因的缺失可以使肿瘤细胞的抗原提呈能力明显增加，这为我们下面的实验提供了充分的依据。
然后我们进一步研究Hdac3的缺失是如何影响肿瘤的生长的，Hdac3的基因敲除是否在小鼠体内激活了抗肿瘤免疫。我们在移植瘤模型实验中，在小鼠皮下肿瘤组织生长到第七天的时候，取下肿瘤组织，做冷冻切片，免疫荧光实验，结果发现在Hdac3基因敲除的肿瘤组织中明显有很多CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润。说明在肿瘤细胞中敲除Hdac3基因，可以增加肿瘤细胞的免疫原性并激活抗肿瘤免疫。这一结果提示我们，我们可以在临床上面，在病人的肿瘤组织内部干扰肿瘤细胞的Hdac3的表达，以此来达到抑制肿瘤生长的目的。
进而，我们还在Hdac3基因是如何影响肿瘤生长的这一方面做出研究，结果我们发现，与野生型肿瘤细胞相比，缺失Hdac3基因的MCA205肿瘤细胞，在肿瘤坏死因子 (TNF-α)的作用下，发生了凋亡。我们已知TNF-α作用下，可以激活细胞的凋亡信号通路。由此提示我们Hdac3的缺失让肿瘤细胞更容易发生凋亡，这对我们应用Hdac3作为***的靶点提供了理论依据。
根据上面的实验基础，我们希望找到能够在肿瘤中抑制Hdac3并且可以应用于临床的方法，然后我们想到在从基因层面来找解决问题的方法。众所周知，突变蛋白的编码序列可以导致蛋白功能的丧失，我们就想通过此理论来找到可以临床应用的方法。
首先，我们对Hdac3进行多位点基因突变，把酶活性位点突变的HDAC3序列(组蛋白去乙酰化酶3的134-135，143-144，170，172，259，266，296，298，424位点突变为丙氨酸)转入肿瘤细胞中，观察此时肿瘤的生长会不会受到影响，结果我们发现在野生型肿瘤细胞MCA205里面转入酶活性位点突变的Hdac3序列后，肿瘤细胞在小鼠体内的生长得到了充分抑制。
然后我们希望利用腺相关病毒的肿瘤选择性复制的优势，基于腺相关病毒，让腺相关病毒搭载着酶活性位点突变的Hdac3的基因序列，进入肿瘤组织内部，腺相关病毒发挥其感染功能，抑制肿瘤细胞中的组蛋白去乙酰化酶3的作用，从而抑制肿瘤的生长。
在此，我们在C57/BL6小鼠身上做了皮下移植瘤的动物实验，小鼠皮下注射2*106个MCA205野生型细胞，实验分两组进行，每组五只小鼠；其中一组，在肿瘤组织生长到第七天的是，给小鼠肿瘤组织内部注射腺相关病毒1012个颗粒数，；另一组给予空载的腺相关病毒。结果发现，给与腺相关病毒治疗的小鼠肿瘤生长明显慢了很多。说明此腺相关病毒拥有一定的肿瘤治疗效果，并且有一定的临床推广价值。
综上所述，在本公开中，我们首先基于Hdac3基因在肿瘤免疫原性调控中的作用的研究，发现Hdac3基因是一个非常好的肿瘤免疫调控靶点，在肿瘤细胞中缺失Hdac3基因以后，肿瘤组织内部免疫细胞浸润增加，并且肿瘤组织在短时间内出现消退。基于上述发现，我们把酶活性位点突变的Hdac3基因转入野生型的肿瘤细胞，从而抑制正常的组蛋白去乙酰化酶3发挥作用，进而抑制了肿瘤的生长。利用此发现，我们将酶活性位点突变的Hdac3基因加载到腺相关病毒中，制备成为载体，用于***。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
实施例1：利用CRISPR/Cas9技术获得Hdac3基因敲除的MCA205细胞系，并利用此细 胞系做动物实验，检验其免疫原性的变化
1.1实验试剂，材料
(1)细胞：MCA205细胞(小鼠纤维肉瘤细胞)，HEK293T细胞(人胚肾细胞)，细胞均是购自ACTCC。
(2)动物：C57/BL6(北京维通利华实验动物技术有限公司)
(3)试剂与仪器
DMEM(Gibco)
Lipo-fectamine 3000(invitrogen，L3000-015)
CO2培养箱(Thermo fisher)
倒置显微镜(Olympus)
1.2实验过程
(1)基因敲除：合成基因敲除所用的sgRNA：
F：CACCGCCCAATGAAACCTCATCGCC(SEQ ID NO：4)
R：AAACGGCGATGAGGTTTCATTGGGC(SEQ ID NO：5)
用于构建含有此sgRNA的Lenti V2质粒。
1)培养HEK293T细胞，待细胞状态良好后开始使用，在6孔板中铺板，每孔1*106的细胞。
2)第二天，待六孔板中的HEK293T细胞密度在30％-50％之间时开始包装慢病毒。
Lenti V2骨架质粒的构建：首先用Bsmb I酶来切割V2质粒，1％的琼脂糖凝胶电泳，跑胶然后切胶回收目的条带，获得线性化的V2质粒。用DNA连接酶将线性化的V2质粒和sgRNA连接在一起，构建成完整的质粒，扩增质粒。
