阅读说明：本技术 一种三联8-羟基喹啉及其制备和应用 (Tri-8-hydroxyquinoline and preparation and application thereof ) 是由 张煊 鲁珍妮 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种三联8-羟基喹啉及其制备和应用,所述结构如式I所示。制备包括:将5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉与2-甲基-8-羟基喹啉在乙酸酐中回流,经水解后即得；本发明三联8-羟基喹啉化合物作为荧光探针,应用于水溶液中镁离子的高选择性识别和活体细胞中荧光成像。(The invention relates to a tri-8-hydroxyquinoline and a preparation method and application thereof, and the structure is shown as a formula I. The preparation method comprises refluxing 5, 7-diformyl-8-hydroxyquinoline and 2-methyl-8-hydroxyquinoline in acetic anhydride, and hydrolyzing; the tri-8-hydroxyquinoline compound is used as a fluorescent probe and applied to high-selectivity identification of magnesium ions in aqueous solution and fluorescence imaging in living cells.)

一种三联8-羟基喹啉及其制备和应用

技术领域

本发明属于功能性有机材料及其制备和应用领域，特别涉及一种三联8-羟基喹啉及其制备和应用。

背景技术

8-羟基喹啉是一种广泛用于金属离子测定的络合剂，但选择性较差，致使其在荧光探针应用方面受到了极大局限。通过修饰8-羟基喹啉分子来提高选择性，是拓展该类化合物在荧光探针应用的重要策略而得到了广泛关注。目前报道的大多数8-羟基喹啉类化合物的荧光发光波长与8-羟基喹啉母体类似，均约在500nm左右。而对于细胞荧光成像应用而言，长波长(>600nm)的荧光发射更具有应用前景。Kao等曾报道了基于8-羟基喹啉类衍生物的镁离子荧光探针，其最大荧光发射波长为487nm，而且对镁离子选择性也较差(M.H.Kaoet al,J.Lumin.,2016,169,156)。因此，设计合成兼具长波长荧光发射和高选择性识别性能的8-羟基喹啉类化合物则仍然是一项具有挑战性的任务。另一方面，镁离子在人体内具有重要的生理功能，与多种活性酶密切相关，因此发展对细胞内镁离子可实现高选择和高灵敏检测的荧光探针意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三联8-羟基喹啉及其制备和应用，克服了现有技术中8-羟基喹啉荧光探针的选择性较差和发射波长短的缺陷，本发明所涉及的化合物是将三个8-羟基喹啉分子通过双键依次相连，以得到的三联8-羟基喹啉作为荧光探针实现了对镁离子的高选择性识别，荧光发射波长长(>600nm)，具有对细胞内镁离子荧光成像的应用前景。

本发明的一种结构如式I的三联8-羟基喹啉：

本发明的一种三联8-羟基喹啉的制备方法，包括：

(1)将8-羟基喹啉与六次甲基四胺在三氟乙酸中反应，冷却至室温并过滤，洗涤，烘干，得到5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉；

(2)将步骤(1)中的5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉与2-甲基-8-羟基喹啉在醋酸酐中回流，冷却至室温，用二氯甲烷萃取并收集有机相，旋蒸除去溶剂所得固体产物用吡啶溶解，再加入水，加热下继续反应，提纯，烘干，得到深红色固体，即为三联8-羟基喹啉。

上述制备方法的优选方式如下：

所述步骤(1)中8-羟基喹啉、六次甲基四胺、三氟乙酸的配比为1mmol:2mmol:2ml。

所述步骤(1)中反应温度为105-115℃，反应时间48-72h。

所述步骤(1)中洗涤为经稀盐酸洗涤，稀盐酸浓度为0.5M，体积为50ml。

所述步骤(2)中5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉、2-甲基-8-羟基喹啉、醋酸酐、吡啶、水的配比为1mmol:2.4mmol:15ml:10ml:10ml。

所述步骤(2)中氮气保护下，在醋酸酐中回流为120-130℃回流72-96h；加热下继续反应为：在吡啶水溶液中100-120℃回流36-60h。

所述步骤(2)中提纯为旋蒸除去吡啶，加水，过滤，水洗，乙醇洗。

本发明的一种基于所述三联8-羟基喹啉的荧光探针。

本发明的一种所述荧光探针在镁离子选择性识别和荧光定量检测镁离子浓度中的应用。所述荧光定量检测镁离子浓度为：测试602nm处的荧光强度，建立与镁离子浓度之间的标准曲线，回归方程为Y＝1.5859X+0.1181，Y为荧光强度，X为镁离子浓度，线性回归常数为0.9905，镁离子浓度的检测范围为0-8μM，检测限为0.1μM。

