阅读说明：本技术 一种利用缓冲液提高光合生物制氢pH值稳定性和产氢性能的方法 (Method for improving pH value stability and hydrogen production performance of photosynthetic organism hydrogen production by using buffer solution ) 是由 路朝阳 张全国 王锴鑫 郭思懿 王健 荆艳艳 王毅 张志萍 蒋丹萍 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于光合制氢技术领域,具体涉及一种利用缓冲液提高光合生物制氢pH值稳定性和产氢性能的方法,其将pH值5-9的Na<Sub>2</Sub>HOP<Sub>4</Sub>/NaH<Sub>2</Sub>OP<Sub>4</Sub>缓冲液与产氢培养基混匀,再加入玉米秸秆粉、纤维素酶混匀,然后加入对数期后期的HAU-M1光合菌群菌液混合均匀,密封后在厌氧状态下进行光合产氢。结果表明：产氢量随着缓冲液pH值的增大(5-9),呈现先上升后下降的趋势。当初始pH值为6时,获得了最大的产氢量132.69 mL/g,氢气浓度53.88%,能量转化率为9.84%。实验结果为光合生物制氢反应液的稳定性和高效产氢性能提供了技术支持。(The invention belongs to the technical field of photosynthetic hydrogen production, and particularly relates to a method for improving pH value stability and hydrogen production performance of photosynthetic biological hydrogen production by using buffer solution, wherein Na with the pH value of 5-9 is added 2 HOP 4 /NaH 2 OP 4 And (3) uniformly mixing the buffer solution and the hydrogen production culture medium, adding the corn straw powder and the cellulase, uniformly mixing, adding the HAU-M1 photosynthetic bacteria colony liquid at the later logarithmic phase, uniformly mixing, and carrying out photosynthetic hydrogen production in an anaerobic state after sealing. The results show that: the hydrogen production rate increases with the pH of the buffer (5-9), and then it increases and then decreases. When the initial pH was 6, the maximum hydrogen production of 132.69mL/g, a hydrogen concentration of 53.88%, and an energy conversion of 9.84% was obtained. The experimental result provides a technology for the stability and high-efficiency hydrogen production performance of the reaction solution for hydrogen production by photosynthetic organismsAnd (4) supporting.)

一种利用缓冲液提高光合生物制氢pH值稳定性和产氢性能的 方法

技术领域

本发明属于光合制氢技术领域，具体涉及一种利用缓冲液提高光合生物制氢pH值稳定性和产氢性能的方法。

背景技术

氢气是一种非常好的能量储存载体，它具有热值高、易燃烧、密度小等特点。目前世界上主要的氢气生产方式为电解水制氢，天然气重整制氢等手段，但是这些方式需要消耗大量的不可再生能源和大量的能量。生物制氢是一种比较理想的方式，它可以降解生物质、工业废水、厨余垃圾等，通过代谢生成氢气，这种方式可以在常温、常压、无污染的条件下进行，因此逐渐受到越来越多研究者的关注。

光合生物制氢具有很广泛的底物降解范围，并且具有较高的底物转化率。研究者们在底物、工艺优化、菌落选育、传热等方面给予了大量的研究。但是光合生物制氢存在pH值下降过快的问题，pH值的下降导致了细菌生长环境的破坏，细菌的死亡直接导致了产氢性能的低下。现有的制氢方法并不能解决光合生物制氢反应液pH值下降过快的问题，因此产氢量偏低。

在现有的被动糖化发酵中，柠檬酸缓冲液被应用在纤维素酶酶解秸秆的酶解过程中，这样可以保证酶解液的pH值保持在适宜于纤维素酶的最佳pH值(4.8)左右，酶解后调整pH值为7，然后进行光合产氢。酶解和产氢分开的被动糖化产氢方式会消耗大量的时间和外部能源，产氢量并不高。因此，亟待研究和开发新的光合产氢反应操作步骤简便、反应时间较短且产氢量高的方法。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用缓冲液提高光合生物制氢pH值稳定性和产氢性能的方法，其通过调整缓冲对成分来最大限度提高光合生物制氢缓冲效果以及产氢量，该方法操作步骤简便、光合产氢反应时间较短且产氢量高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用缓冲液提高光合生物制氢pH值稳定性和产氢性能的方法，其将pH值5-9的Na₂HOP₄/NaH₂OP₄缓冲液与产氢培养基混匀，再加入玉米秸秆粉、纤维素酶混匀，然后加入对数期后期的HAU-M1光合菌群菌液混合均匀，密封后在厌氧状态下进行光合产氢。