慢病毒包装方法：第一步，质粒的混合：以Lenti V2为骨架质粒，pVSVg/psPAX2 为包膜质粒，包装慢病毒。其中每个六孔板中各个质粒的用量：连接有sgRNA的V2是 1.33μg，pVSVg是0.67μg，psPAX2是1μg。第二步，Lipofectamine 3000 6μL与opti-MEM 90μL混合，然后与第一步的三种质粒混合，室温下静置5分钟。第三步，将6μL的P3000 与90μL的opti-MEM混合，然后与上述混合体系混合，室温下静置25分钟。25分钟之后，将上述混合脂质体液体加入到培养HEK293T细胞的六孔板中，六孔板中需要有培养基1.5mL。放入CO2培养箱培养48h。然后收细胞培养基，经过0.22um滤膜过滤，即得到慢病毒病毒液，用于感染细胞。
3)培养MCA205 WT细胞，待细胞状态良好的时候，1*106的细胞密度铺六孔板，第二天，在细胞培养基中加入病毒液，每孔加入1mL的病毒液，感染48小时。
4)puro筛选。将病毒感染48h后的细胞，用含有puro的培养基培养，直到没有细胞死亡为止。
5)基因敲除细胞的单克隆化。取出一部分细胞，用流式分选技术，在96孔板中，每个孔打入一个细胞。在CO2培养箱中培养7-14天左右，扩增单克隆细胞。
(2)基因敲除的鉴定：用Western blot验证是否基因敲除和基因测序的方法鉴定Hdac3基因是否敲除。Western blot鉴定。待96孔板中细胞长满后，将细胞转移到24孔板中，扩增细胞，取一部分细胞，提蛋白质，做WB实验，鉴定细胞中是否还有目的基因的表达，如果没有了目的基因的表达则说明这个单克隆后的细胞系是基因敲除的细胞系。基因测序法鉴定时，提取单克隆细胞的DNA，去测序，与野生型细胞比较是否存在基因的缺失。
(3)动物实验：获得了Hdac3基因敲除的MCA205细胞系之后，做皮下移植瘤的动物模型实验，分两组进行，每组五只C57/BL6小鼠，一组是野生型的MCA205肿瘤细胞，一组是Hdac3基因敲除的MCA205细胞，每只小鼠皮下注射2*106个细胞。观察肿瘤生长情况，绘制肿瘤生长曲线。
1.3实验结论
实验结果见图1。通过此实验，结果发现在肿瘤细胞内敲除HDAC3之后，在肿瘤细胞的移植瘤动物模型中，肿瘤生长得到了抑制。可以说明，组蛋白去乙酰化酶3(Hdac3) 是一个很好的***的位点，提示我们抑制Hdac3可能具有***的作用。
实施例2：Hdac3基因的缺失对肿瘤细胞的抗原提呈能力的影响
2.1实验材料
(1)动物：OT-1小鼠：此小鼠T细胞特异性表达OVA蛋白的受体。购自百奥赛图基因生物技术有限公司
(2)试剂：
1640培养基(Gibco)
红细胞裂解液(solarbio，Cat：R1010)
ELISPOT试剂盒(BD公司)
(3)仪器：
酶联免疫斑点分析仪(CTL，S6)
2.2实验过程
(1)构建过表达OVA的细胞系
在此实验中，需要我们在MCA205 WT与MCA205 KO Hdac3细胞上过表达OVA蛋白。过表达细胞系的构建的具体步骤如下：
1)培养HEK293T细胞，包装慢病毒，待细胞状态良好后开始使用，在6孔板中铺板，每孔1*106的细胞。第二天，待六孔板中的HEK293T细胞密度在30％-50％之间时开始包装慢病毒。
慢病毒包装方法：第一步，质粒的混合：以质粒VP64-OVA-GFP为表达质粒，pVSVg与psPAX2为包膜质粒，包装慢病毒。其中每个六孔板中各个质粒的用量：VP64-OVA-GFP 是1.33μg，pVSVg是0.67μg，psPAX2是1μg。第二步，Lipofectamine 3000 6μL与opti-MEM 90μL混合，然后与第一步的三种质粒混合，室温下静置5分钟。第三步，将6μL的P3000 与90μL的opti-MEM混合，然后与上述混合体系混合，室温下静置25分钟。25分钟之后，将上述脂质体混合液加入到培养HEK293T细胞的六孔板中，六孔板中需要有培养基 1.5mL。放入CO2培养箱培养48h。然后收细胞培养基，经过0.22um滤膜过滤，即得到慢病毒病毒液，用于感染细胞。
2)慢病毒感染细胞。培养MCA205 WT与MCA205 Hdac3 KO细胞，待细胞状态良好以后，在六孔板里面铺板，每孔1*106的细胞。第二天，待六孔板中的细胞密度在30％-50％之间时开始用慢病毒来感染细胞，在细胞培养基的上清中加入1mL的上面得到的病毒液。然后培养细胞48小时。
3)分选出过表达的细胞系。病毒感染48小时以后，荧光显微镜下观察细胞是不是有绿色荧光，如果有细胞表达有绿色荧光，说明培养皿里面的细胞有过表达成功的细胞，下面我们把细胞消化下来，用500μL的PBS重悬细胞，用流式分选的方法把带有绿色荧光的细胞分选处理，即得到过表达OVA蛋白的细胞系。
