阅读说明：本技术 抗衰老的中药提取物及其提取方法和用途 (Anti-aging traditional Chinese medicine extract and extraction method and application thereof ) 是由 陈谨 何云燕 苏俊 李艾 于 2020-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗衰老的中药提取物及其提取方法和用途,本发明人参黄芪提取物中含有黄芪甲苷20～30％、人参皂苷Rg1 1～5％、人参皂苷Re 2～6％、人参皂苷Rb1 0.2～0.5％,高效液相色谱指纹图谱中包括17个特征峰,可有效提高端粒酶的活性,延缓细胞衰老,可应用于制备抗衰老产品。(The invention discloses an anti-aging traditional Chinese medicine extract, an extraction method and application thereof, wherein the ginseng astragalus extract contains 20-30% of astragaloside IV, 78-5% of ginsenoside Rg 11, 2-6% of ginsenoside Re and 10.2-0.5% of ginsenoside Rb, and a high performance liquid chromatography fingerprint comprises 17 characteristic peaks, so that the activity of telomerase can be effectively improved, the cell aging can be delayed, and the extract can be applied to preparation of anti-aging products.)

抗衰老的中药提取物及其提取方法和用途

技术领域

本发明涉及中药材提取物及提取方法领域，特别是抗衰老的中药提取物及其提取方法和用途。

背景技术

细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生物体衰老基本单位。细胞衰老(cellaging)是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。细胞的生命历程都要经过未分化、分化、生长、成熟、衰老和死亡几个阶段。

尽管衰老死亡是不可避免的自然规律，但延缓衰老，尤其是努力避免病理性衰老却是可以做到的。据报道，2050年全球60岁以上老年人达到20亿，大约为总人口的20～30％。面临人口老化进程加快和人口寿命普遍提高的趋势，保障老年人享有良好的健康和较高的生活质量已成为社会科学和生命科学共同关注的重大问题，深入研究更有效的抗衰老产品，必将有利于我国“健康的老龄化”目标的实现。因此，开展延缓衰老的研究、开发延缓衰老的产品具有重要的科学意义和社会价值。

发明内容

长久以来，人们不断在探索延缓衰老、延年益寿的方法，中国传统医学对延年益寿的研究，有着悠久的历史、珍贵的文献记载和丰富的实践经验，也记载了许多中药材均具有抗衰老的功效，在抗衰老产品的研发过程中，研发者们发现虽然诸多中药材均具有抗衰老的功效，但其抗衰老效果并不十分理想或显著，即使采用活性物质含量更高的提取物，中药材的抗衰老活性仍很难得到进一步提升。

因此，如果进一步提高中药材的抗衰老活性，得到能够更有效延缓衰老的提取物，一直是本领域内亟待解决的问题。

本发明的目的在于提供一种抗衰老的中药提取物及其提取方法，可得到抗衰老效果更好的产品。

为了解决上述问题，本发明提供一种组合物，含有如下重量份组份：黄芪甲苷20～30份、人参皂苷Rg1 1～5份、人参皂苷Re 2～6份、人参皂苷Rb1 0.2～0.5份。

进一步地，含有如下重量份组份：黄芪甲苷22～28份、人参皂苷Rg1 1.8～4份、人参皂苷Re 3～5份、人参皂苷Rb1 0.2～0.3份。

本发明还提供一种提取物，其原料包括如下重量份原料：人参和/或西洋参1份，黄芪4～8份，进一步黄芪4～6份；提取物中含有黄芪甲苷20～30％、人参皂苷Rg1 1～5％、人参皂苷Re 2～6％、人参皂苷Rb1 0.1～0.5％。

进一步地，所述提取物中含有黄芪甲苷22～28％、人参皂苷Rg1 1.8～4％、人参皂苷Re 3～5％、人参皂苷Rb1 0.2～0.3％。

进一步地，所述提取物中的总皂苷含量为75～95％，总多糖含量为3～10％。

更进一步地，总皂苷含量为80～90％，总多糖含量为5～8％。

进一步地，所述人参为人参和/或人参炮制品。

更进一步地，所述人参炮制品选自生晒参、红参、活性参中的一种或几种。

本发明还提供一种提取物，包含人参皂苷Re；提取物的高效液相色谱指纹图谱中至少包括6个特征峰，以人参皂苷Re的特征峰为参照峰，所述6个特征峰与参照峰的相对保留时间为：0.95、1.00、1.80、2.13、2.36、3.20。