具体的，pH值5-9的Na₂HOP₄/NaH₂OP₄缓冲液体积为110-130mL，添加的玉米秸秆粉为5g。进一步的，Na₂HOP₄/NaH₂OP₄(磷酸氢钠-磷酸二氢钠)缓冲液优选pH值为6。

具体的，所述产氢培养基中各组分的浓度为：NH₄Cl 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L、NaCl2g/L、酵母膏0.1g/L、MgCl₂ 0.2g/L、谷氨酸钠3.56g/L。

具体的，添加的纤维素酶为液体酶制剂，添加体积为4-6mL，酶活51FPU/mL；添加对数期后期的HAU-M1光合菌群菌液体积为20-40mL。

具体的，所用的HAU-M1光合菌群由深红红螺菌、荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、荚膜红细菌组成；

所述的HAU-M1光合菌群菌液中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸个/mL。

具体的，光合产氢条件为：温度28-32℃，光照度为2800-3200Lux。进一步优选的，光照产氢条件为：温度30℃，光照度为3000Lux。

为了缩短光合反应的总体时间(酶解时间+产氢时间)，将光合生物制氢过程的反应液也保持在一定的范围，本课题组的前述研究中，将酶解糖化和产氢同时进行。在主动糖化光合生物制氢过程中也添加了缓冲液，首先将pH 4.8的柠檬酸缓冲液调整为7，然后添加光合细菌、秸秆、纤维素酶等。结果发现，主动糖化在整体时间上缩短了33.33％，产氢量由33.03mL/g提高到了46.61mL/g。这种主动糖化光合生物制氢的优越性在多个文献中得到了体现。现有文献中这种主动糖化光合生物制氢都是将用于纤维素酶酶解的柠檬酸钠缓冲液pH值由4.8调整到7，但是这样会很大幅度降低缓冲液的缓冲能力。因此本申请通过大量试验发现：调整缓冲液中的缓冲对成分比例，直接将缓冲液pH值调整为特定值5-9，这样可以最大限度地增加缓冲液对光合生物制反应液的缓冲能力，从而进一步提高产氢量。现有文献中关于通过调整缓冲对成分来最大限度提高光合生物制氢缓冲效果的研究还未见报道。

和现有技术相比，本发明方法的有益效果如下：

本发明以玉米秸秆为光合生物制氢底物，以调整缓冲对成分直接获得不同pH值(pH值5-9)的Na₂HOP₄/NaH₂OP₄缓冲液为缓冲液，研究了不同初始pH值的缓冲液对光合生物制氢的产氢影响，分析了光合生物制过程中氢气浓度、产氢速率、累计产氢量、还原糖浓度、pH值、可溶性代谢产物的变化，对其产氢动力学进行了计算。本申请同时研究了初始pH值对产氢液体特性和气体特性的影响，并对不同初始pH值对光合产氢影响进行了动力学特性研究。试验结果表明：产氢量随着缓冲液pH值的增大(5-9)，呈现先上升后下降的趋势。当初始pH值为6时，获得了最大的产氢量132.69mL/g，氢气浓度53.88％，能量转化率为9.84％，单因素方差分析结果表明不同初始pH值的缓冲液对反应液pH值和累计产氢量具有显著影响。不同初始pH值的Na₂HOP₄/NaH₂OP₄缓冲液对光合生物制氢具有显著的影响。本申请实验结果为光合生物制氢反应液的稳定性和高效产氢性能提供了技术支持。

附图说明

图1为缓冲液pH值对光合生物制氢的影响，图中，(a)氢气浓度，(b)产氢速率，(c)累计产氢量，(d)还原糖浓度，(e)pH值；

图2为缓冲液pH值对可溶性代谢产物的影响，图中，(a)pH＝5，(b)pH＝5.5，(c)pH＝6，(d)pH＝6.5，(e)pH＝7，(f)对照(Control group，缩写CG)；

图3为缓冲液pH值对能量转化率的影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例

1.材料与方法

1.1菌种

本发明中所用HAU-M1光合菌群是采用文献(韩滨旭.光合产氢菌群的分离鉴定及其产氢特性分析[D].河南农业大学，2011)中的方法获得的，其可以在光照条件下分解有机物进行产氢，该HAU-M1光合菌群主要由深红红螺菌(R.hodospirillum rubrum)、荚膜红假单胞菌(R.capsulata)、沼泽红假单胞菌(R.pulastris)、类球红细菌(R.hodobactersphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)组成。

