发酵乳制品及其使用磷酸酶的制备
阅读说明：本技术 发酵乳制品及其使用磷酸酶的制备 (Fermented milk product and preparation thereof using phosphatase ) 是由 T·迪特科 刘婉梅 S·鲁斯特尔 于 2019-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于乳制品技术领域。本发明涉及生产发酵乳制品的方法,其特征在于在发酵过程中使用至少一种磷脂酶处理乳基质。本发明还提供了由其生产的发酵乳制品和含有起子培养物和磷脂酶的试剂盒。(The invention belongs to the technical field of dairy products. The present invention relates to a method for producing a fermented dairy product, characterized in that a milk substrate is treated with at least one phospholipase in a fermentation process. The invention also provides a fermented dairy product produced therefrom and a kit containing a starter culture and a phospholipase.)
技术领域
本发明总体上涉及生产发酵乳制品的方法。
背景技术
乳制品，例如发酵乳制品，是本领域已知的。质地是发酵乳制品的非常重要的质量参数。许多消费者期望具有良好口感和凝胶硬度的平稳一致性。
添加蛋白质，通常是脱脂乳粉或乳清基蛋白质，是改善发酵乳制品质地的标准程序。经常使用增稠剂或其他调质剂，如改性淀粉、玉米淀粉、果胶、明胶或琼脂。然而，添加蛋白质或调质剂可能是昂贵的。因此，有利的是，提供可以减少或消除此类试剂添加的生产发酵乳制品的方法。这是可取的，因为市场对具有“清洁标签”(即不添加稳定剂或调质剂)的发酵乳制品的需求不断增加。
均质化是使发酵乳制品具有良好质地的另一种常见程序。它在发酵之前进行，以将乳脂分解成较小的尺寸。在此过程中产生的较小的脂肪小球可以很容易地悬浮在溶液中，因此它不作为与乳分开的层存在。均质化可以例如通过在高压下迫使乳通过精细过滤器或节流阀来完成，从而形成粒径减小的乳液。根据产品的不同，通常在乳制品行业中使用的均质化压力约为150-250巴(bar)。但是，均质化是昂贵的，因为它需要消耗大量的能量。因此，有利的是，提供减少均质化的需求，从而降低制造商的运营成本的方法。
已经尝试解决该问题。其中的许多尝试都与提供可以产生更好质地的乳酸菌新菌株有关。例如，WO2007/095958A1(Chr.Hansen)描述了使用某些产生细胞外多糖的起子培养物来改善发酵乳制品的质地。在本领域中，始终需要改善发酵乳制品的感官特性，特别是制品的口感和口腔包覆(mouth coating)。
发明内容
本发明部分地基于令人惊讶的发现，即磷脂酶对发酵乳制品的感官品质具有积极影响。通过在制备过程中使用磷脂酶，可以减少或甚至消除蛋白质、调质剂或稳定剂在发酵乳制品中的使用。还可以降低制造过程中所需的均质化成本。
本发明提供了磷脂酶在制备发酵乳制品的方法中的新用途。发酵乳制品，例如酸奶，可以由已在脂肪和蛋白质含量方面标准化、均质化和热处理的乳基质来生产。之后，将乳用起子培养物接种并发酵。
已经观察到磷脂酶可以积极地参与乳酸菌的发酵过程，从而导致最终发酵制品的粘度增加。因此，本发明提供了生产发酵乳制品的方法，其中使含有磷脂酶的乳基质发酵。
本申请提供的方法包括将起子培养物添加到乳基质中，使乳基质发酵一段时间，直到达到目标pH，其中将至少一种磷脂酶添加到乳基质中。可以在发酵之前，在发酵开始时，或在发酵过程中添加磷脂酶。优选地，在发酵之前或在发酵开始时添加磷脂酶。达到目标pH后，可以获得发酵乳制品。
本申请提供了生产发酵乳制品的方法，包括以下步骤：
a)将包含至少一种乳酸菌菌株的起子培养物添加到乳基质中，
b)使乳基质发酵一段时间，直到达到目标pH；以及
c)在发酵期之前，在发酵期开始时或在发酵期期间，向乳基质中添加至少一种磷脂酶
可以用于本申请的磷脂酶包括磷脂酶A，例如磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)和磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，以及磷脂酶B(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(EC 3.1.4.3)和磷脂酶D(EC3.1.4.4)。
本申请包括通过本文所述方法获得的发酵乳制品。在另一方面，本发明提供了包含磷脂酶的发酵乳制品。
在另一方面，本发明提供了用于制备发酵乳制品的试剂盒，其包含起子培养物和至少一种磷脂酶。
通过结合附图阅读以下描述，本发明的其他特征和优点会变得显而易见。
附图说明
图1描绘了实施例1中制备的发酵乳制品的滞后曲线，其显示了随剪切速率变化的剪切应力。
图2描绘了在实施例2中制备的发酵乳制品中对响应变量(粘度为601/s)的因子影响。