进一步地，还包括11个特征峰，所述11个特征峰与参照峰的相对保留时间为：1.66、1.69、1.73、1.86、1.88、1.94、1.99、2.02、2.28、2.40、2.45。

进一步地，其原料包括如下重量份原料：人参和/或西洋参1份，黄芪4～8份，进一步黄芪4～6份。

进一步地，所述人参为人参和/或人参炮制品。

更进一步地，所述人参炮制品选自生晒参、红参、活性参中的一种或几种。

进一步地，相对保留时间为0.95、1.00、1.80、2.13、2.36和3.20的特征峰的相对峰面积依次为：48.41％、100.00％、107.04％、48.70％、340.51％和54.83％。

进一步地，相对保留时间为1.66、1.69、1.73、1.86、1.88、1.94、1.99、2.02、2.28、2.40和2.45的特征峰的相对峰面积依次为：9.52％、17.21％、2.61％、4.16％、22.88％、10.92％、16.34％、8.33％、3.37％、5.14％和14.59％。

上述的相对保留时间、相对峰面积，均可以在合理的范围内波动，如在其数值的上下5％范围内波动，都应视为落入本发明要求保护的范围。

本发明还提供了上述提取物的高效液相指纹图谱的检测方法，采用高效液相色谱法进行定性和/或定量检测，色谱条件包括：

色谱柱：C18硅胶色谱柱；

流动相：水和乙腈，采用如下梯度洗脱程序：

时间(min)	水(V％)	乙腈(V％)
			0	80～90	10～20
30～35	60～70	30～40
			70～85	10～30	70～90

；

进一步地，采用如下洗脱程序：

时间(min)	水(V％)	乙腈(V％)
			0	85	16
33	66	34
			78.5	20	80

。

进一步地，所述检测方法还包括如下条件：

①色谱柱规格：150*3.9mm，5μm；

②柱温：25～35℃，优选30℃；

③流速：0.8～1.2mL/min，优选1.00mL/min；

④检测波长：200～205nm，优选203nm。

本发明还提供了一种天然植物提取物的制备方法，包括如下内容：(1)原料以水提取；(2)采用大孔吸附树脂富集；(3)酶解；(4)膜过滤，截留分子量200～1000；(5)固液分离；

所述植物选自人参、西洋参中的一种或两种，和/或黄芪；即，所述植物可以是人参、西洋参、黄芪中的一种；也可以是：①人参和黄芪、②西洋参和黄芪、③人参和西洋参，两种植物混合提取；还可以是人参、西洋参、黄芪三种植物混合提取。

进一步地，所述人参为人参和/或人参炮制品。

更进一步地，所述人参炮制品选自生晒参、红参、活性参中的一种或几种。

生晒参为一种商品人参，也称白参，为人参根挖出后洗净晒干的产品。

红参为五加科人参的栽培品经过蒸制后的干燥根及根茎，于秋季采挖，洗净蒸制后，干燥。本发明中使用的是普通红参。

活性参即低温冷冻干燥人参。因为该产品放在水中能快速吸水，外观可以恢复至类似鲜人参状态，故称“活性参”。

生晒参、红参、活性参均为本领域常见的人参炮制品，可通过市售购买，也可通过现有技术制备，得到的生晒参、红参、活性参均可应用于本发明，以符合国家标准的生晒参、红参、活性参为优选(国家标准文件：GB/T 22536-2018生晒参分等质量；GB/T 22538-2018红参分等质量；GB/T 22535-2018活性参分等质量)。

在本发明的实施方式中，所述水提取步骤中，水：原料的液料比用量为5～15:1mL/g；

进一步地，所述水提取的次数为1～4次；更进一步地，为2次。

在本发明的实施方式中，所述大孔吸附树脂富集，是将水提取得到的提取液用大孔吸附树脂进行吸附，再依次用水、10～40％乙醇、60～80％乙醇冲洗，收集60～80％乙醇冲洗得到的部分；