本发明所述的HAU-M1光合菌群菌液中，深红红螺菌菌液、荚膜红假单胞菌菌液、沼泽红假单胞菌菌液、类球红细菌菌液与荚膜红细菌菌液的体积比分别为27：25：28：9：11；深红红螺菌菌液中活菌数为12.0×10⁸个/mL，荚膜红假单胞菌为11.0×10⁸个/mL，沼泽红假单胞菌为12.5×10⁸个/mL，类球红细菌为4.0×10⁸个/mL，荚膜红细菌为5.0×10⁸个/mL。

1.2培养基和缓冲液

上述HAU-M1光合菌群按照本领域常规方法活化培养获得对数期后期的HAU-M1光合菌群菌液，活化培养选用的生长培养基中各组分的浓度为：NH₄Cl 0.5g/L、K₂HPO₄ 0.1g/L、NaCl 1g/L、酵母膏0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、CH₃COONa 2g/L、NaHCO₃ 1g/L。详见下表1。

产氢培养基中各组分的浓度为：NH₄Cl 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L、NaCl 2g/L、酵母膏0.1g/L、MgCl₂ 0.2g/L、谷氨酸钠3.56g/L。配置过程中将各成分溶于水制成产氢培养基。详见下表1。

表1培养基以及缓冲液成分表

玉米秸秆粉为河南农业大学科教园区提供，纤维素、半纤维素、木质素含量分别为39.23％、31、34％、10.35％，TS和VS分别为96.14％和93.67％。

纤维素酶为丹麦诺维信(Novozymes Biotechnology Co.,Ltd)公司的纤维素酶Ctec2，其为液体酶制剂，酶活51FPU/mL，规格20mL。

光合生物制氢过程中采用的产氢培养基、缓冲液成分如上表1所示。缓冲液的pH值按照公式(1)进行配制。

pH＝pK_a2 ^θ-lg(NaH₂PO₄/Na₂HPO₄) (1)

1.3实验步骤

实验以180mL的三角瓶为制氢反应器，有效体积为150mL。在三角瓶中加入表1中不同pH值(5、5.5、6、6.5、7、对照)的缓冲液120mL，对照CG组由pH值4.8的缓冲液用NaOH调整为7后使用。按照表1中所示的组成添加产氢培养基，摇晃均匀；添加5g玉米秸秆粉，摇晃均匀；然后加入纤维素酶5mL，摇晃均匀；倒入对数期后期的HAU-M1光合菌群菌液30mL，摇晃均匀。使用橡胶塞封口，利用氮气吹扫5分钟，保持反应器厌氧状态。将反应器放置在恒温箱中，设置温度为30℃，光照度为3000Lux进行光合产氢，产氢量每12h取样一次。

1.4实验测量

氢气浓度使用气相色谱(6820GC-14B，美国安捷伦公司)测量，挥发性脂肪酸VFAs使用气相分析仪(7890B，美国安捷伦公司)进行测定，pH值采用酸度计(PHS-3E pH，上海佑科仪器仪表有限公司)测量，还原糖浓度使用721分光光度计采用水杨酸法(DNS)进行测定，光照度采用照度计(1010A，深圳市胜利高电子科技有限公司)进行测量。

1.5实验分析

Gompertz方程用来分析产氢动力学。

其中，H表示累计产氢量(mL)，P表示最大潜在产氢量(mL)，R_m表示最大的产氢速率(mL/h)，λ表示延滞期(h)，t代表时间(h)，e是自然常数2.718。P,R_m和λ由1stOpt15PRO软件进行计算求得。平均产氢速率用来衡量光合生物制氢整体产氢速率。

其中，V为反应器的工作体积，P为最大潜力产氢量(mL)，R_m表示最大的产氢速率(mL/h)，λ表示延滞期(h)。

单因素方差分析用来分析缓冲液不同pH值对光合生物制氢影响的显著性。

使用方程(4)来计算光合生物制氢的能源转化率。

E是能源转化率(％)，是累计产氢量(mL)，是氢气热值(12.86J/mL)，Q_CS是秸秆热值(17340.50J/g)，m是玉米秸秆粉干重(g)。

2.结果与分析

2.1缓冲液对光合生物制氢的影响

图1给出了缓冲液pH值对光合生物制氢的影响。通过图1a可以发现，随着产氢的进行，氢气浓度逐渐增大，在36-60h为最佳产氢高峰期，pH＝6时在48h时获得最大氢气浓度53.88％，高于对照组的52.06％，随后氢气浓度迅速下降。氢气浓度的变化是由产氢微生物的代谢方式引起的，通过乙酸和丁酸代谢产氢途径获得的氢气浓度分别为66.67％和50％，乙醇型代谢途径只生成CO₂，丙酸型代谢产物则会消耗氢气，光合细菌利用乙酸和丁酸进行产氢时候氢气浓度分别为66.67％和71.43％。在产氢高峰期主要为乙酸和丁酸的生成及消耗等代谢。光合细菌HAU-M1的光合制氢是一个复杂的生化代谢活动，从图2中的代谢成分也得到了印证。

