阅读说明：本技术 一种hIL-12p40-MSCs的制备方法及其应用 (Preparation method and application of hIL-12p40-MSCs ) 是由 孙艳 迟作华 余功旺 刘爱梅 陈立基 李金花 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种hIL-12p40-MSCs(人IL-12p40基因修饰的MSCs)制备方法及其应用。制备方法包括(1)分离培养鉴定hMSCs；(2)克隆扩增hIL-12p40基因；(3)构建重组hIL-12p40慢病毒表达载体；(4)慢病毒的包装；(5)hIL-12p40慢病毒感染MSCs；(6)MSCs表达慢病毒介导的外源性hIL-12p40的鉴定。本发明制备的hIL-12p40基因修饰的MSCs具有抑制细胞免疫的生物活性,且可用于制备治疗细胞免疫异常增强相关的再生障碍性贫血、移植排斥反应及自身免疫性疾病等疾病的药物,具有较好的市场前景。(The invention discloses a preparation method and application of hIL-12p40-MSCs (human IL-12p40 gene modified MSCs). The preparation method comprises (1) separating, culturing and identifying hMSCs; (2) cloning and amplifying hIL-12p40 gene; (3) constructing a recombinant hIL-12p40 lentivirus expression vector; (4) packaging of lentiviruses; (5) hIL-12p40 lentivirus infects MSCs; (6) MSCs express lentivirus-mediated identification of exogenous hIL-12p 40. The hIL-12p40 gene modified MSCs prepared by the invention have biological activity of inhibiting cellular immunity, can be used for preparing medicines for treating diseases such as aplastic anemia, transplant rejection, autoimmune diseases and the like related to cellular immune abnormality enhancement, and have better market prospect.)

一种hIL-12p40-MSCs的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物治疗领域，具体涉及一种稳定表达hIL-12p40基因、可持续抑制细胞免疫的MSCs的制备方法及应用。

背景技术

白细胞介素(Interleukin-12，IL-12)是一种由激活的单核巨噬细胞、抗原提呈细胞以及B淋巴产生的细胞因子，具有重要的免疫调节作用。通常情况下，IL-12P40和P35两个亚基通过二硫键组成异源二聚体分子，即完整的IL-12P70。IL-12P70可以促进自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞(CTL)增殖，刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ等细胞毒性细胞因子，并诱导Th1细胞发育分化，增强机体的细胞免疫应答功能。此外，IL-23，IL-12异源二聚体细胞因子家族中的一员，由IL-23P19和IL-12P40两个亚基组成，通过与其受体相互作用(IL-12受体β1和IL-23受体2个亚基共同组成)作用于Th17细胞，在Th17细胞的增殖与稳定中发挥重要作用，并促进Th17细胞产生IL-17A、IL-17F及IL-22等炎症因子，进而激活T细胞等免疫细胞，形成免疫应答的级联效应，引起自身免疫性疾病。单独的P40单体或同源二聚体无生物学功能，但P40可通过竞争结合免疫细胞表面IL-12βR，竞争性拮抗IL-12P70和IL-23的生物学活性。研究显示，再生障碍性贫血、移植排斥反应以及自身免疫性疾病法生时，IL-12家族成员包括IL1-2、IL-23水平均有升高，并介导细胞免疫的异常活化，是上述疾病发病的重要机制。而抑制IL-12和IL-23的生物学功能有助于治疗以上疾病。

MSCs(mesenchymal stem cell，MSCs)是来源于中胚层的具有自我更新能力的成体干细胞。MSCs的应用较为广泛，除了作为一种重要的组织工程细胞用于治疗骨、软骨性疾病外，还是一种理想的基因运载载体细胞。MSCs作为基因运载载体具有多种优势：1.来源丰富，可以从骨髓、脐带、脐血、脂肪、羊水、胎盘等多种组织分离提取。分离培养方法简单而且扩增能力强。2.MSCs不表达或低表达HLA分子，免疫原性弱，在同种异体中也能存活较长时间。3.MSCs本身可通过分泌细胞因子(如TGF-β、IL-10)或表达表面配体的作用调节机体免疫功能。4.MSCs还具备在体内向病理损伤部位迁移的能力。

基因修饰的细胞产品制备的关键问题在于基因转移和在细胞中表达的效率。已有的基因转染悬浮细胞方法包括电转、病毒转染和脂质体瞬时转染。其中，病毒转染是最有效的方法。来源于免疫缺陷病毒的慢病毒载体(Lentivirus vector)可以以较高的转移效率将基因整合入***细胞或非***细胞基因组，使转移基因在细胞内稳定、长期表达，因而在临床基因治疗尤其是血液细胞基因修饰产品中广泛应用。从第二代慢病毒载体开始，由于去除了众多辅助独立因子，所以安全性更高，并具有更低的细胞毒性和免疫原性。

发明内容

本发明的目的在于利用IL-12P40单体或同源二聚体以及MSCs具备的抑制细胞免疫的作用，本发明提供一种hIL-12p40-MSCs的制备方法，产生的MSCs可持续稳定表达hIL-12p40，具有抑制细胞免疫的生物活性。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种hIL-12p40-MSCs的制备方法，具体步骤如下：