进一步地，是分别用水、25～30％乙醇、70～80％乙醇冲洗，收集70～80％乙醇冲洗得到的部分；

更进一步地，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂；优选地，所述大孔吸附树脂选自D-101、HPD-10、X-5、AB-8。

在本发明的实施方式中，所述酶解，是将大孔吸附树脂富集后得到的物质进行酶解；

酶解可采用糖苷酶、果胶酶、淀粉酶中的一种或多种。

进一步地，酶解可采用β-葡萄糖苷酶、木聚糖苷酶、乳糖酶、***呋喃糖苷酶、果胶裂解酶、淀粉酶中的一种或多种。

在本发明的具体实施例中，所述酶为β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比为2～4:1组成的复合酶。

进一步地，酶解条件为：在原料质量0.2～1.0％的复合酶、pH为5～6、40～55℃的条件下酶解；

进一步地，所述复合酶的用量为0.4～0.6％；

进一步地，所述酶解的时间为3～8h；更进一步地，所述酶解的时间为4～6h。

本发明还提供了上述方法制备得到的如下提取物之一：

(1)人参提取物；(2)西洋参提取物；(3)黄芪提取物；(4)人参和西洋参的混合提取物；(5)人参和黄芪的混合提取物；(6)西洋参和黄芪的混合提取物；(7)人参、西洋参和黄芪的混合提取物。

本发明还提供了一种组合物，包括如下重量份原料：上述的人参提取物和/或西洋参提取物1份，上述的黄芪提取物5～14份；进一步地，包括上述的人参提取物和/或西洋参提取物1份，上述的黄芪提取物5.5～11份。

本发明还提供了上述的提取物、上述提取方法、上述组合物中的一项或多项，在制备可提升端粒酶活性和/或增长端粒长度的产品中的用途；此处所述提取物可选自前述提及的所有提取物，不仅限于用组分或指纹图谱限定的提取物。

进一步地，所述产品为端粒酶激活剂；

进一步地，所述产品为抗衰老产品；

更进一步地，所述产品为延缓细胞老化的产品。

本发明还提供一种产品，包括上述提取物、上述组合物中的一种或多种；此处所述提取物可选自前述提及的所有提取物，不仅限于用组分或指纹图谱限定的提取物。

本发明中提及的产品包括但不限于食品、药品、保健品。

上述产品中除了包含前述提取物或组合物以外，还可以包括辅料、辅助性成分。

本发明所述药学上可接受的辅料，是药物中除主药以外的一切附加材料的总称，辅料应当具备如下性质：(1)对人体无毒害作用，几无副作用；(2)化学性质稳定，不易受温度、pH、保存时间等的影响；(3)与主药无配伍禁忌，不影响主药的疗效和质量检查；(4)不与包装材料相互发生作用。本发明中辅料包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包含糖浆、***胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包含微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包含十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包含0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；调节剂包含盐酸、枸橼酸、氢氧化钾(钠)、枸橼酸钠及缓冲剂(包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)等；乳化剂包含聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包含吐温-80、胆汁、甘油等。

所述辅助性成分可以是与本发明提取物或组合物具有相同作用或功能的中药材或其提取物、化学药品等物质，也可以是具有其它作用或功效的活性物质。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提取方法提取得到的人参提取物、黄芪提取物、人参与黄芪混合提取得到的提取物，均能有效提升端粒酶的活性，具有高的抗衰老活性，可用于制备抗衰老产品。

(2)本发明人参黄芪提取物，在相同浓度下，其抗衰老活性优于任意一种提取物，说明本发明人参黄芪提取物组合后发挥了协同增效作用，使得其抗衰老性能得到显著提升。

附图说明

图1是本发明实施例1的人参黄芪提取物指纹图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例和具体试验对本发明做进一步说明。

实施例1

称取10g药材粉末(人参1.67g，黄芪8.33g)，加入100mL水浸泡3小时，之后升温至回流提取2小时，过滤；滤渣再用80mL水回流提取2小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，20％乙醇，70％乙醇冲洗；收集70％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.5％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比2：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌4小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到本发明的人参黄芪提取物11.0mg(收率0.110％)。

