一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法
阅读说明：本技术 一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法 (Preparation method and purification method of human serum albumin ) 是由 谢丽萍 胡又佳 朱文 吴珺艺 阮江雄 韩姝 徐磊 于 2019-03-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种人血清白蛋白的制备方法,其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌接种于培养基中发酵,从发酵液中获得人血清白蛋白即可；所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外,其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基,优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。本发明还提供了一种人血清白蛋白的纯化方法。利用本发明的制备方法制得的人血清白蛋白的产量及其占总蛋白的比例均显著高于现有技术,且该制备方法中所使用的培养基成本显著降低,且无动物源性病毒污染的风险,从而显著降低制备方法的成本。利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升,并且最终产品的纯度也显著进一步提升。(The invention provides a preparation method of human serum albumin, which comprises inoculating pichia pastoris producing human serum albumin in a culture medium for fermentation, and obtaining human serum albumin from fermentation liquor; the culture medium is a BSM culture medium with the concentration of the rest components reduced to 1/4 at most except two components of glycerol and pichia pastoris microelement 1, and preferably is a BSM culture medium with the concentration reduced to 1/4-1/2. The invention also provides a method for purifying the human serum albumin. The yield of the human serum albumin prepared by the preparation method and the proportion of the human serum albumin in the total protein are obviously higher than those of the prior art, the cost of the culture medium used in the preparation method is obviously reduced, and the risk of animal-derived virus pollution is avoided, so that the cost of the preparation method is obviously reduced. The recovery rate of purification by the purification method is obviously improved, and the purity of the final product is also obviously further improved.)
技术领域
本发明涉及一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中最丰富的蛋白质，含量占血清总蛋白的60％，约为35-40g/L，主要功能为维持血浆渗透压以及各类物质的转运。HSA广泛应用于休克及烧伤治疗、术后恢复、药物载体、细胞培养基等，其全世界需求量已达600吨/年左右，我国需求量约占其三分之一。目前，人血清白蛋白主要来自人血提取，相应的纯化工艺为低温乙醇沉淀法，其来源严重受到血液供给的限制，存在血液病毒传播和扩散风险，且纯化过程中对大量有机试剂和低温控制的需求也导致其效率低下。
利用转基因技术构建工程菌并生产外源蛋白最早起源于上世纪70年代，此后，包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、昆虫、动植物细胞以及动植物等在内的一系列外源蛋白表达系统得以建立和飞速发展，为珍贵的蛋白类药物以及更高效、更环保的工业酶的产业化应用提供了巨大的推动作用。目前，利用转基因技术已在多种表达系统中实现了人血清白蛋白的外源表达及相关纯化工作，包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动植物细胞以及动植物。