方程5-7分别为乙酸、丙酸、丁酸型代谢产氢方式，方程8为乙醇型代谢途径，方9和10为光合细菌利用乙酸和丁酸进行光合产氢。

C₆H₁₂O₆+2H₂O→2C₂H₄O₂+2CO₂+4H₂ (5)

C₆H₁₂O₆+2H₂→2C₃H₆O₂+2H₂O (6)

C₆H₁₂O₆→C₄H₈O₂+2CO₂+2H₂ (7)

C₆H₁₂O₆→C₂H₆O+2CO₂ (8)

C₂H₄O₂+2H₂O→4H₂+2CO₂ (9)

C₄H₈O₂+6H₂O→10H₂+4CO₂ (10)

在图1b中可以看出，产氢速率随着时间呈现正态分布趋势，产氢速率在接种后的一段时间，因为光合细菌需要适应反应液环境，所以产氢速率比较低，而在产氢后期，反应液中抑制物的增多，导致反应液中的环境不适合光合细菌生长。在48h，不同初始pH值条件下均获得了最大的产氢速率，只是随着初始pH值的增大，最大产氢速率先增大后减小，在pH为6时获得了最大产氢速率26.04mL/h。

在图1c中，可以看到累计产氢量随着时间的增长，在36-48h内，呈现爆发式增长，这种产氢现象和光合细菌的对数式生长模式具有一致性，光合细菌的爆发式增长促进了光合细菌爆发时产氢的增长。累计产氢量的变化体现了初始pH值对纤维素酶和光合细菌的综合作用，因为纤维素酶和光合细菌的最佳pH值分别为4.8和7。因此随着初始pH值从5增大到7，累计产氢量呈现先增大后减小的趋势。在初始pH值为6时，获得了纤维素酶和光合细菌两者的平衡。实验中对照组(101.73mL/g)的累计产氢量小于初始pH值为6的实验组(132.69mL/g)，这是因为对照组为文献中的纤维素缓冲液(pH 4.8)使用NaOH调制为7，其缓冲效果没有直接使用离子对将缓冲液调整为特定值的缓冲效果好。光合生物制氢反应液中稳定的缓冲液系统为光合生物制氢的高效进行提供了良好的保障。

在图1d中，随着产氢的进行，还原糖浓度呈现先迅速增大后快速降低的趋势，这是因为在0-12h内，光合细菌正在适应新的反应液环境，还没有开始利用反应液中的糖类进行产氢，在12h后，光合细菌开始进入产氢阶段，糖浓度开始下降。在24-36h光合细菌进入产氢稳定期，这时纤维素生成糖的速度和光合细菌利用糖的速度达到平衡。从图中可以看出，pH值越接近于4.8，还原糖浓度越大，这也证实了本发明实验值设计的合理性。

在图1e中，除了pH＝5实验组外，其他实验组在0-24h内，pH值快速下降，这是因为光合细菌将糖快速降解为挥发性脂肪酸导致的。实验组的pH值下降速度小于对照组，这是因为对照组的pH值是由适用于纤维素酶的pH值(4.8)使用NaOH调制而成，而实验组中的缓冲液是由Na₂HOP₄/NaH₂OP₄调配而成。当时初始pH值大于6.0时，48h后，pH值开始缓慢回升，这是此时光合细菌开始利用反应液中的挥发性脂肪酸进行产氢，挥发性脂肪酸浓度的降低导致了pH值的回升。当初始pH值小于6时，pH值呈现连续下降趋势，这是因为pH值过低会导致反应液中产氢细菌活性降低，甚至导致光合细菌死亡。

表2方差分析

表2反应了缓冲液不同初始pH值对光合生物制氢过程中氢气浓度、产氢速率、累计产氢量、pH值、还原糖浓度影响的显著性。可以看出反应液pH值的P值(9.46E-12)远小于0，F值(23.14)远大于F crit值(2.41)，表明初始pH值对反应液的影响最为显著，从图1e中的变化曲线也得到了证实。随后缓冲液pH值对参数的影响从到小依次为累计产氢量、还原糖浓度、产氢速率，初pH值对氢气浓度的影响最小(P 0.92)。