对实施例1提取得到的人参黄芪提取物进行色谱检测，检测的色谱条件见表1，检测得到的指纹图谱见图1，指纹图谱数据见表2(相对保留时间、相对峰面积是以峰2为特征峰计算得到，含量采用外标法测定)。

表1

表2

峰编号	保留时间	相对保留时间	峰面积	相对峰面积	面积％	含量％
							1(人参皂苷Rg1)	15.943	0.95	1365658	48.41％	5.943％	2.806％
2(人参皂苷Re)	16.780	1.00	2821205	100.00％	12.277％	4.213％
							3	27.838	1.66	268658	9.52％	1.169％
4	28.399	1.69	485506	17.21％	2.113％
							5	29.050	1.73	73623	2.61％	0.320％
6(黄芪甲苷)	30.193	1.80	3019883	107.04％	13.141％	25.322％
							7(人参皂苷Rb1)	31.203	1.86	117290	4.16％	0.510％	0.232％
8	31.548	1.88	645376	22.88％	2.808％
							9	32.524	1.94	308034	10.92％	1.340％
10	33.406	1.99	461005	16.34％	2.006％
							11	33.915	2.02	235129	8.33％	1.023％
12	35.731	2.13	1373974	48.70％	5.979％
							13	38.200	2.28	94937	3.37％	0.413％
14	39.545	2.36	9606382	340.51％	41.803％
							15	40.254	2.40	145125	5.14％	0.632％
16	41.063	2.45	411738	14.59％	1.792％
							17	53.758	3.20	1546825	54.83％	6.731％

实施例2

称取10g人参粉末，加入100mL水浸泡3小时，之后升温至回流提取2小时，过滤；滤渣再用80mL水回流提取2小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，20％乙醇，70％乙醇冲洗；收集70％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.5％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比2：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌4小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到人参提取物7.5mg(收率0.075％)。

实施例3

称取10g黄芪粉末，加入100mL水浸泡3小时，之后升温至回流提取2小时，过滤；滤渣再用80mL水回流提取2小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，20％乙醇，70％乙醇冲洗；收集70％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.5％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比2：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌4小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到黄芪提取物11.8mg(收率0.118％)。

在实践中，上述实施例中的提取物收率可在一定合理范围内波动，如可在其数值的上下5％范围内波动。

实施例4

称取10g药材粉末(人参1.67g，黄芪8.33g)，加入120mL水浸泡3小时，之后升温至回流提取1.5小时，过滤；滤渣再用100mL水回流提取1.5小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，30％乙醇，80％乙醇冲洗；收集80％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.4％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比4：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌6小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到本发明的人参黄芪提取物；经HPLC检测本实施例制得的人参黄芪提取物含有黄芪甲苷23.456％、人参皂苷Rg1 1.985％、人参皂苷Re3.669％、人参皂苷Rb1 0.209％。

实施例5

称取10g药材粉末(人参1.67g，黄芪8.33g)，加入100mL水浸泡4小时，之后升温至回流提取1.5小时，过滤；滤渣再用100mL水回流提取1.5小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，25％乙醇，70％乙醇冲洗；收集70％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.5％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比3：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌5小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到本发明的人参黄芪提取物；经HPLC检测本实施例制得的人参黄芪提取物含有黄芪甲苷22.498％、人参皂苷Rg1 1.906％、人参皂苷Re3.235％、人参皂苷Rb1 0.217％。

实施例6

称取10g药材粉末(人参1.67g，黄芪8.33g)，加入100mL水浸泡3小时，之后升温至回流提取2小时，过滤；滤渣再用100mL水回流提取2小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，25％乙醇，80％乙醇冲洗；收集80％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.6％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比4：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌4.5小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到本发明的人参黄芪提取物；经HPLC检测本实施例制得的人参黄芪提取物含有黄芪甲苷22.956％、人参皂苷Rg1 2.085％、人参皂苷Re3.726％、人参皂苷Rb10.213％。