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种原核生物，因具有清晰的遗传背景、简单的营养要求以及安全性被广泛应用于外源蛋白的表达。早在1981年Richard等就利用大肠杆菌成功表达HSA，但仅定性检测出其表达，而产量未知；D.Sleep等于1990年利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)成功表达出HSA，但由于酿酒酵母表达系统产量较低，同时此系统会对HSA实施高度糖基化，极易引起免疫原性；武汉大学研究人员Yang He等将转基因技术应用于传统农作物水稻，实现了每公斤水稻获取2.75g的高纯度HSA的喜人成绩。然而转基因植物的培养周期较长，受环境因素影响大，且易造成转基因作物的抗性基因扩散；台湾学者Yu-Kuo Liu等利用转基因植物离体细胞表达系统，实现了75mg/L的HSA表达。但总体而言，转基因动植物细胞表达系统的产量不乐观，且培养成本较高，故一般不作为HSA产业化生产的首选。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种真核表达系统，于1969年由Koichi等发现其能以甲醇为唯一碳源进行生长的特性，并进一步于1987年首次被报道成功用于外源蛋白表达。相比传统的原核表达系统，毕赤酵母具有表达量高、后加工能力强以及外源基因稳定高等显著优势，而相比转基因动植物以及动植物细胞，毕赤酵母有具有遗传操作简单、菌体生长量大且培养成本低、产业化难度小等特点。目前，毕赤酵母表达系统已实现超过500种外源蛋白的表达。默克公司研究人员Sehoon Kim等通过优化起始诱导菌体量，在毕赤酵母系统中获得了10g/L的HSA表达(Kim S,Meehl M,d'Anjou M.Maximizationrecombinant hμmanserμmalbμmin production in a mutspichia pastoris strain[J].Biotechnology progress,2014,00(00):1-9.)，Kobayashi等对补料工艺进行探索，也实现了11g/L的HSA表达(Ohya T,Ohyama M,Kobayashi K.Optimization of hμmanserμmalbμmin production in methylotrophic yeast pichia pastoris by repeated fed-batchfermentation[J].Biotechnology and bioengineering,2005,90(7):876-887.)。根据这两篇目前已知HSA表达量较高的文献内容，其甲醇诱导时间分别为450小时和250小时，相应目标蛋白的表达效率仅为22和44mg/(L*h)。高健等人发表的专利表明其同样在毕赤酵母中实现了10g/L左右的HSA表达，但甲醇诱导时间也至少为200小时(专利申请CN1854301A，高健，贾茜，李梅彦，邓建慧.一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌[P].2005-04-29)。如此长的诱导时间显然延长了其生产周期，增加了时间成本，同时大量甲醇的长时间储存也成为一个不容忽视的安全隐患。为了克服上述人血清白蛋白表达量低、发酵时间长等不利于其产业化的缺陷，本发明人构建并通过多轮筛选获取了一株能够高效生产人血清白蛋白的毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-hsa-5-4，并于2017年12月25日申请了相关专利(专利申请号201711421153.3)。本发明人利用该基因工程菌进行人血清白蛋白的罐上生产时，甲醇诱导96小时后目标蛋白的产量即可达8.86g/L，生产效率可达92.29mg/(L*h)，且发酵过程中全程使用无菌空气而无需纯氧。发酵液经过简单的离心、微膜过滤以及一步亲和层析的分离纯化步骤，即可实现58.1％的回收率和96.47％的目标蛋白纯度。虽然92.29mg/(L*h)的人血清白蛋白生产效率较为可观，但8.86g/L的目标蛋白产量、58.1％的回收率和96.47％的目标蛋白纯度仍然有进一步上升的空间，且生产过程中使用的BMGY培养基较为昂贵(约50元/升)、BMGY培养基中含有的胰蛋白胨带来了动物源性病毒污染的风险。
现有技术中有关降低BSM培养基盐浓度的文献例如有Zhao H L,Xue C,Wang Y,etal.Increasing the cell viability and heterologous protein expression ofPichia pastoris mutant deficient inPMR1gene by culture condition optimization[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,81(2):235-241。其中是以HSA-IFN-α2b融合蛋白为目的蛋白，通过各方面的条件(包括培养基的盐浓度、培养温度、延长生产期等)优化后该融合蛋白的表达量才到达0.68g/L，培养基中添加了蛋白胨后才达到1.26g/L。此外，其目标蛋白的起始浓度本身就较低，优化条件后较容易就能够使得目标蛋白的产量相应地提高。