本发明的一种所述荧光探针在生物荧光成像中的应用。

进一步，所述应用将荧光探针与活体细胞及镁离子一起培养，可利用荧光共聚焦显微镜对细胞中镁离子进行荧光成像分析。

本发明通过Edinburgh FS5荧光仪测试三联8-羟基喹啉化合物和金属离子混合溶液(pH＝7.4，Tris-HCl缓冲溶液含90％二甲亚砜)的荧光光谱，考察其作为荧光探针对镁离子的选择性识别性能。将呈梯度变化的镁离子的水溶液分别加入荧光探针的溶液，以镁离子浓度为横坐标，荧光强度的变化为纵坐标作图，得到线性工作曲线。测试602nm处的荧光强度，利用工作曲线计算镁离子浓度。镁离子浓度的检测范围为0-8μM，检测限为0.1μM。荧光探针的激发波长475nm，发射波长602nm。

将荧光探针与活体Hela细胞在pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中一起培养5min，并利用Carl Zeiss LSM 700荧光共聚焦显微镜进行细胞荧光成像观察。再将镁离子加入上述Hela细胞溶液培养5min后，再一次利用荧光共聚焦显微镜进行细胞荧光成像观察。

有益效果

本发明的三联8-羟基喹啉使用的原料廉价，制备方法简单，荧光发射波长长(>600nm)；

本发明的三联8-羟基喹啉作为荧光探针选择性高，对镁离子具有高度选择性，其它常见离子都无明显干扰(如图2所示)；

本发明的三联8-羟基喹啉荧光探针对镁离子的检测线性范围宽为0-8μM，检测灵敏度高，检测限为0.1μM，较现有技术文献中的0.8μM低(对比文献：M.H.Kao et al,J.Lumin.,2016,169,156)。

本发明荧光探针在pH7.4的生理环境条件下工作，可应用于细胞荧光成像。

附图说明

图1为本发明所涉及的三联8-羟基喹啉的合成路线示意图；

图2为本发明所涉及的三联8-羟基喹啉对镁离子的选择性响应荧光光谱图；

图3为本发明涉及的三联8-羟基喹啉随镁离子浓度变化的荧光光谱图；

图4为本发明涉及的三联8-羟基喹啉的荧光强度变化与镁离子浓度之间的线性关系；

图5为本发明所涉及的三联8-羟基喹啉在Hela细胞中检测镁离子的共聚焦荧光成像图，(a)和(c)为明场，(b)和(d)为暗场。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

三联8-羟基喹啉的合成：

(1)5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉的合成：8-羟基喹啉(1mmol,AR,国药集团化学试剂有限公司)和六次甲基四胺(2mmol,AR,国药集团化学试剂有限公司)溶于三氟乙酸(2ml,AR,Acros试剂公司)中，在110℃回流反应72h，旋转蒸发除去溶剂，稀盐酸洗涤，过滤，水洗固体至中性，真空干燥，得到5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉，产率82％。

¹H NMR(400MHz,DMSO),δ(ppm):10.46(s,1H),10.04(s,1H),9.83(dd,J＝1.44,8.59Hz,1H),8.97(dd,J＝1.44,4.72Hz,1H),8.40(s,1H),8.05(dd,J＝4.73,8.60Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO),δ(ppm):191.75,188.03,166.85,145.10,139.27,138.28,138.16,130.36,126.77,119.13,116.67.ESI-MS:m/z cald for C₁₁H₇NO₃,201.18；found:[M-H]^-:200.1.