实施例7

将不同批次的人参和黄芪药材按照实施例1中的配比和方法进行提取，对提取物的中的黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量进行检测，并同时测定其总皂苷和总多糖的含量，检测结果见表2，总皂苷和总多糖的含量采用现有的常规方法检测。

表2

实施例8

一种组合物：由实施例2制备的人参提取物2mg和实施例3制备的黄芪提取物14.2mg混合得到。

实施例9

一种组合物：由实施例2制备的人参提取物2mg和实施例3制备的黄芪提取物17.0mg混合得到。

通过如下试验例证明本发明提取物的有益效果：

试验例1

1.主要试剂

端粒酶活性检测试剂盒(瑞士Roche公司)；

CCL137正常人成纤维细胞细胞系(American Type Culture Collection,ATCC)；

人参黄芪提取物：本发明实施例1制备得到的提取物；

黄芪提取物：本发明实施例3制备得到的黄芪提取物；

人参提取物：本发明实施例2制备得到的人参提取物。

2.方法

PCR-ELISA法检测不同提取物对端粒酶活性的影响

原理：本法是建立端粒重复扩增法(Telomeric Repeat AmplificationProtocol,TRAP)方法的基础上，它将端粒酶介导的衍生产物进行PCR扩增，并与后序的ELISA法结合在一起。

实验步骤：

(1)细胞提取物的制备

常规方法制成细胞悬液，然后于2-8℃下以3000g，离心10min形成细胞沉淀，小心移去上清液，并用PBS将细胞沉淀重悬后重复3000g，离心10min，小心吸去上清液后加入200uL裂解试剂后重悬细胞团，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30分钟，2-8℃，16000g离心，20min后，小心吸取上清液并移入新的EP管中，将提取物存放在-80℃。

(2)端粒酶重复序列扩增步骤(TRAP反应)

所有操作步骤均在冰上进行，事先准备好冰盒，对于每一组的待测样本，先将25uL反应复合物加入PCR扩增管中，加入2uL细胞提取物并加入无菌双蒸水补充至总体积为50uL，于PCR仪中进行引物的扩增及延伸，PCR反应条件：94℃灭活5min，94℃30s，55℃30s，共33个循环，72℃延伸10min，终止反应。

(3)ELISA测定

每个组的样品取20uL变性试剂加入EP管中标记，加入5uL经过PCR扩增后得到的产物，20℃孵育10min后，每个EP管加入225uL杂交缓冲液混匀，每个组取出100uL混合物加入微孔板中，以后置于37℃，300rpm的振荡器中孵育2h，后倒去全部杂交液，清洗3次后在每孔加入100uL抗-DIG-POD工作液，盖上盖子，置于20℃300rpm的摇床上孵育30min，去上清液，每孔加入250uL清洗液冲洗5次，每次1min，每孔加入100uLTMB第五溶液预热至室温，然后在300rpm的摇床上孵育12min，接着在每孔中加入100uL终止试剂以终止反应。紧接着用酶标仪在450nm处检测吸光度值并以A690nm为参照，将各组样本的吸收值减去阴性对照的值。如果吸收值的差异(△A)高于0.2(A450nm-A690nm)可认为端粒酶阳性。

试验结果采用SPSS18.0统计软件进行分析处理，统计采用方差分析，并用SNK法对各组数据进行两两比较，当P<0.05时认为差异有统计学意义。

待测样本(均是水溶液)：

低浓度组：

A1:人参黄芪提取物溶液，浓度为25ug/ml；

B1:黄芪提取物溶液，浓度为25ug/ml；

C1:人参提取物溶液，浓度为25ug/ml；

中浓度组：

A2:人参黄芪提取物溶液，浓度为50ug/ml；

B2:黄芪提取物溶液，浓度为50ug/ml；

C2:人参提取物溶液，浓度为50ug/ml；

高浓度组：

A3:人参黄芪提取物溶液，浓度为100ug/ml；

B3:黄芪提取物溶液，浓度为100ug/ml；

C3:人参提取物溶液，浓度为100ug/ml；

分别测试各组样本对正常人成纤维细胞端粒酶活性的影响，结果见表3：

表3本发明提取物对正常人成纤维细胞端粒酶活性的影响(x±s,n＝9)