此外，现有技术中在外源表达人血清白蛋白的过程中，通常采取BMGY为发酵培养基，并采用亲和层析-疏水层析-离子交换层析这三步纯化方案，例如参见：陈蕴；黄腾飞；金坚.毕赤酵母系统来源的重组人血清白蛋白的制备及初步晶体学分析.食品与生物技术学报2014,34(2),151-157。该篇文献并未报道回收率，但根据该课题组相关硕博士论文的结果来看，普遍回收率不到50％。
发明内容
为了克服现有技术中表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)在生产人血清白蛋白的过程中，在保证生产效率的同时人血清白蛋白的产量、人血清白蛋白占总蛋白的比例以及下游分离纯化的回收率和最终产品的纯度均不十分理想，且生产过程中所用的培养基较为昂贵、易引入动物源性病毒的缺陷，提供了一种人血清白蛋白的制备方法以及人血清白蛋白的纯化方法。利用本发明所述的制备方法所制得的人血清白蛋白的产量及人血清白蛋白占总蛋白的比例均显著高于现有技术，且该制备方法中所使用的培养基成本显著降低，且无动物源性病毒污染的风险，显著降低了该制备方法的成本。利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升，并且最终产品的纯度也显著进一步提升，适于工业化生产。
因外源蛋白的表达量与很多因素有关，包括菌株的特异性、外源蛋白本身的性质、培养基组分、培养环境、发酵工艺等等，与之对应的提高外源蛋白表达量的策略也有多个切入点，而本发明人意外发现使用盐浓度降低的BSM培养基去发酵培养原本表达人血清白蛋白产量就很高的巴斯德毕赤酵母工程菌，通过降低培养基的渗透压，最终发现所得的人血清白蛋白的产量进一步得到了显著提高，首次发现了培养基的渗透压与提高人血清白蛋白产量之间的直接关系。本领域中使用盐浓度降低的BSM培养发酵酵母菌株从而提高其表达外源蛋白的产量，均是从较低的起始浓度开始的。而本发明人通过技术方案的优化，从表达高起始浓度(8.86g/L)目标蛋白的菌株出发，最终优化后所述菌株表达目标蛋白的产量高达17.47g/L，这在本领域来说是非常罕见的。
在蛋白纯化过程中，由于纯化体系比较固定，本领域技术人员并不会想到去优化亲和层析pH，而本发明人意外发现通过改变亲和层析的上样缓冲液的pH，并且创造性地将亲和层析-疏水层析-二次亲和层析的实验方案应用于人血清白蛋白的纯化过程中，最终得到的终产品纯度大于99.9％，且回收率大大提高。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人血清白蛋白的制备方法，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；
其中，所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。
较佳地，所述降低为1/2的BSM培养基(即现有技术中的1/2BSM培养基)包括4％甘油、1.335％磷酸、0.0465％二水合硫酸钙、0.91％硫酸钾、0.745％七水合硫酸镁、0.206％氢氧化钾和0.4％毕赤酵母微量元素1(PTM1)。
较佳地，所述降低为1/4的BSM培养基(即现有技术中的1/4BSM培养基)包括4％甘油、0.6675％磷酸、0.02325％二水合硫酸钙、0.455％硫酸钾、0.3725％七水合硫酸镁、0.103％氢氧化钾和0.4％毕赤酵母微量元素1。
其中，上述磷酸和上述毕赤酵母微量元素1的百分比为各组分占所述培养基的体积百分比；上述其余组分的百分比为各组分占所述培养基的质量体积百分比(克/毫升)。
本发明中，若无特殊说明，所述的质量体积百分比可为本领域常规，例如为克/毫升。
较佳地，所述毕赤酵母微量元素1包括0.6％五水合硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％一水合硫酸锰、0.02％二水和钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％七水合硫酸亚铁、0.02％生物素和0.5％硫酸；
其中，所述硫酸的百分比为其占所述毕赤酵母微量元素1的体积百分比；上述其余组分的百分比为各组分占所述毕赤酵母微量元素1的质量体积百分比(克/毫升)。
较佳地，所述产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌是在巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。
所述产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌可为背景提及专利申请号为201711421153.3的实施例5中所用菌株，其制备方法在此引用该份专利的全部内容。
更佳地，所述的启动子为AOX1启动子。
更佳地，所述的α引导肽来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
更佳地，所述的表达载体带有抗遗传霉素基因，所述的基因工程菌具有抗0.25～5.0mg/mL浓度的遗传霉素的性能。
更佳地，所述的人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