(2)酶联免疫斑点实验-ELISPOT
1)铺板：用PBS稀释抗体，加入到ELISPOT的96孔板中，每孔100μL，在4℃过夜。第二天，弃去抗体，在每孔中加入200μL(1640培养基+10％FBS)封闭液，先用此封闭液冲洗一次在加入，在室温下封闭2h。
2)准备细胞与OT-1小鼠的血液：培养MCA205-OVA细胞和MCA205 Hdac3 KO -OVA细胞，按照在ELISPOT实验的需要，每个细胞培养孔板的一个孔里面5*104的细胞量，准备细胞。同时准备OT-1小鼠的血液，小鼠微静脉取血，先计算需要的小鼠血量，本实验一共六个96孔板的孔需要OT-1小鼠的血液中的T细胞，所以我们取OT-1小鼠的血液六滴，然后对血液用红细胞裂红液裂红，在冰上裂红15分钟，然后3500rpm，10分钟。弃去上清，600μL的细胞培养基重悬，每孔100μL加入到96孔板中，与此同时在对应的孔板中加入100μL的对应的细胞悬液。在37℃培养箱中培养16-18小时。
3)弃去培养基，用ddH2O洗两次，每孔中200μL的ddH2O。然后用PBST洗板子3 次，200μL/孔。
4)配置Detection antibody，10％FBS做稀释液，100μL/孔，室温下孵育2h。孵育之后，弃去抗体，用PBST洗板子3次，200μL/孔。
5)配置Enzyme conjugate，100μL/孔加入孔板中，室温下孵育1h，然后用PBST洗板子3次，200μL/孔。然后用PBS洗板子2次，200μL/孔。弃去PBS。
6)在孔板中加入100μL的Final Substrate Solution，在室温下放置黑暗环境下10-30 分钟。弃去液体，加入200μL/孔的ddH2O显色，
7)待有明显颜色变化后，弃去ddH2O，放置于室温下，等孔板干燥后，用酶联免疫斑点分析仪去读数。
2.3实验结果
实验结果见图2。根据我们的实验发现，与野生型的MCA205细胞相比，缺失Hdac3基因的肿瘤细胞，其抗原提呈能力明显增加了很多，肿瘤的免疫原性也相应增加，这对肿瘤的免疫治疗提供了充分的依据。
实施例3：缺失Hdac3基因的肿瘤细胞的移植瘤模型中肿瘤组织的免疫细胞浸润的 分析
3.1实验材料，试剂
(1)实验材料
DMEM(Gibco)
PBS(Gibco，C1001050013T)
DNaseⅠ(Roche)
胶原酶liberase TL Research Grade(Roche，05401020001)
O.C.T.(Sakura，4583)
Mouse-CD8(Abcam，ab217344)，
Mouse-CD4(Abcam，ab133616)，
Alexa Fluor 568rabbit anti-mouse IgG(Life，A11004)。
Mouse-CD8(BioLegend，100414)，
Mouse-CD4(BioLegend，100723)，
IFN-γ(eBioscience，12-7311-82)
PMA(Abcam，ab120297)
Ionomycin(Abcam，ab120116)
Brefeldina(Abcam，ab120299)
(2)实验仪器
冷冻切片机：购自Leica公司(CM1950)
激光共聚焦显微镜：购自Leica公司(SP8型)
流式细胞仪：购自Life Technologies(Attune NxT)
3.2实验过程
检测肿瘤组织内部免疫细胞的浸润情况，在移植瘤动物模型实验中，分两组进行，每组五只C57小鼠，一组是野生型的MCA205肿瘤细胞，一组是Hdac3基因敲除的 MCA205细胞，每只小鼠皮下注射2*106个细胞。在肿瘤生长到第七天的时候，从皮下取出肿瘤组织，做冷冻切片的免疫荧光和免疫组分分析的流式细胞实验，通过对CD4,CD8 等标志物的检测来判断免疫细胞在肿瘤组织中的浸润情况。
(1)免疫荧光实验
1)在做完动物的移植瘤模型后，在第七天的时候，取小鼠的肿瘤组织，野生型与Hdac3敲除组分别取三只小鼠的肿瘤组织。
2)肿瘤组织的固定脱水。将组织浸泡在4％的多聚甲醛中，固定24h；然后脱水，在30％的蔗糖里面浸泡48h脱水完成。用OCT包埋肿瘤组织，-20℃保存。
3)冷冻切片。取出-20℃保存的肿瘤组织，用冷冻切片机切片，5μm的厚度，每个组织切10张左右。-20℃保存待用。
4)从-20℃取出已经切好的组织片子，在室温下放置5-20分钟。然后PBS浸泡5分钟，重复两次，洗去OCT。擦干载玻片上组织周围的水，用免疫组化笔在组织周围画圈。
5)固定组织。在每个组织上加入100μL的2％的多聚甲醛，室温下固定15分钟(注意：多聚甲醛需要预冷)。然后PBS洗三次，每次5分钟。
6)透膜。在每片组织上加入0.2％的Triton透膜剂100μL，室温下10分钟，这个透膜时间可以适当延长。然后PBS洗三次，每次5分钟。