*表示与对照组相比，P<0.05；

#表示与人参黄芪提取物溶液A相比，P<0.05

细胞的程序化衰老和外源性老化都有赖于端粒酶和端粒之间的有效调控。研究发现，端粒酶表达阴性的细胞其端粒的长度是缩短的，细胞衰老相关指标活性表达增强，而端粒酶表达阳性的细胞其端粒的长度是伸长的，细胞***增殖能力强，细胞衰老相关指标活性表达降低。正是由于端粒酶和端粒之间的有效调控控制着内源性老化和外源性老化的发生和发展，因此，本发明通过观察不同提取物对正常人成纤维细胞端粒长度酶活性的影响，借以考察其影响端粒长度的生理活性。

通过表3的测定结果可以看出，经高、中、低浓度组的自制人参黄芪提取物、黄芪提取物、人参提取物及黄芪甲苷处理的细胞，其端粒酶活性均高于对照组，说明所测样品均能提高细胞内端粒酶的活性，可延缓细胞老化的发生和发展，且随着浓度的增加，其端粒酶的活性提升得越多，差异具有统计学意义(P<0.05)。在相同浓度下，本发明人参黄芪提取物组的端粒酶活性增加明显大于其它提取物组。且浓度越大，端粒酶活性升高差异幅度越大，可充分说明本发明的人参黄芪提取物中的各组分发挥了协同增效作用，其效果显著优于单独使用人参提取物或黄芪提取物的效果。

试验例2

将本发明实施例1制备的人参黄芪提取物制成制剂进行9个月的试服活动(每日饭后服用制剂一粒(每粒含本发明人参黄芪提取物10mg)，每天2次)。每位参与者在服用前后均进行了全面的体检和端粒长度检测(为防止测定结果受到个人信息的影响，所有样品的信息均进行了盲处理)。试服人员共计45人(女23人，男22人。以试服前年龄计40～55岁25人，55～80岁20人)，试服前的体检及外周血取样日期为2016.12～2017.4月(具体日期为2016年12月16日，12月23日，12月29日，2017年1月3日，4月20日及4月24日)，试服结束后的体检及外周血取样日期为2017.12～2018年5月(具体日期为2017年12月8日，2018年1月26日，2018年3月12日，3月30日，4月13日及5月30日)。

提取试服者服用人参黄芪提取物前后外周血白细胞，委托LIFELENGTH公司进行端粒长度检测。其检测中主要指标有：20％短端粒平均长度，端粒长度中位数，平均端粒长度及相对应的生物学年龄，检测结果如下：

(1)对试服者服用人参黄芪提取物前后的20％短端粒平均长度数据进行分析：45例试服者中，38例试服者出现了不同程度的增长，占比84.44％；平均增长0.73Kb，增长率为15.61％；

(2)对试服者服用人参黄芪提取物前后的端粒长度中位数数据进行分析：45例试服者中，42例试服者出现了不同程度的增长，占比93.33％；平均增长0.86Kb，增长率为8.95％；

(3)对试服者服用人参黄芪提取物前后的平均端粒长度数据进行分析：45例试服者中，43例试服者出现了不同程度的增长，占比95.56％；平均增长0.63Kb，增长率为4.51％；

(4)对试服者服用人参黄芪提取物前后对应的生物学年龄数据进行分析：45例试服者中，41例试服者出现了相对应的生物学年龄减少，占比91.11％；平均减少4.34岁；其余4例中，有2例其生物学年龄的增长低于其实际年龄的增长。

从上述结果可以看出，本发明的人参黄芪提取物可增长服用者的端粒长度，减少其生物学年龄，有效地抗衰老，即使有2例服用者服用后生物学年龄没有较服用前减少，但其生物学年龄增长的幅度小于实际年龄增长的幅度，也可以说明本发明的人参黄芪提取物对他们起到了延缓衰老的作用。

再对试服者在试服前后的体检报告进行分析，根据体检报告中44名(第45号人员由于外周血白细胞提取失败，没有数据)试服人员服用本发明人参黄芪提取物的制剂前后体检的主要阳性结果，通过对服用制剂前后主要阳性结果的对比和统计，可以知道制剂有降低血管的收缩压(有效率85％)，降低血清甘油三酯(有效率73％)的作用，副作用(增加的阳性结果)暂不明显。