(1)分离培养鉴定hMSCs；

(2)克隆扩增hIL-12p40基因；

(3)构建重组hIL-12p40慢病毒表达载体；

(4)慢病毒的包装；

(5)hIL-12p40慢病毒感染MSCs；

(6)MSCs表达慢病毒介导的外源性hIL-12p40的鉴定；

进一步地，所述的MSCs来源包括人脐带、脂肪、骨髓、羊水、胎盘。

进一步地，所述的hIL-12p40基因具有SEQ NO 1(NM＿002187.2)所示的核苷酸序列。所述hIL-12基因的表达框架构成为：从5’-3’方向依次为EF-1α启动子、hIL-12p40编码基因。进一步地，步骤(3)中采用慢病毒载体将hIL-12p40基因导入MSCs，使hIL-12p40基因在MSCs稳定表达。

进一步地，步骤(5)中慢病毒感染6代以内对数生长期hMSCs。

进一步地，步骤(5)中慢病毒感染hMSCs的MOI值范围为20-50。

本发明还包括所述hIL-12p40-MSCs在抑制细胞免疫中的应用。

本发明还包括所述hIL-12p40-MSCs用于制备治疗再生障碍性贫血、移植排斥反应及自身免疫性疾病等细胞免疫增强型疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用IL-12P40单体或同源二聚体以及MSCs具备的抑制细胞免疫的作用，利用MSCs作为理想的基因运载载体以及慢病毒实现稳定转染的作用，制备稳定表达hIL-12p40基因的MSCs。其制备的hIL-12p40基因修饰的MSCs具有抑制细胞免疫的生物活性，且可用于制备治疗细胞免疫异常增强相关的再生障碍性贫血、移植排斥反应及自身免疫性疾病等疾病的药物，具有较好的市场前景。。

附图说明

图1为贴壁法分离培养的人脐带间充质干细胞(hUMSCs)。

其中，1A为新鲜脐带组织，1B为MSCs从脐带组织块中游出，1C为分离培养的第3代hUMSCs形态学观察。

图2为hIL-12p40-MSCs的构建。

其中，2A为RT-PCR法克隆的hIL-12p40基因电泳图；图2B为纯化的空载体pSin电泳图；2C为空载体和构建的pSin-EF-1α-hIL-12p40慢病毒质粒电泳图。图2D为菌落PCR检测hIL-12p40基因电泳图。2E为测序比对结果。

图3为hIL-12p40-MSCs表达hIL-12p40。

ELISA法检测构建的hIL-12p40-MSCs表达hIL-12p40水平。MSCs为空白对照组；LV-MSCs为阴性对照组；hIL-12p40-MSCs为实验组。

图4为hIL-12p40-MSCs抑制细胞免疫。

其中，4A为CCK8法检测hIL-12p40-MSCs培养上清对PBMCs增殖的影响；4B为ELISA法检测hIL-12p40-MSCs培养上清对PBMCs分泌效应性细胞因子IFN-γ的影响；4C为流式检测hIL-12p40-MSCs培养上清对T细胞活化分子CD25表达影响的流式细胞图；4D为hIL-12p40-MSCs培养上清对T细胞活化分子CD25表达影响的统计图Medium为空白对照组1，用RPMI-1640培养基培养PBMCs；MSCs为空白对照组2，用MSCs培养上清培养PBMCs；LV-MSCs为阴性对照组，用LV-MSCs培养上清培养PBMCs；hIL-12p40-MSCs为实验组，用hIL-12p40-MSCs培养上清培养PBMCs。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图进一步解释本发明，但实施例不对本发明的保护范围构成任何形式的限制。以下实施例中除作特殊说明外，均为本领域常规实验手段和试剂。

实施例1

(1)分离培养hUMSCs

取无菌新鲜健康产妇脐带组织，剔除血管组织，剪碎成1mm左右组织块，接种至培养皿，倒扣20min，加入含10％FBS的DMEM/F-12完全培养基培养，3d换液1次，直至细胞长满瓶底。轻轻去掉组织块，胰酶消化传代。形态学观察hUMSCs生长状态良好，为长梭形、放射状生长细胞。(图1A-C)。流式检测MSCs表面标记CD105、CD44、CD29、CD34、CD45。结果显示，收获细胞表达MSC s特异性标记CD105、CD44和CD29，不表达血细胞特异性标记CD45。诱导MSCs向骨组织、脂肪组织分化，并进行鉴定。

(2)Trizol法提取LPS激活的THP-1细胞总RNA，以之为模板，应用SEQ NO2和SEQNO3的引物序列，RT-PCR法克隆扩增hIL-12p40，参见图2A。p40 PCR扩增条件是：94℃，5min，94℃，30s，60℃，1min，72℃，30s，30个循环，72℃，10min。1.0％的琼脂糖凝胶电泳，在marker对应的1000bp处可见明显条带，与预计产物(1004bp)大小相吻合。