7)封闭。用10％的羊血清封闭组织，每片加入100μL左右(羊血清用PBS来稀释)，室温下封闭1小时，然后PBS洗一次。
8)敷育一抗。配置一抗工作液，PBS稀释一抗，稀释比例按照抗体说明书来稀释，然后4℃敷育过夜。第二天，从4℃拿出片子，室温放置一会，使温度回到室温，然后用 PBS洗三次，每次5分钟。
9)敷育二抗，配置二抗工作液，用PBS来稀释二抗，室温下敷育1小时，然后PBS 洗三次，每次5分钟。
10)细胞核的染色。用Hoschest染细胞核，1：1000稀释Hoschest，避光染色5分钟，然后PBS洗三次。
11)封片。用防淬灭剂封片，注意不要让肿瘤组织干了。然后盖上盖玻片。
12)用激光共聚焦显微镜观察并拍照。
(2)免疫组分分析的流式细胞实验的实验过程
1)在做完小鼠的皮下移植瘤模型后，在第七天的时候，取小鼠的肿瘤组织，野生型与Hdac3敲除组分别取三只小鼠的肿瘤组织。同时取一只小鼠的脾脏，用于下面实验来做单染管。
2)配置组织消化液，消化组织。由DMEM培养基，DNA酶I和胶原酶组成。每个组织放入1.5mL的EP管中，并加入1mL的组织消化液，用剪刀剪碎。把剪碎的肿瘤组织连同组织消化液，在EP管中一起放入CO2培养箱培养30分钟，在敷箱中敷育时把管子方平。
3)将敷育好的肿瘤细胞用70μm的滤网过滤，用预冷的PBS冲洗几次，然后离心并再次用PBS洗细胞。
4)染抗体。准备抗体染色，分别染抗体：CD4,CD8,等等。冰上染色15分钟，PBS 洗一次，500μL的PBS重选，然后流式上机检测。
5)配置淋巴细胞的细胞因子刺激剂。将第三步分出来的细胞用细胞因子刺激剂(DMEM配置，加入：PMA：100mg/mL；Ionomycin：1μg/mL；Brefeldina(1：1000)) 重选，放在细胞培养箱中培养4小时。每个一个小时轻轻摇晃一次，使细胞和细胞因子刺激剂重复混合。4小时后，用PBS洗细胞一次，然后对细胞破膜，对IFN-γ进行染色。冰上染色15分钟，PBS洗一次，500μL的PBS重选，然后流式上机检测。
3.3实验结果
实验结果见图3。在免疫组分分析的流式实验与免疫荧光实验中，我们可以发现，敲除Hdac3基因以后的肿瘤细胞，在小鼠体内，与对照组相比，可以招募大量的免疫细胞进入肿瘤组织，杀伤肿瘤细胞，起到抑制肿瘤的效果。
实施例4：肿瘤细胞在缺失Hdac3后，对TNF-α更加敏感并引起细胞凋亡
4.1实验材料，试剂
TNF-α(MACS,130101687)
Z-VAD(selleck，S810202)
Annexin V(BD，51-65874X)
DAPI(BBI life science，E607303-0002)
Caspase 3(CST，9665S)
Cleaved-caspase 3(CST，9664S)
Caspase 8(CST，4790S)
Cleaved-caspase 8(CST，8592S)
TubuLin(CST，5335)
4.2实验过程
(1)培养野生型MCA205细胞和Hdac3基因敲除的MCA205细胞，待细胞状态良好的时候，在12孔板里面分别铺板这两种细胞，在细胞密度是50％左右的时候，加入20ng/μL浓度的TNF-α，12小时以后，流式检测细胞凋亡情况。
(2)用流式细胞技术进行细胞凋亡检测。取经过TNF-α处理过的野生型MCA205 细胞和Hdac3基因敲除的MCA205细胞，细胞经过PBS洗一次，100μL的PBS重悬，然后每个样本中分别加入2μL的Annexin V和DAPI，冰上避光染色15分钟，PBS洗一次，500μL的PBS重悬，流式上机检测。
(3)用Western blot的实验来检测TNF-α是否激活了肿瘤细胞的凋亡。取经过TNF-α处理过的野生型MCA205细胞和Hdac3基因敲除的MCA205细胞，经细胞裂解液处理，冰上裂解30分钟，加入SDS-PAGE loading buffer，100℃金属浴10分钟，取跑蛋白胶，之后曝光Caspase家族的蛋白，观察Caspase家族的蛋白是否被TNF-α激活。
(4)根据上面的实验，已经知道，缺失Hdac3基因的肿瘤细胞可以在TNF-α的作用下引发细胞凋亡，为了进一步的验证此发现的正确性，我们先用Caspase家族的蛋白阻断剂Z-VAD来阻断Caspase家族的蛋白，阻断细胞的凋亡，观察TNF-α还是否能诱导 Hdac3基因缺失细胞的凋亡。
我们首先培养野生型MCA205细胞和Hdac3基因敲除的MCA205细胞，待细胞状态良好的时候，在12孔板里面分别铺板这两种细胞，在细胞密度是50％左右的时候，在细胞培养基加先加入10ng/μL的Z-VAD，然后30分钟之后再在细胞培养基中加入20ng/μL 的TNF-α，然后5％的CO2培养箱培养细胞24小时，之后用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。