更佳地，所述的表达载体的骨架为质粒pPIC9K。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种除甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均降低为1/4的BSM培养基或降低为1/2的BSM培养基在生物发酵制备人血清白蛋白中的应用。
较佳地，所述的降低为1/4的BSM培养基或降低为1/2的BSM培养基为上述的降低为1/4的BSM培养基或降低为1/2的BSM培养基。
较佳地，所述生物发酵为利用上述的产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌进行发酵。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人血清白蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括将人血清白蛋白进行亲和层析的步骤，
所述亲和层析时所用的上样缓冲液为7＞pH≥4.3，优选为pH≥5；
所述人血清白蛋白为通过发酵产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌得到的人血清白蛋白。
本发明，所述发酵可为本领域常规，可以为在发酵罐中进行，例如通常在3L、5L或10L的发酵罐中进行发酵。
较佳地，本申请人在进一步的研究中发现目标蛋白和杂蛋白的电荷性质十分接近，采用现有技术中的离子交换进行分离效果差，意外发现将最后一步离子交换更改为再次亲和层析效果好；故本发明所述纯化方法还包括将人血清白蛋白进行疏水层析和第二次亲和层析的步骤。
4.3为人血清白蛋白的等电点，亲和层析时所用的上样缓冲液的pH小于4.3时白蛋白可能出现沉淀或者不稳定，故不采用过酸条件。
本发明所述的亲和层析时所用的上样缓冲液可为本领域常规定义的亲和层析的上样缓冲液，即在进行亲和层析时，稀释待上样样品或待纯化原料液时所使用的缓冲液。
较佳地，所述人血清白蛋白为利用上述的制备方法得到的人血清白蛋白。
较佳地，所述亲和层析时所用的上样缓冲液包括磷酸钾缓冲液，优选为含有氯化钠的磷酸钾缓冲液；所述磷酸钾的浓度优选20～30mmol/L，更优选25mmol/L，所述氯化钠的浓度优选≤0.1mol/L。
较佳地，在所述亲和层析时，上样前所用的上样样品与所述亲和层析时所用的上样缓冲液混合，使得所述上样样品中的氯化钠浓度为≤0.1mol/L，优选0.09mol/L；所述亲和层析时所用的上样样品优选为经过过滤的上样样品；更优选为经过0.45μm微孔滤膜过滤的上样样品。
较佳地，所述亲和层析时所用的上样缓冲液用于所述亲和层析时所用的层析柱的柱平衡。
较佳地，所述亲和层析时所用的层析柱的填料为活性蓝F3GA(Cibacron blueF3GA，简称蓝胶)，所述亲和层析时所用的层析柱优选为Blue Sepharose6FF。
较佳地，所述亲和层析时所用的洗脱溶液为含有氯化钠的磷酸钾缓冲液，所述磷酸钾的浓度优选20～30mmol/L，更优选25mmol/L，所述氯化钠的浓度优选1.5-2.5mol/L，更优选2mol/L。
较佳地，所述亲和层析时所用的洗脱溶液pH为7。
较佳地，所述疏水层析时以所述亲和层析后得到的溶液为上样的样品，上样前优选将所述亲和层析得到的溶液与含有氯化钠的磷酸钾缓冲液混合，使得所述亲和层析得到的溶液的氯化钠浓度为1.5-2.5mol/L，优选2mol/L；其中，所述含有氯化钠的磷酸钾缓冲液中磷酸钾的浓度优选20～30mmol/L，更优选25mmol/L。
较佳地，所述第二次亲和层析时以所述疏水层析得到的溶液为上样的样品，上样前优选将所述疏水层析得到的溶液与疏水层析时所用的洗脱溶液混合，使得所述疏水层析得到的溶液的氯化钠浓度为≤0.1mol/L。
本发明中，所述洗脱溶液为用于洗脱目标蛋白时的溶液(例如现有技术中可能会将其称为层析B液)，而非洗脱后所得到的洗脱溶液。
较佳地，所述第二次亲和层析时所用的层析柱的填料为活性蓝F3GA，所述第二次亲和层析时所用的层析柱优选为Blue Sepharose 6FF。
较佳地，所述疏水层析时所用的层析柱为Phenyl Sepharose 6FF。
较佳地，所述疏水层析时层析柱的柱平衡所用的缓冲液或第二次亲和层析时所用的洗脱溶液为含有氯化钠的磷酸钾缓冲液，所述磷酸钾的浓度优选20～30mmol/L，更优选25mmol/L，所述氯化钠的浓度优选1.5-2.5mol/L，更优选2mol/L。
较佳地，所述第二次亲和层析时层析柱的柱平衡所用的缓冲液与所述亲和层析时所述的上样缓冲液相同。
较佳地，所述疏水层析时所用的洗脱溶液为磷酸钾缓冲液，所述磷酸钾的浓度优选20～30mmol/L，更优选25mmol/L。
较佳地，所述疏水层析时所用层析柱的柱平衡时的缓冲液、所述疏水层析或第二次亲和层析时所用的洗脱溶液的pH为7。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)利用本发明所述的制备方法所制得的人血清白蛋白的产量及人血清白蛋白占总蛋白的比例均显著高于现有技术
