阅读说明：本技术 一种高产乳酸链球菌素的发酵生产工艺 (Fermentation production process of high-yield nisin ) 是由 李珊 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高产乳酸链球菌素的发酵生产工艺,包括以下步骤：乳酸链球菌种液经一级种子培养、二级种子培养后转移到发酵培养基中进行发酵培养；然后通过补糖控制糖浓度,在菌浓增长到一定程度,乳酸链球菌素的合成启动后,在发酵培养基中添加一定量的氨基酸前体混合液,发酵22-26h。本发明确定了乳酸链球菌素发酵生产的培养基和培养方法,通过在补料过程中以一定的速率不断的补充能够促进细胞产素的氨基酸前体物质,明显提高了效价,乳酸链球菌素生物效价测定在16000IU/mL以上。有效解除了富氮作用带来的影响,减少了发酵液中杂蛋白和多肽、氨氮、磷等营养成分,有效降低了生产成本,适用于工业化生产。(The invention provides a fermentation production process of high-yield nisin, which comprises the following steps: after primary seed culture and secondary seed culture, the lactic streptococci liquid is transferred to a fermentation medium for fermentation culture; and then, the sugar concentration is controlled by sugar supplement, after the bacterial concentration is increased to a certain degree and the synthesis of nisin is started, a certain amount of amino acid precursor mixed liquor is added into a fermentation culture medium, and the fermentation is carried out for 22-26 h. The invention determines the culture medium and the culture method for the fermentation production of nisin, and can promote the amino acid precursor substance of cell production by continuous supplement at a certain speed in the feeding process, thereby obviously improving the potency, and the biological potency of nisin is measured to be more than 16000 IU/mL. Effectively removes the influence caused by the action of rich nitrogen, reduces the nutritional ingredients such as impure protein, polypeptide, ammonia nitrogen, phosphorus and the like in the fermentation liquor, effectively reduces the production cost, and is suitable for industrial production.)

一种高产乳酸链球菌素的发酵生产工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体的涉及一种高产乳酸链球菌素的发酵生产工艺。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸链球菌(Lactococcus lactis)发酵产生的多肽类物质，内含34个氨基酸。它能有效抑制***及其芽孢的繁殖，食用后被人体会很快消化吸收，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂，因而被广泛应用在乳制品、肉制品、罐头制品、果汁和酒精饮料等多种食品中。

氮源是影响Nisin发酵水平的重要因素。通常认为大豆蛋白胨、酵母粉、鱼粉、棉籽饼粉等为生产Nisin的的理想氮源。但上述原材料价格昂贵，势必会增加生产成本。

中国专利CN103805660A(申请号201210443722.5.)公开了一种利用廉价原料生产乳酸链球菌素的方法，采用廉价的豆粕或豆饼做氮源，结合pH控制和补料，发酵结束时效价达到5000IU/mL。中国专利CN107400688A(申请号201710425658.0)公开了一种利用食品工业废料生产乳酸链球菌素的方法，采用玉米浆、木糖醇渣和大豆蛋白倍提取后的豆渣制备基础发酵液，结合蔗糖和酵母进行分批发酵，发酵结束后效价达到4823IU/mL。

采用廉价原材料虽然能够节降成本，但原材料预处理费用增加，同时由于乳酸链球菌只利用氮源中的某几种成份，其它成份不被利用，这就造成了富氮现象，随着氮源含量增加，培养基中富氮现象越来越严重，生产菌利用氮源中有效成份的难度也越来越大，效价提升效果不明显，同时给污水处理造成很大困难，大大增加了生产成本，并不利于工业化生产。

乳酸链球菌素富含稀有氨基酸，这些稀有氨基酸是从半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸脱水而来，主要起组成基本结构和修饰作用。如果氮源中富含有这些氨基酸，它们就可以作为稀有氨基酸的前体而促进乳酸链球菌素的合成，为乳酸菌代谢产素提供必要的营养成分，同时大大降低生产过程中酵母粉等氮源的用量，减少发酵液滤液中的氨氮、磷等含量，缓解污水处理压力，并适用于工业化生产。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种能够提升效价，同时减少发酵液滤液中的氨氮、磷等含量，缓解污水处理压力，降低了生产成本的高产乳酸链球菌素的发酵生产工艺。