SEQ NO.2

CTATCGATATGTGTCACCAGCAGTTGGTCA

SEQ NO.3

CATGGATCCCTAACTGCAGGGCACAGAT

(3)ClaⅠ和BamHⅠ双酶切p40 PCR产物和慢病毒质粒载体pSin，参见图2B，将适当比例双酶切后的p40和线性化慢病毒表达载体加入T4 DNA连接酶体系，混匀，4℃反应16h。转化涂板，氨苄青霉素筛选。隔天挑取菌落做PCR鉴定，参见图2C，挑取阳性菌落提取质粒，参见图2D，送公司测序。结果显示，构建质粒含有与hIL-12p40核苷酸序列一致的序列，参见图2E。

(4)转染前24h接种293T细胞，密度为6×10⁶/10cm盘，待细胞汇合度达80％左右可转染。转染前更换无抗生素的完全培养基(DMEM+10％FBS)，将构建好的质粒和两个包装质粒(psPAX2和pMD2.G)加到水里面，混匀。加入2M CaCl₂和2×HBS，反复吹打混匀。室温静置2分钟，逐滴加入293T细胞，5％CO₂，37℃培养过夜。第2天小心换液，5％CO₂，37℃培养48hr后收集病毒上清。0.45um滤膜过滤，20000rpm离心2hr，吸掉上清，用PBS重悬沉淀，分装到EP管中，-80℃保存。

(5)取6代以内(本实施例应用第3代hUMSCs)对数生长期的hUMSCs培养至汇合度达80％时更换无血清培养基，取本次包装的慢病毒最佳感染复数(MOI值＝50)剂量的慢病毒与polybrene(终浓度8ug/ml)加入PBS混匀，逐滴加入MSCs，培养过夜。重复感染细胞1次。24hr后换液，5％CO₂，37℃继续培养。

(6)取上述最佳感染复数剂量的慢病毒感染接种于24孔板中的第3代对数生长期hUMSCs，重复感染1次后24hr换液。感染病毒后继续培养24hr，取培养上清，应用hIL-12p40检测试剂盒ELISA法检测hIL-12p40分泌水平。结果显示，hIL-12p40-MSCs表达hIL-12p40水平较空白对照组(MSCs)和阴性对照组(LV-MSCs)组显著升高，参见图3

(7)抽取新鲜健康人静脉血分离外周血单个核细胞(PBMCs)。首先用等量生理盐水稀释抗凝血。将稀释血沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(Ficoll液)上方形成清晰界面，2000rpm离心20min，用滴管吸出云雾层至一新的离心管中，加入2倍体积生理盐水洗涤两次。用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬PBMCs，细胞计数。MSCs培养上清(空白对照组1：RPMI-1640培养基；空白对照组2：MSCs；阴性对照组：LV-MSCs；实验组：hIL-12p40-MSCs)调整PBMCs悬液浓度为7×10⁴/ml，接种0.1ml于96孔板，加入CD3单抗(终浓度为50ng/ml)，CCK8法检测24hr、48hr、72hr PBMCs增殖情况。结果显示，hIL-12p40-MSCs上清抑制淋巴细胞增殖，单独MSCs对淋巴细胞活化后增殖也有一定的抑制作用，参见图4A。

(8)将PBMCs用MSCs培养上清调整细胞浓度为7×10⁴/ml(空白对照组1：RPMI-1640培养基；空白对照组2：MSCs；阴性对照组：LV-MSCs；实验组：hIL-12p40-MSCs)，接种0.1ml于96孔板，加入CD3单抗，10％FBS培养24hr，收集培养上清，ELISA法检测IFN-γ。结果显示，hIL-12p40-MSCs上清抑制淋巴细胞分泌IFN-γ，参见图4B。

(9)将PBMCs用MSCs培养上清调整细胞浓度为5×10⁵/ml(空白对照组1：RPMI-1640培养基；空白对照组2：MSCs；阴性对照组：LV-MSCs；实验组：hIL-12p40-MSCs)，接种1ml于12孔板，加入CD3单抗，含10％FBS的RPMI-1640完全培养基培养24hr，收集细胞，CD3mAb和CD25mAb双标，流式细胞术检测CD25⁺T细胞。结果显示，hIL-12p40-MSCs上清抑制T细胞表达激活受体CD25，参见图4C，图4D。

实验表明，本发明利用慢病毒稳定介导外源基因表达和MSCs作为基因转移载体的优势，通过简便方法，使MSCs稳定持续表达人IL-12p40成为现实。hIL-12p40修饰的MSCs上清分泌hIL-12p40，可有效抑制淋巴细胞增殖、活化以及效应性细胞因子IFN-γ的分泌。由于MSCs具备较好的体内存活和增殖能力，而且同时具备免疫调节功能，结合hIL-12p40对细胞免疫功能的抑制作用，可应用于制备治疗细胞免疫异常活化相关疾病如再生障碍性贫血、移植排斥反应以及自身免疫性疾病的药物。