在本发明某一较佳实施例中，使用1/2BSM培养基发酵培养相关菌株，在经过192小时诱导后可实现17.47g/L的人血清白蛋白产量(背景提及的专利201711421153.3中人血清白蛋白的产量为8.86g/L)，和截至目前报道的人血清白蛋白相关文献及专利相比，表达量和表达效率高的优势均十分明显。并且目标蛋白在诱导终点发酵液上清中占总蛋白的比例高达76.86％(背景提及的专利201711421153.3中人血清白蛋白占总蛋白比例约50.19％)。更有利于分离纯化后处理。
(2)本发明所述制备方法中所使用的培养基成本显著降低，且无动物源性病毒污染的风险，从而显著降低制备方法的成本
本发明中所述的盐浓度降低的BSM培养基(例如1/2BSM和1/4BSM)培养基为全合成培养基，所有组分及含量均确切可知，批次间稳定性较佳且成本低廉(约3-4元/升)。同时，此培养基不含任何动物源性组分，排除了动物源性病毒污染的风险。
(3)利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升，并且最终产品的纯度也显著进一步提升
本发明所述的纯化方法采用亲和层析-疏水层析-二次亲和层析的分离纯化方案，能够在获得较高纯度(在本发明某一较佳实施例中纯度>99％)目标蛋白的基础上同时实现很高的回收率(在本发明某一较佳实施例中回收率高达67.53％)，表明本发明建立的下游分离纯化方案具备较好的产业化前景。
附图说明
图1为BMGY培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-14分别为诱导后0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144和156小时的发酵液上清的电泳图。
图2为BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-9分别为诱导后0、12、24、36、48、60、72、84、96小时的发酵液上清的电泳图。
图3为BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-9分别为诱导后108、120、132、144、156、168、180、192、204小时的发酵液上清的电泳图。
图4为BMGY和BSM培养基下的菌体湿重对比示意图。
图5为BMGY和BSM培养基下的目标蛋白产量对比示意图。
图6为1/2BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-9分别为诱导后0、12、24、36、48、60、72、84、96小时的发酵液上清的电泳图。
图7为1/2BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-9分别为诱导后108、120、132、144、156、168、180、192、204小时的发酵液上清的电泳图。
图8为1/4BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-9分别为诱导后0、12、24、36、48、60、72、84、96小时的发酵液上清的电泳图。
图9为1/4BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图；M为Marker；1-9分别为诱导后108、120、132、144、156、168、180、192、204小时的发酵液上清电泳。
图10为三种不同盐浓度BSM培养基下的菌体湿重对比示意图。
图11为三种不同盐浓度BSM培养基下的发酵液上清蛋白电泳示意图。
图12为三种不同盐浓度BSM培养基下的发酵液渗透压对比示意图。
图13为BMGY和1/2BSM培养基下的目标蛋白占比对比示意图。
图14为上样pH对Blue Sepharose 6FF亲和层析的影响。
图15为Blue Sepharose 6FF亲和层析洗脱曲线。
图16为Blue Sepharose 6FF亲和层析蛋白电泳分析；M为Marker；1-4分别为0、333、666和1000mg/L HSA标品；5为分离纯化原料液；6为原料液稀释；7为亲和层析上样液；8为流穿液；9为洗脱液；10为再生液。
图17为Phenyl Sepharose 6FF(HS)疏水层析洗脱曲线。
图18为Phenyl Sepharose 6FF(HS)疏水层析蛋白电泳分析。M为Marker；1-4分别为0、333、666和1000mg/L HSA标品；5为疏水层析上样液；6为流穿液；7为洗脱液。
图19为Blue Sepharose 6FF二次亲和层析洗脱曲线。
图20为Blue Sepharose 6FF二次亲和层析蛋白电泳分析；M为Marker；1-4分别为0、333、666和1000mg/L HSA标品；5为二次亲和层析上样液；6为流穿液；7为洗脱液；8为再生液。
图21为三步层析洗脱液蛋白电泳对比。
图22为浓缩后二次亲和层析洗脱液HPLC纯度鉴定。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