试验例3

探究不同的人参炮制品、西洋参以及市售的提取物复配后，对端粒酶活性的影响：

主要试剂：

端粒酶活性检测试剂盒(瑞士Roche公司)；

CCL137正常人成纤维细胞细胞系(American Type Culture Collection,ATCC)；

人参(生晒)黄芪提取物D(原药材用量：黄芪：生晒人参＝5：1)：自制；

人参(红参)黄芪提取物E(原药材用量：黄芪：红参＝5：1)：自制；

人参(活性参)黄芪提取物F(原药材用量：黄芪：活性参＝5：1)：自制；

西洋参黄芪提取物G(原药材用量：黄芪：西洋参＝5：1)：自制；

提取物H：市售黄芪提取物(提取比例25：1成都锦泰和生物科技有限公司):市售人参提取物(提取比例25：1山东唐正生物科技有限公司)＝8:1；

提取物J：市售黄芪提取物(提取比例20：1西安青芷生物技术有限公司):市售人参提取物(提取比例25：1吉林瑞隆药业有限责任公司)＝8:1；

提取物K：黄芪甲苷(规格98％)24.00％、人参皂苷Rg1(规格98％)2.50％、人参皂苷Re(规格98％)4.00％和人参皂苷Rb1(规格98％)0.25％，其余成分为玉米糊精；

黄芪甲苷(规格98％)，L：购买自成都锦泰和生物科技有限公司；

人参皂苷Rg1(规格98％)、人参皂苷Re(规格98％)和人参皂苷Rb1(规格98％)均购买自上海源叶生物科技有限公司；

所述自制的提取物均是通过如下方法制备：

称取10g药材粉末，加入100mL水浸泡3小时，之后升温至回流提取2小时，过滤；滤渣再用80mL水回流提取2小时，过滤，合并滤液，用大孔吸附树脂D101进行吸附，再分别用水，20％乙醇，70％乙醇冲洗；收集70％乙醇部分，移除乙醇后，加入药材粉末质量0.5％的复合酶(β-葡萄糖苷酶和木聚糖苷酶重量比3：1)，调节pH至5～6，在40～55℃下搅拌5小时，过滤。通过陶瓷纳滤膜进行膜过滤(截留分子量200～1000Da)，浓缩，喷雾干燥，得到相应的提取物。

对提取物D～F、H、J的进行液相色谱检测，检测其中各成分的含量，其中黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量如下：

表4

	提取物D	提取物E	提取物F	提取物H	提取物J
						黄芪甲苷(％)	25.372	24.965	26.598	1.236	1.069
人参皂苷Rg1(％)	2.328	2.268	3.012	0.365	0.289
						人参皂苷Re(％)	3.891	3.681	3.692	0.489	0.426
人参皂苷Rb1(％)	0.257	0.289	0.286	0.127	0.096

对端粒酶活性的影响检测试验方法步骤同试验例1，测得数据见表5。

表5不同提取物对正常人成纤维细胞端粒酶活性的影响(x±s,n＝9)

*表示与对照组相比，P<0.05

#表示与生晒人参黄芪提取物D相比，P<0.05

通过表5的测定结果可以看出，采用不同的人参炮制品，生晒参、红参、活性参和黄芪混合进行提取后得到的提取物D、E、F对正常人成纤维细胞端粒酶活性均有显著提高，效果与直接采用人参与黄芪复配的提取物相当。

将人参替换为西洋参与黄芪混合进行提取后，提取物可提高人成纤维细胞端粒酶活性，但与人参黄芪提取物相比效果相对较差。

将市售黄芪提取物和人参提取物按比例组合后得到的提取物，对人成纤维细胞端粒酶活性仅有轻微地提高作用，抗衰老活性较弱。

将成品黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1按本发明测定的提取物中含量的范围组合得到的提取物K，对正常人成纤维细胞端粒酶活性一定程度的提高作用，在高浓度下显著优于黄芪甲苷，效果较好。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。