本发明采用的技术方案为：一种高产乳酸链球菌素的发酵生产工艺，包括以下步骤：乳酸链球菌种液经一级种子培养、二级种子培养后转移到发酵培养基中进行发酵培养；然后通过补糖控制糖浓度，在菌浓增长到一定程度，乳酸链球菌素的合成启动后，在发酵培养基中添加一定量的氨基酸前体混合液，发酵22-26h。

进一步地，所述一级种子培养的具体步骤为：将乳酸链球菌种液接种于一级种子罐中培养，接种量0.15-0.25％，料液稀释5倍于OD600nm下检测，当吸光值达到0.6以上，pH值6.0-6.5，培养时间8-12h，得到一级种子液；所述二级种子培养的具体步骤为：将上述一级种子液接种于二级种子罐中培养，接种量3-5％，料液稀释5倍于OD600nm下检测，当吸光值达到0.6以上，pH值6.0-6.5，培养时间4-8h时移种。

进一步地，所述发酵培养的具体步骤为：将培养好的二级种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，接种量5-8％，培养周期为22-26h，发酵结束，即得到乳酸链球菌素发酵液。

进一步地，所述一级种子罐和二级种子罐中的培养基成分按重量百分比为：葡萄糖0.5-1.0％，牛骨蛋白胨0.5-1.0％，酵母浸粉0.5-1.0％，KH₂PO₄0.3-0.7％，NaCl 0.1-0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.03％。

进一步地，所述发酵培养基的成分按重量百分比为：葡萄糖1.0-1.5％，酵母浸粉0.5-1.0％，KH₂PO₄0.1-0.3％，NaCl 0.1-0.3％，MgSO₄·7H₂O0.01-0.03％，玉米浆干粉0.2-0.8％，吐温-800.1-0.2％。

进一步地，所述氨基酸前体混合液成分按重量百分比为：丝氨酸0.01-0.03％、苏氨酸0.01-0.03％、半胱氨酸0.01-0.03％。

进一步地，所述一级种子培养和二级种子培养的条件均为：不通气，罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃培养。

进一步地，所述发酵培养的条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

进一步地，所述补糖控制糖浓度的具体步骤为：采用流加法进行补糖，其中：葡萄糖降至0.5％开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

进一步地，所述发酵过程中氨基酸前体混合液的添加方式为：在发酵6-10h后以0.2-0.5％发酵液体积的速率流加。

本发明获得的有益效果为：本发明确定了乳酸链球菌素发酵生产的培养基和培养方法，通过在补料过程中以一定的速率不断的补充能够促进细胞产素的氨基酸前体物质，明显提高了效价，乳酸链球菌素生物效价测定在16000IU/mL以上。有效解除了富氮作用带来的影响，减少了发酵液中杂蛋白和多肽、氨氮、磷等营养成分，加快了提取过滤速度，减轻了废水处理压力，有效降低了生产成本，适用于工业化生产。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：一级种子培养：培养基体积80L。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.5，牛骨蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.01，消后pH7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将120mL培养好的乳酸链球菌种子液接入一级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间8.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测吸光值达到0.618，pH值6.26，移种。

二级种子培养：培养基体积2T。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.5，牛骨蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.01，消后pH7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将80L培养好的一级种子液接入二级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间6.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，,吸光值达到0.61，pH值6.21，移种。

发酵培养：培养基体积40T。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，酵母浸粉0.5，KH₂PO₄0.1，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，玉米浆干粉0.2，吐温-800.1，消后pH6.87。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将2T培养好的二级种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

补料工艺控制：补糖：发酵培养至4h时，葡萄糖降至0.52％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

氨基酸前体混合液：发酵培养至6h，以0.2％发酵液体积的速率流加。发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为16388U/mL。

实例2

一级种子培养：培养基体积120L。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.75，牛骨蛋白胨0.75，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.5，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，消后pH6.99。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将240mL培养好的乳酸链球菌种子液接入一级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间9.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，吸光值达到0.619，pH值6.28，移种。