2.2缓冲液对光合生物制氢挥发性脂肪酸的影响

图2展示了缓冲液的不同初始pH值对反应液中可溶性代谢产物变化的影响，可溶性代谢产物反映了光合生物制氢代谢产物的变化。可以看出，光合生物制氢的主要可溶性代谢产物主要是乙酸和丁酸，还有少量的丙酸和乙醇。从方程(5)和方程(7)可以看出，当代谢产物为乙酸和丁酸时，具有较高的产氢效果，而方程(6)和方程(8)可以看出，当代谢产物为丙酸和乙醇时，会消耗大量的糖，但是不会生成氢气，并且乙醇会对光合细菌的生长存在严重的危害。在12-24h内，具有较高的挥发性脂肪酸总量，此时大量形成的挥发性脂肪酸还没有被光合细菌转化为氢气。随着光合生物制氢的稳定进行，在36-60h内，反应液中可溶性代谢产物总量比较稳定，这说明光合细菌生成挥发性脂肪酸和消耗挥发性脂肪酸的速率基本相等。

2.3缓冲液对光合生物制氢动力学参数的影响

表3动力学参数

pH	P<sub>max</sub>(mL)	R<sub>m</sub>(mL/h)	λ(h)	R<sup>2</sup>	R<sub>overall</sub>(mL/h)	产氢量(mL/g)
							5	204.50	5.78	22.79	0.9965	2.12	40.63
5.5	394.02	17.92	29.48	0.9975	4.11	78.85
							6	673.22	23.17	24.83	0.9910	6.91	132.69
6.5	530.83	28.05	30.66	0.9968	5.54	106.30
							7	340.28	15.41	31.39	0.9980	3.51	67.33
对照	506.79	26.37	31.15	0.9990	5.30	101.73

产氢动力学参数是模拟计算产氢过程行为，将产氢过程进行数字化，从而使研究者更好地了解产氢性能。从表3中可以看出，最大累计产氢量(P_max)随着pH值的增长先增大后减小，当pH值为6时达到最大值673.22mL，动力学计算参数和实际数值具有很高的吻合性(实际累计产氢量663.45mL)。最大产氢速率(R_m)也是随着pH值的增大而先增大后减小，这表明了pH值对光合细菌在单位时间内最大产氢能力有很大的影响，这种影响和pH值对累计产氢量的影响差不多。从延迟时间(λ)来看，当pH值为5时，获得了最小的产氢延迟时间，可能是因为pH值为5时，纤维素酶具有最佳的活性，从而使纤维素快速转化为糖，被光合细菌用来产氢。其次为pH值为6时，光合细菌和纤维素酶均具有较好的活性，很快进行产氢活动。相关系数(R²)均大于0.99，非常接近于1，表明产氢动力学参数能够很好地描述光合产氢过程。整体产氢速率(R_overall)反映了整个产氢过程的产氢性能，由累计产氢量和产氢时间相比所得，整体产氢速率随着pH值的增大而先增大后下降，反映了缓冲液pH值对纤维素酶和光合细菌综合作用的效果。从产氢量可知，缓冲液pH值对光合细菌产氢也具有明显的规律性，在pH值为6时，获得最大的产氢量132.69mL/g。

2.4缓冲液对光合生物制氢能源转化率的影响

图3展示了不同pH值对光合生物制氢底物转化率的影响。由图3可以看出：随着pH值的增加，能源转化率呈现先增大后减小的趋势，表明缓冲液的pH值对能量转化率有显著影响，这是由pH值对光合细菌和纤维素酶的共同作用引起的。在pH值为6时达到了最大能源转化率9.84％。这个数值是大于刘会亮等人论文(Optimization of photo fermentationin corn stalk through phosphate additive)中的4.14％，张志萍等人论文(Potentialuse and the energy conversion efflciency analysis of fermentation effluentsfrom photo and dark fermentative biohydrogen production)中的5.1％。

3.结论

本申请研究了不同初始pH值的Na₂HOP₄/NaH₂OP₄缓冲液对光合生物制氢的影响，当pH值为6时，pH值对纤维素酶和光合细菌的综合作用达到了最佳平衡，此时达到了最佳产氢性能，最大产氢量为132.69mL/g，氢气浓度53.88％，能量转化率为9.84％。单因素方差分析表明初始pH值对反应液pH值和累计产氢量具有较大影响。本申请实验结果为提高光合生物制氢反应液的稳定性和产氢性能提供了技术支持。