4.3实验结果
结果见图4。根据我们的实验发现，与野生型的MCA205细胞相比，缺失Hdac3基因的肿瘤细胞可以在TNF-α的作用24小时的情况下引发细胞凋亡，而野生型相比没有明显变化，并且经过蛋白水平的检验，TNF-α诱导凋亡信号通路下游Caspase家族的蛋白被激活，用Caspase的抑制剂Z-VAD阻断Caspase后，TNF-α就不在诱导Hdac3缺失的细胞的凋亡。因此，我们知道在Hdac3缺失的条件下，肿瘤细胞能够很轻松的被TNF-α诱导而发生凋亡。
实验5：用腺相关病毒对小鼠肿瘤进行治疗。
5.1实验材料，试剂
(1)细胞：HEK293T细胞
(2)质粒：
pAAV2/2(addgene：#104963)，
rAAV2-retro helper(addgene：#81070)，
AAV-CAG-GFP(addgene：#28014)。
(3)动物：C57BL/6(北京维通利华实验动物技术有限公司)
(4)实验仪器
微量离心机(Thermo fisher，G121)
磁力搅拌器(IKA，RH数字型)
5.2实验过程
(1)在MCA205细胞中过表达多位点基因突变的Hdac3序列，然后观察此细胞在小鼠体内的生长情况。
1)构建带有多位点基因突变的Hdac3基因序列的质粒。
利用PCR的方法，多片段合成多位点基因突变的Hdac3基因序列(其中将组蛋白去乙酰化酶3的蛋白位点中的134-135，143-144，170，172，259，266，296，298，424 位点突变为丙氨酸)，然后用DNA连接酶连接成完整的基因片段，在此时需要保证基因序列两端的酶切位点与质粒的***位点的酶切位点一致，用两个限制性内酶切切割质粒与基因片段，然后用DNA连接酶将切割好的质粒与基因片段室温连接半个小时，连接成完整的环状质粒，再将构建好的质粒转入感受态大肠杆菌中，扩增质粒，获得大量质粒。
2)过表达细胞系的构建：
过表达病毒的包装。在构建过表达某个基因的的细胞系是，其过表达病毒的包装与基因敲除时慢病毒的包装是一样的，具体详见实验一中的慢病毒的包装。
病毒感染细胞与过表达细胞系的获得。在六孔板中培养细胞，待细胞密度在30％左右的时候，弃掉一半的培养基，加入适量的病毒液，病毒感染48h，一般过表达的质粒中会带有GFP基因，此时细胞中会表达绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下可以观察到。然后用流式分选的技术，将带有绿色荧光蛋白的细胞分离出来，即得到过表达基因的细胞系。
3)移植瘤模型的动物实验
我们利用上面获得的过表达的细胞系做小鼠皮下移植瘤实验，以野生型的细胞做对照，每组5只小鼠，每只小鼠皮下注射2*106个细胞。观察肿瘤生长情况，绘制肿瘤生长曲线。
(2)腺相关病毒的制备：在本公开中我们使用HEK293T细胞包装腺相关病毒，使用的是AAV2型血清型来包装腺相关病毒的。采用碘克沙醇浓度梯度纯化的方法来纯化腺相关病毒，最终把腺相关病毒浓缩为1013颗粒数每毫升的浓度。
1)构建带有酶活性位点突变的Hdac3基因序列的腺相关病毒基因载体质粒。利用PCR的方法，模板为：上面构建过表达细胞系时得到的质粒。扩增出多位点基因突变的Hdac3基因序列。酶切质粒(AAV-CAG-GFP)与基因片段：限制性内切酶EcoR I与Not I，酶切2小时，之后用DNA连接酶连接酶切后的质粒与基因片段，将质粒转入的感受态的大肠杆菌中扩增质粒，获得大量质粒，上面的实验中有详细实验步骤，在此不在赘述。
2)腺相关病毒的包装。
腺相关病毒的包装方法与上面慢病毒的包装方法相似，在此不再过于详细的说明。具体的操作步骤可参考(https://www.addgene.org/protocols/aav-production- hek293-cells/)
A,在T175的细胞培养瓶中培养HEK293T细胞，在细胞状态良好的时候，并且细胞密度为30％左右的时候，准备转染包装腺相关病毒。
B,准备质粒pAAV2/2，rAAV2-retro helper，AAV-CAG-GFP，按照三质粒1：1：1的摩尔比来混合质粒，在各质粒都是1μg/μL的条件下，分别取727.6μL，1185.4μL，584.2μL。将混合质粒与176mL的Opti-MEM混合，在加入7.5mL的聚氨酯胺。室温下孵育15分钟，然后转入HEK293T细胞的培养瓶中。孵育48-72小时。