二级种子培养：培养基体积2.5T。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.75，牛骨蛋白胨0.75，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.5，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，消后pH6.98。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将120L培养好的一级种子液接入二级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间5.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，吸光值达到0.613，pH值6.21，移种。

发酵培养：培养基体积40T。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.25，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，玉米浆干粉0.5，吐温-800.15，消后pH6.86。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将2.5T培养好的二级种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

补料工艺控制：补糖：发酵培养至4.5h时，葡萄糖降至0.51％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

氨基酸前体混合液：发酵培养至8h，以0.3％发酵液体积的速率流加。发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为16852U/mL。

实例3

一级种子培养：培养基体积160L。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，牛骨蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，KH₂PO₄0.7，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，消后pH6.96。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将400mL培养好的乳酸链球菌种子液接入一级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间8.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，吸光值达到0.608，pH值6.25，移种。

二级种子培养：培养基体积3T。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，牛骨蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，KH₂PO₄0.7，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，消后pH7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将160L培养好的一级种子液接入二级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间4.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，,吸光值达到0.613，pH值6.20，移种。

发酵培养：培养基体积40T。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.5，酵母浸粉1.0，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，玉米浆干粉0.8，吐温-800.2，消后pH6.92。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将2.5T培养好的二级种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至3.5h时，葡萄糖降至0.53％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

氨基酸前体混合液：发酵培养至10h，以0.4％发酵液体积的速率流加。发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为16924U/mL。

对比实例1

一级种子培养：培养基体积80L。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.5，牛骨蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，消后pH7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将120mL培养好的乳酸链球菌种子液接入一级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间9h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测吸光值达到0.607，pH值6.19，移种。

二级种子培养：培养基体积2T。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.5，牛骨蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，消后pH6.98。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将80L培养好的一级种子液接入二级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间6h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，,吸光值达到0.615，pH值6.17，移种。

发酵培养：培养基体积40T。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.2，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，玉米浆干粉0.5，吐温-800.1，消后pH6.89。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将2T培养好的二级种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至4h时，葡萄糖降至0.55％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为12536U/mL。

对比实例2

一级种子培养：培养基体积120L。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.75，牛骨蛋白胨0.75，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.5，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，消后pH6.95。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将240mL培养好的乳酸链球菌种子液接入一级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间8h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，吸光值达到0.611，pH值6.31，移种。

二级种子培养：培养基体积2.5T。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.75，牛骨蛋白胨0.75，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.5，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，消后pH6.96。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将120L培养好的一级种子液接入二级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，吸光值达到0.613，pH值6.22，移种。

发酵培养：培养基体积40T。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.25，酵母浸粉0.75，KH₂PO₄0.2，NaCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.02，玉米浆干粉0.5，吐温-800.15，消后pH6.9。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将2.5T培养好的二级种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至4.5h时，葡萄糖降至0.51％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

1.5％玉米浆：发酵培养至8h，以0.3％发酵液体积的速率流加。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为13274U/mL。

对比实例3

一级种子培养：培养基体积160L。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，牛骨蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，KH₂PO₄0.7，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，消后pH7.01。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将400mL培养好的乳酸链球菌种子液接入一级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间8.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，吸光值达到0.624，pH值6.17，移种。

二级种子培养：培养基体积3T。

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，牛骨蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，KH₂PO₄0.7，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，消后pH7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将160L培养好的一级种子液接入二级种子罐中。关闭通气，维持罐压0.04±0.05Mpa，培养温度30±1℃。培养时间4.5h时，料液稀释5倍于OD600nm下检测，,吸光值达到0.627，pH值6.23，移种。

发酵培养：培养基体积40T。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.5，酵母浸粉1.0，KH₂PO₄0.3，NaCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.03，玉米浆干粉0.8，吐温-800.2，消后pH6.92。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将2.5T培养好的二级种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005Mpa，4h后泄压0Mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制pH值的变化范围为6.0-6.3。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至4h时，葡萄糖降至0.5％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

1.0％酵母浸粉和玉米浆混合液：发酵培养至8h，以0.4％发酵液体积的速率流加。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为13411U/mL。