Tris(三羟甲基氨基甲烷)、丙烯酰胺、过硫酸铵(用于制备蛋白电泳凝胶)、TEMED(四甲基乙二胺)、SDS(十二烷基硫酸钠)、DTT(二硫苏糖醇)、生物素、YNB(酵母基础氮基)、溴酚蓝、EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、改良型BCA(二喹啉甲酸)蛋白浓度检测试剂盒和0.45μm微孔滤膜购自上海生工生物工程技术有限公司；蓝色琼脂糖凝胶BlueSepharose6FF亲和层析预装柱和苯基琼脂糖凝胶PhenlySepharose 6FF(HS)疏水层析预装柱均购自上海博格隆生物技术有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxiod公司；人血清白蛋白标品购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；其余普通试剂如甲醇、氯化钠、氨水等均购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1：四种培养基在5L发酵罐水平上的产量对比实验
在5L发酵罐水平上对比BMGY培养基、BSM培养基、1/2BSM培养基、1/4BSM培养基的人血清白蛋白产量，培养基的组分如下：
BMGY(甘油缓冲液复合培养基)：20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、40g/L甘油、10g/L硫酸铵、3.4g/L酵母基础氮基、0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)、0.0004g/L生物素。价格约50元/升。
BSM(基础盐培养基)：40g/L甘油、26.7mL/L磷酸(85％)、0.93g/L二水合硫酸钙、18.2g/L硫酸钾、14.9g/L七水合硫酸镁、4.13g/L氢氧化钾、4.0mL/L PTM1(毕赤酵母微量元素1，具体组分为：6g/L五水合硫酸铜、0.08g/L碘化钠、3g/L一水合硫酸锰、0.2g/L二水和钼酸钠、0.02g/L硼酸、0.5g/L氯化钴、20g/L氯化锌、65g/L七水合硫酸亚铁、0.2g/L生物素、5mL/L硫酸)。价格约3-4元/升(培养基的初始pH调节至5.0)。
1/2BSM培养基：40g/L甘油、13.3mL/L磷酸(85％)、0.46g/L二水合硫酸钙、9.1g/L硫酸钾、7.4g/L七水合硫酸镁、2.06g/L氢氧化钾、4.0mL/L PTM1；
1/4BSM培养基：40g/L甘油、6.6mL/L磷酸(85％)、0.23g/L二水合硫酸钙、4.5g/L硫酸钾、3.7g/L七水合硫酸镁、1.03g/L氢氧化钾、4.0mL/L PTM1。
具体操作过程如下：
(1)取巴斯德毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-hsa-5-4甘油菌(即背景提及专利申请201711421153.3的实施例5中所用菌株，其制备方法在此引用该份专利的全部内容)划YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，具体组分为：10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋白胨、20g/L葡萄糖)平板活化；
(2)挑取单克隆于装有10mL YPD液体培养基(培养基组成为：10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋白胨、20g/L葡萄糖)的100mL三角瓶中，于28℃、230rpm中培养约24小时，作为一级种子；
(3)取(2)中所得一级种子的5mL YPD培养物于装有100mL YPD液体培养基的500mL三角瓶中，于28℃、230rpm中培养约12小时，作为二级种子，并在接种前测量菌体湿重，同时做镜检确保无杂菌；
(4)按上述配方配置BMGY或BSM培养基、1/2BSM培养基、1/4BSM培养基、PTM1(微量元素)、和50％甘油补料液(30g甘油溶于水中并定容终体积至60mL)；校正pH电极和溶氧电极后，将BMGY或BSM培养基、1/2BSM培养基、1/4BSM培养基随发酵罐一起灭菌；灭菌后将罐体放置在室温中，冷却到室温(BMGY去除三个不可高压灭菌的组分之外，罐中培养基体积为700mL，BSM无不可高压灭菌的组分，故罐中培养基体积为1L)；
(5)通过补料瓶和发酵罐补料装置将培养基中不可高温灭菌的成分(YNB、生物素、磷酸钾缓冲液)打入罐内；让发酵系统在初始温度28℃、pH为5.75(BMGY)或5.0(BSM、1/2BSM、1/4BSM)、初始转速200rpm、1vvm(air volume/culture volume/min，通气比)的条件下稳定1小时，随后溶氧校正100％，同时通过补料瓶和补料装置将步骤(3)中所得的二级种子液打入发酵罐，维持温度28℃、pH为5.75(BMGY)或5.0(BSM、1/2BSM、1/4BSM)，溶氧水平(DO)和转速(Agit)偶联；
(6)DO出现反弹后补充甘油补料培养基(50％甘油[30g甘油溶于水中并定容终体积至60mL]+12mL PTM1/L)，维持15mL/(L*h)的速度，4小时内补完，共补入体积60mL，含30g甘油，维持温度28℃、pH为5.75(BMGY)或5.0(BSM、1/2BSM、1/4BSM)，DO和转速偶联；
(7)DO出现反弹后补充甲醇补料培养基(100％甲醇+12mL PTM1/L)，维持温度28℃、pH＝5.75，关闭DO和转速的偶联并将转速设置为900rpm，将补料和DO进行反相关联并设置临界值为20％(即DO大于20％时开启补料而DO低于20％时停止补料)。
每隔12小时取样、镜检、测量湿重并做蛋白电泳检测发酵液中的人血清白蛋白浓度(目标蛋白浓度可通过蛋白电泳测得)，在目标蛋白浓度出现下降趋势时放罐。