C,72小时之后，收集细胞和细胞上清液，在1000g的转速下离心10分钟，取出细胞上清液，用0.45um的滤膜过滤，然后在每100mL的上清液中加入25mL的聚乙烯二醇，在4℃下搅拌1小时。然后在2818g的转速下离心15分钟。弃去上清，用10mL的PBS 重悬沉淀。
D,加入50单位的苯甲酸酶在每毫升的上述重悬液中，然后在37℃孵育45分钟，然后2415g离心10分钟。收集上清存放于4℃，用于下面的纯化实验。
3)腺相关病毒的浓缩。
首先配置具有浓度梯度的碘克沙醇离心管，浓度梯度由下到上依次时60％，40％，25％，15％。在准备好这种离心管上层加入腺相关病毒的病毒液，封闭离心管，350000g 离心90分钟。即可浓缩病毒，浓缩的病毒液可保存于-80℃储存。
腺相关病毒的浓缩的操作步骤为本领域常规操作步骤，示例性的，操作步骤可参考 (https://www.addgene.org/protocols/aav-purification-iodixanol-gradient- uLtracentrifugation/)
4)应用此腺相关病毒对肿瘤的治疗：用MCA205细胞在C57小鼠皮下做移植瘤动物模型实验，分两组进行，每组五只C57小鼠，在实验的第七天，对其中一组的肿瘤组织内部给予腺相关病毒的治疗，另一组给予安慰剂，观察治疗后的治疗生长情况。
5.3实验结果
实验结果见图5。与对照组相比，在给予腺相关病毒治疗后的小鼠肿瘤生长明显减慢，说明此腺相关病毒对肿瘤生长有抑制作用，具有临床应用的作用。
本公开并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本公开的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化，并且这类变化旨在落入本公开的范围内。
序列表
<110> 苏州系统医学研究所
<120> 含有Hdac3突变的载体及其在基因***中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 428
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Lys Thr Val Ala Tyr Phe Tyr Asp Pro Asp Val Gly Asn Phe
1 5 10 15
His Tyr Gly Ala Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Leu Ala Leu Thr
20 25 30
His Ser Leu Val Leu His Tyr Gly Leu Tyr Lys Lys Met Ile Val Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Gln Ala Ser Gln His Asp Met Cys Arg Phe His Ser Glu
50 55 60
Asp Tyr Ile Asp Phe Leu Gln Arg Val Ser Pro Thr Asn Met Gln Gly
65 70 75 80
Phe Thr Lys Ser Leu Asn Ala Phe Asn Val Gly Asp Asp Cys Pro Val
85 90 95
Phe Pro Gly Leu Phe Glu Phe Cys Ser Arg Tyr Thr Gly Ala Ser Leu
100 105 110
Gln Gly Ala Thr Gln Leu Asn Asn Lys Ile Cys Asp Ile Ala Ile Asn
115 120 125
Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys Phe Glu Ala Ser Gly Phe
130 135 140
Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Ile Gly Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr
145 150 155 160
His Pro Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp Ile His His Gly Asp Gly
165 170 175
Val Gln Glu Ala Phe Tyr Leu Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe
180 185 190
His Lys Tyr Gly Asn Tyr Phe Phe Pro Gly Thr Gly Asp Met Tyr Glu
195 200 205