(2)三联8-羟基喹啉的合成：5,7-二甲酰基-8-羟基喹啉(1mmol)和2-甲基-8-羟基喹啉(2.4mmol,AR,Alfa试剂公司)溶于乙酸酐15ml乙醇，N₂保护下，在125℃回流反应96h，冷却至室温。用二氯甲烷萃取(20ml×3)并收集有机相，旋蒸得到的固体用10ml吡啶溶解，加入10ml水，100℃下反应48h，冷却至室温。旋蒸除去吡啶，加水，过滤，水洗，乙醇洗，烘干得到三联8-羟基喹啉，产率5.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.74(s,3H),9.68(d,J＝15.2Hz,2H),9.13(d,J＝7.8Hz,1H),8.99(d,J＝3.6Hz,1H),8.88(d,J＝16.0Hz,1H),8.50(s,1H),8.41(d,J＝16.3Hz,1H),8.34(t,J＝8.3Hz,2H),7.91(dd,J＝21.8,12.7Hz,3H),7.75(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.68(d,J＝15.7Hz,1H),7.40(d,J＝3.2Hz,3H),7.12(s,1H).MALDI-TOF-MS:m/z calculated for C₃₁H₂₁N₃O₃,483.53；found[M+K]⁺:522.62.

三联8-羟基喹啉的合成路线如图1所示。

实施例2

三联8-羟基喹啉对镁离子的选择性荧光识别：

采用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液控制实验条件。

在不同10ml比色管中分别依次加入0.1ml三联8-羟基喹啉的二甲亚砜溶液(1mM)，0.1ml待测金属离子水溶液(Mg²⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Zn²⁺,Ba²⁺,Al³⁺,Fe³⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Hg²⁺,Mn²⁺,Pb²⁺,Pd²⁺,Li⁺,Na⁺,K⁺,Ag⁺)(金属离子浓度均为1mM)，用二甲亚砜(含10％Tris-HCl，pH＝7.4缓冲溶液)定容至10ml，放置5min。将3ml上述工作液转移至1cm荧光比色皿中测定荧光光谱，激发波长为475nm。空白实验为上述溶液中不加任何金属离子。对镁离子的选择性检测如图2所示。可见只有在镁离子存在下602nm处的荧光显著增强，表明了本发明所涉及的三联8-羟基喹啉作为长波长荧光探针对镁离子具有高度选择性。

实施例3

三联8-羟基喹啉对镁离子的定量荧光检测：

在不同10ml比色管中依次加入0.1ml三联8-羟基喹啉的二甲亚砜溶液(1mM)，系列不同体积(0-0.08ml)的1mM的镁离子水溶液，并用二甲亚砜(含10％Tris-HCl，pH＝7.4缓冲溶液)定容至10ml，放置5min。定容后三联8-羟基喹啉的浓度为10μM，镁离子浓度为0-8μM。将3ml工作液转移至1cm荧光比色皿中记录荧光光谱并读取记录602nm处的荧光强度。将荧光强度和相应镁离子浓度数据输入软件Origin8进行拟合，在镁离子浓度为0-8μM范围内得一线性工作曲线，回归方程为Y＝1.5859X+0.1181,Y为荧光强度，X为镁离子浓度，线性回归常数为0.9905，表明三联8-羟基喹啉可定量荧光检测镁离子的浓度。随镁离子浓度变化的荧光光谱变化以及相应线性关系分别如图3和4所示。

实施例4

三联8-羟基喹啉对活体细胞中镁离子的荧光成像应用：

将三联8-羟基喹啉与活体Hela细胞(探针浓度为20μM、培养基为10％胎牛血清、在5％CO₂和95％湿度，37℃条件下培养48小时)培养5min后，置于荧光显微镜下观察，在明场下可清晰观察到细胞(如图5a所示)，暗场下只有微弱荧光(如图5b所示)，表明细胞中微量镁离子的存在；进一步在培养液中加入30μM镁离子培养5min后，置于荧光显微镜下观察，在明场可清晰观察到细胞(如图5c所示)，暗场下出现强烈红色荧光(如图5d所示)，表明该发明涉及的三联8-羟基喹啉作为荧光探针可成功用于活体细胞中镁离子的荧光成像分析，在生物荧光成像中具有重要的应用前景。

对比例1

现有文献(M.H.Kao et al,J.Lumin.,2016,169,156)中喹啉荧光探针测定镁离子的发射波长为487nm，检测下限为0.8μM，工作介质为有机溶剂乙腈，不能应用细胞成像；

本发明中三联喹啉荧光探针测定镁离子的发射波长为602nm，检测下限为0.1μM，工作介质为含水介质，可应用于细胞成像。可见本发明的三联喹啉化合物具有荧光发射波长更长和更灵敏的优点，并能应用于细胞成像。