BMGY和BSM两种培养基的发酵液上清液蛋白电泳的结果如图1和图2、图3所示，两种培养基培养诱导下的菌体湿重和人血清白蛋白产量分别如图4和图5所示。
结果表明，在BMGY和BSM两种培养基的培养下，初始的40g/L甘油均维持菌体生长约20小时，菌体湿重也均达到120g/L左右；甘油补料阶段维持4小时，菌体湿重均达到约200g/L；在甲醇诱导阶段，BMGY培养基和BSM培养基下菌体生长速度所差无几。在目标蛋白(即人血清白蛋白)表达方面，虽然BMGY下目标蛋白积累速度较快，但在诱导后132小时达到浓度峰值，为9.1g/L，随后出现下降。在BSM培养诱导下，菌体密度和目标蛋白浓度都能够实现更为持久的积累，菌体密度在诱导终期达到约500g/L，而目标蛋白浓度在诱导后192小时达到峰值，为11.46g/L。
1/2BSM和1/4BSM培养基的发酵液上清蛋白电泳结果如图6、图7、图8和图9所示，三种不同盐浓度BSM培养基培养诱导下的菌体湿重和人血清白蛋白产量分别如图10和图11所示。结果表明，与BSM相比，生产菌株在盐浓度下降后的培养基(即1/2BSM和1/4BSM)上表现出显著更优的生长状况。其中菌体在1/2BSM培养基中很快到达约500g/L的湿重峰值，并维持此湿重长达120小时直至发酵终点；而1/4BSM培养基中菌体虽然也生长较快，但在发酵后期出现了生长停滞现象。在目标蛋白表达方面，1/2BSM培养基实现了持续稳定的目标蛋白积累，在诱导后192小时达到峰值17.47g/L，显著高于BSM；在1/4BSM培养基中，目标蛋白的积累速度在发酵初期和中期均为最快，虽然但在发酵中后期表现为停止积累，但是在诱导后156小时实现最大目标蛋白产量13.39g/L，同样显著高于现有技术。
可见，降低BSM培养基的盐浓度并未造成生产菌株出现营养匮乏，盐浓度和渗透压的降低反而促进了菌体的生长和目标蛋白表达。
本实例进一步使用渗透压测量仪对各个培养基各个时间点的发酵液渗透压进行了测量，结果如图12所示。结果表明，BSM原培养基的渗透压高达1400mOsm/kg以上，远远超过日常使用的其他类型培养基。整体而言，渗透压随着培养时间的延长而降低，原因为菌体将发酵液中的盐离子作为营养物质吸收到胞内使得发酵液中的盐离子浓度不断降低。此外，观察到培养基渗透压的下降变化恰好与菌体湿重的上升变化相吻合，故推测渗透压变化趋势可较好的反应出生产菌株的生长状态，例如在1/4BSM培养基下的发酵中后期，发酵液渗透压一直处于100mOsm/kg以下，可推测发酵液中作为营养物质的盐离子已所剩无几，菌体生长也处于停滞状态。
此外，将BMGY和1/2BSM培养基培养诱导下的发酵液上清进行蛋白电泳对比，结果如图13所示，1/2BSM时杂蛋白的比例明显低于BMGY，进一步使用改良型BCA蛋白浓度检测试剂盒对发酵液上清的总蛋白浓度进行检测。结果表明，1/2BSM培养基下诱导192小时后的发酵液上清总蛋白浓度为22.73g/L，则推出其目标蛋白占比为76.86％，显著高于BMGY下的50.19％。
各培养基下的目标蛋白浓度测量方法为：将已知不同浓度的商品化重组白蛋白(纯度>99.9％)作为标品与稀释后的发酵液上清进行蛋白电泳，根据标品的浓度和扫描得到的条带灰度进行拟合，线性相关性大于99％时视为数据有效，在数据有效的基础上可根据发酵液上清的目标蛋白条带灰度值计算其浓度；总蛋白浓度使用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海生工)测量；将目标蛋白浓度除以总蛋白浓度即得到目标蛋白占比。
综上所述，本发明使用降低盐浓度的培养基(此处以1/2BSM为例)培养本生产菌株GS115-pPIC9K-hsa-5-4，从一级种子的培养至该培养基培养诱导下的发酵终点，共耗时252小时(24小时一级种子培养+12小时二级种子培养+24小时罐内生长+192小时罐内诱导)，培养基成本约为40元(YPD二级种子培养基约1.5元+1L 1/2BSM约3元+1.62L甲醇约26元+0.5L氨水约9元；此成本为科研实验室购买分析纯级化学试剂的参考价格，若后续在产业化生产中进行大量采购，此成本可以进一步降低)，发酵液总体积约2.5L，其中上清约为1.25L，目标蛋白总产量为21.84g。此生产菌株和发酵工艺能以较低的培养基成本实现较高的目标蛋白生产，具备较佳的产业化前景。
实施例2：人血清白蛋白的分离纯化
本实例将1/2BSM培养基下诱导192小时的发酵液上清进行0.45μm微孔滤膜过滤，将滤过液作为分离纯化原料液。在进行Blue Sepharose 6FF亲和层析时，上样缓冲液的pH选用为5。
配置不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)的亲和层析A液[25mM KPB(磷酸钾缓冲液)+0.1M NaCl]，与发酵上清液以9：1混合后进行上样并使用pH7.0的亲和层析B液(25mM KPB+2.0M NaCl)进行洗脱，收集流穿液和洗脱液进行蛋白凝胶电泳，结果如图14所示。由电泳结果可知，随着上样pH(上样时上样溶液的pH值)的增大，从层析柱中流穿的目标蛋白含量有增多的趋势，说明Blue Sepharose 6FF对目标蛋白的结合能力随着pH的升高而降低，而pH小于人血清白蛋白等电点4.3时白蛋白可能出现沉淀或者不稳定，由此可以预见在人血清白蛋白等电点4.3以上时的酸性条件下，Blue Sepharose 6FF对目标蛋白的结合能力均很强。在pH5的上样缓冲液体系下，流穿液电泳结果中几乎看不到目标蛋白；在pH6的上样缓冲液体系下，流穿液电泳结果中目标蛋白也很微弱；而在其他pH≥7的上样缓冲液体系下，流穿液电泳结果中的目标蛋白较多。