Val Gly Ala Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Cys Leu Asn Val Pro Leu Arg
210 215 220
Asp Gly Ile Asp Asp Gln Ser Tyr Lys His Leu Phe Gln Pro Val Ile
225 230 235 240
Ser Gln Val Val Asp Phe Tyr Gln Pro Thr Cys Ile Val Leu Gln Cys
245 250 255
Gly Ala Asp Ser Leu Gly Cys Asp Arg Leu Gly Cys Phe Asn Leu Ser
260 265 270
Ile Arg Gly His Gly Glu Cys Val Glu Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ile
275 280 285
Pro Leu Leu Val Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Val Arg Asn Val Ala
290 295 300
Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Leu Val Glu Glu Ala Ile Ser
305 310 315 320
Glu Glu Leu Pro Tyr Ser Glu Tyr Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Asp Phe
325 330 335
Thr Leu His Pro Asp Val Ser Thr Arg Ile Glu Asn Gln Asn Ser Arg
340 345 350
Gln Tyr Leu Asp Gln Ile Arg Gln Thr Ile Phe Glu Asn Leu Lys Met
355 360 365
Leu Asn His Ala Pro Ser Val Gln Ile His Asp Val Pro Ala Asp Leu
370 375 380
Leu Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Gly Pro
385 390 395 400
Glu Glu Asn Tyr Ser Arg Pro Glu Ala Pro Asn Glu Phe Tyr Asp Gly
405 410 415
Asp His Asp Asn Asp Lys Glu Ser Asp Val Glu Ile
420 425
<210> 2
<211> 428
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Lys Thr Val Ala Tyr Phe Tyr Asp Pro Asp Val Gly Asn Phe
1 5 10 15
His Tyr Gly Ala Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Leu Ala Leu Thr
20 25 30
His Ser Leu Val Leu His Tyr Gly Leu Tyr Lys Lys Met Ile Val Phe
35 40 45
Lys Pro Tyr Gln Ala Ser Gln His Asp Met Cys Arg Phe His Ser Glu
50 55 60
Asp Tyr Ile Asp Phe Leu Gln Arg Val Ser Pro Thr Asn Met Gln Gly
65 70 75 80
Phe Thr Lys Ser Leu Asn Ala Phe Asn Val Gly Asp Asp Cys Pro Val
85 90 95
Phe Pro Gly Leu Phe Glu Phe Cys Ser Arg Tyr Thr Gly Ala Ser Leu
100 105 110
Gln Gly Ala Thr Gln Leu Asn Asn Lys Ile Cys Asp Ile Ala Ile Asn
115 120 125
Trp Ala Gly Gly Leu Ala Ala Ala Lys Lys Phe Glu Ala Ser Ala Ala
130 135 140
Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Ile Gly Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr
145 150 155 160
His Pro Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Ala Ile Ala His Gly Asp Gly
165 170 175
Val Gln Glu Ala Phe Tyr Leu Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe
180 185 190
His Lys Tyr Gly Asn Tyr Phe Phe Pro Gly Thr Gly Asp Met Tyr Glu
195 200 205
Val Gly Ala Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Cys Leu Asn Val Pro Leu Arg
210 215 220
Asp Gly Ile Asp Ala Gln Ser Tyr Lys His Leu Phe Gln Pro Val Ile
225 230 235 240
Ser Gln Val Val Asp Phe Tyr Gln Pro Thr Cys Ile Val Leu Gln Cys
245 250 255
Gly Ala Asp Ser Leu Gly Cys Asp Arg Ala Gly Cys Phe Asn Leu Ser
260 265 270
Ile Arg Gly His Gly Glu Cys Val Glu Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ile
275 280 285
Pro Leu Leu Val Leu Gly Gly Ala Gly Ala Thr Val Arg Asn Val Ala
290 295 300
Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Leu Val Glu Glu Ala Ile Ser
305 310 315 320
Glu Glu Leu Pro Tyr Ser Glu Tyr Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Asp Phe
325 330 335
Thr Leu His Pro Asp Val Ser Thr Arg Ile Glu Asn Gln Asn Ser Arg
340 345 350
Gln Tyr Leu Asp Gln Ile Arg Gln Thr Ile Phe Glu Asn Leu Lys Met
355 360 365
Leu Asn His Ala Pro Ser Val Gln Ile His Asp Val Pro Ala Asp Leu
370 375 380
Leu Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Gly Pro
385 390 395 400
Glu Glu Asn Tyr Ser Arg Pro Glu Ala Pro Asn Glu Phe Tyr Asp Gly
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Asp His Asp Asn Asp Lys Glu Ser Asp Val Glu Ile
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ggacacccaa tgaaacctca tcgcctggca ttgactcata gcctagtcct gcattatggt 120
ctctataaga agatgatcgt cttcaagcct taccaggcct cccagcatga catgtgccgc 180
ttccattctg aggactacat cgacttcctg cagagagtca gccccaccaa tatgcagggt 240
ttcaccaaga gccttaatgc cttcaacgtg ggtgatgact gcccagtgtt tccaggactt 300
ttcgagttct gctcccgtta cacaggcgca tctctgcaag gagcaacaca gctaaacaac 360
aagatctgtg atattgccat caactgggcc ggtggtctag ccgccgccaa gaaatttgag 420
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