(1)Blue Sepharose 6FF亲和层析(蓝胶亲和层析)
取0.4mL的分离纯化原料液，与3.6mL亲和层析A液(25mM KPB[kalium(potassium)phosphate buffer，即磷酸钾缓冲液]+0.1M NaCl，pH＝5)均匀混合使得上样样品的浓度为0.09M，并使用0.45μm微孔滤膜过滤，以此滤过液为亲和层析上样液。使用亲和层析A液平衡Blue Sepharose 6FF后，通过泵头将亲和层析上样液淋洗层析柱并接收流穿液(Ft)。使用亲和层析B液(25mM KPB+2.0M NaCl，pH＝7)进行洗脱，接收洗脱液(Peak1)。使用0.1M NaOH进行柱再生，并接收再生液(Peak2)。洗脱曲线如图15所示；将流穿液、洗脱液和再生液进行蛋白电泳分析，结果如图16所示。由电泳结果可知，洗脱液中含有达到一定纯度的目标蛋白，而目标蛋白降解片段则富集于强碱再生液中。此外，将培养基由BMGY优化为1/2BSM并将亲和层析上样pH由7.0优化为5.0后，洗脱回收率有明显提高(目标蛋白纯度与背景所提专利申请201711421153.3中的相当，其回收率由背景所提专利申请201711421153.3中的58％提高到86％，本实验汇总的回收率和纯度等数据具体参见表1)。由于洗脱液仍然呈现淡黄色，推测其中含有亲和层析无法去除的色素类杂质，故本实例下一步采取疏水层析进行色素的去除。
(2)Phenyl Sepharose 6FF(HS)疏水层析
通过电导的测量，推测上步亲和层析洗脱液实际的NaCl含量约在1.3M左右。为保证上样过程的平衡，将亲和层析洗脱液与25mM KPB+2.7M NaCl，pH＝7的缓冲液进行1：1混合，则最终溶液的NaCl浓度维持在2M左右。使用Phenyl Sepharose 6FF疏水层析的A液(25mM KPB+2.0M NaCl，pH＝7)进行柱平衡后，通过泵头将混合液淋洗层析柱并接收流穿液(Ft)。使用疏水层析B液(25mM KPB，pH＝7)进行洗脱，接收洗脱液(Peak1)。使用0.1M NaOH进行柱再生。洗脱曲线如图17，由洗脱曲线可知，流穿液中仍含有少量蛋白，而B液洗脱后层析柱中无蛋白残留；将流穿液、洗脱液进行蛋白电泳分析，结果如图18。由电泳结果可知，流穿液中含有极少量目标蛋白，但绝大部分仍然在洗脱液中，且洗脱液呈现透明无色，说明色素得到了较为有效的去除(相应的目标蛋白纯度和回收率的数据详见表1)。
(3)Blue Sepharose 6FF二次亲和层析
由于疏水层析洗脱液中仍然含有极少量的目标蛋白降解片段，故本实例进行BlueSepharose 6FF进行二次亲和层析以期进一步去除杂质。由于疏水层析洗脱液中仍含有一定量的NaCl，故将其与25mM KPB，pH＝7的缓冲液进行1：9混合，使其最终溶液的NaCl浓度介于0-0.1M之间。使用亲和层析A液(25mM KPB+0.1M NaCl，pH＝5)平衡Blue Sepharose 6FF后，通过泵头将二次亲和层析上样液淋洗层析柱并接收流穿液(Ft)。使用亲和层析B液(25mM KPB+2.0M NaCl，pH＝7)进行洗脱，接收洗脱液(Peak1)。使用0.1M NaOH进行柱再生，并接收再生液(Peak2)。洗脱曲线如图19，由洗脱曲线可知，仍有一部分蛋白为高盐B液无法洗脱而仅能被强碱洗脱；将流穿液、洗脱液和再生液进行蛋白电泳分析，结果如图20。由电泳结果可知，目标蛋白降解片段被进一步富集到强碱洗脱液中，而高盐洗脱液则只显示出目标蛋白的单一条带，说明二次亲和层析起到了进一步精纯的效果(相应的目标蛋白纯度和回收率的数据详见表1)。
将以上三步分析纯化所得样品进行蛋白电泳分析，结果如图21。
对浓缩后的二次亲和洗脱液进行HPLC纯度鉴定，鉴定结果如图22。由检测结果可知，二次亲和洗脱液为纯度较高(>99％)的终产品。
分离纯化总结表1如下所示。
表1分离纯化总结表
此分离纯化方案的最终总回收率达到67.53％，结合罐上发酵的目标蛋白浓度可知，若此方案能够顺利放大，理论上可在每升发酵液中获取10g以上纯度较高的人血清白蛋白。该生产菌株优良的目标蛋白表达性能，结合高效的下游发酵工艺和纯化方案，具备较好的产业化前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院
<120> 一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法
<130> P180117303C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1830
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60
gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120
gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180
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