图3描绘了在实施例2中制备的发酵乳制品中对响应变量(粘度为3001/s)的因子影响。
图4描绘了实施例3中制备的发酵乳制品的滞后曲线，其显示了随剪切速率变化的剪切应力。
具体实施方式
本发明涉及通过用选定的微生物使乳发酵生产的发酵乳制品。发酵乳可以通过发酵中使用的具体起子培养物来表征。例如，使用嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)的共生培养物，作为酸奶的起子培养物，而嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)用于制备酸乳。其他嗜温乳酸菌用于生产夸克(quark)或清爽干酪(fromagefrais)。
为了制备本申请的制品，首先提供乳基质作为起始材料。在本申请中广泛使用“乳基质”来表示基于可以用作供起子培养物生长和发酵的培养基的乳或乳成分的组合物。“乳”通常是指通过对诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼等任何哺乳动物挤奶获得的乳状分泌物。可以从任何未加工的和/或加工的乳材料以及复原乳粉获得乳基质。乳基质也可以是基于植物的，即由植物材料例如豆浆制备。
有用的乳基质包括但不限于任何乳或包含蛋白质的乳状产品的溶液/悬浮液，例如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、乳粉(dried milk)。
在本发明的方法和制品中，优选由奶牛的乳或乳成分制备的乳基质。
根据消费者的需求，还可以减少乳基质的乳糖。乳糖减少的乳可以根据本领域已知的任何方法来生产，包括通过乳糖酶将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，或者通过纳滤、电渗析、离子交换色谱和离心。
巴氏灭菌
优选在发酵之前，根据本领域已知的方法对乳基质进行巴氏灭菌。本文所用的“巴氏灭菌”是指处理乳基质，以减少或消除例如微生物等活生物的存在。优选，通过将指定温度保持指定的时间段来实现巴氏灭菌。通常通过加热来达到指定的温度。本领域普通技术人员能够选择杀死或灭活某些微生物的温度和持续时间。随后可以进行快速冷却步骤。
均质化
“均质化”是指将混合物均质化以从不混溶的组分中获得均匀的液体组合物的过程。均质化过程将乳脂分解为较小的尺寸的颗粒，因此其不再与乳分离。这可以通过迫使乳在高压下通过小孔来实现。均质化通常在巴氏灭菌之后或与其同时应用于乳制品行业。如在以下描述中会变得显而易见的，本发明提供了减少均质化的需要的方法。因此，在一些实施方案中，在比通常所需的压力低的压力下使乳基质均质化，以及在其他实施方案中，未使乳基质均质化。
发酵
为了使乳基质发酵，添加了起子培养物。本文所用的术语“起子”或“起子培养物”是指负责使乳基酸化的一种或多种食品级微生物的培养物，特别是乳酸菌的培养物。起子培养物可以是新鲜的、冷冻的或冻干的。确定要使用的起子培养物和量是普通从业人员的能力。
“发酵”通常是指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。在本发明中，本发明方法中的发酵是指乳糖转化为乳酸。
起子培养物
根据本发明，起子培养物包含至少一种乳酸菌菌株。乳酸菌广泛地用于生产发酵食品，其用途在本领域中是众所周知的。在本申请的上下文中，术语“乳酸菌”或“LAB”用于表示产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的食品级细菌。这些细菌因其共同的代谢和生理特性而相互关联，通常为革兰氏阳性、低GC、耐酸、无孢子、无呼吸的、杆状的杆菌或球菌。在发酵阶段，这些细菌消耗乳糖导致乳酸的形成，从而降低pH并导致蛋白质凝块的形成。
可用于本发明的起子培养物可以具有乳酸菌的任何常规起子培养物的菌株组成，包括单一菌株培养物或培养物共混物，这取决于发酵乳制品的具体类型。除起子培养物之外，在发酵中还可以包括其他有用的细菌，包括益生菌双歧杆菌属种(Bifidobacteriumspp)。
在一个实施方案中，起子培养物包含产生嗜热发酵乳制品的嗜热细菌。术语“嗜热发酵乳制品”是指通过嗜热起子培养物的嗜热发酵而制备的发酵乳制品，实例包括诸如以下的发酵乳制品，例如凝固酸奶(set-yogurt)、搅拌酸奶和饮用酸奶，例如养乐多(Yakult)。在工业上，最有用的嗜热细菌(“嗜热生物(thermophiles)”)包括链球菌(Streptococcus spp)和乳杆菌属种(Lactobacillus spp)。术语“嗜热发酵”在本文中是指在高于约35℃，例如约35℃至约45℃之间的温度下发酵。“嗜热生物”通常是在35℃以上的温度下生长得最好的微生物。
在另一个实施方案中，起子培养物包含产生嗜温发酵乳制品的嗜温细菌。术语“嗜温发酵乳制品”是指通过嗜温起子培养物的嗜温发酵制备的发酵乳制品，实例包括诸如以下的发酵乳制品，例如酪乳、酸味乳、培养乳(cultured milk)，斯美塔那(smetana)、酸奶油、克非尔(Kefir)和新鲜干酪，例如夸克、特瓦罗格(tvarog)和奶油干酪。有用的嗜温细菌(“嗜温生物”)包括乳球菌属种(Lactococcus spp)和明串珠菌属种(Leuconostoc spp)。本文中的术语“嗜温发酵”是指在约22℃至约37℃的温度下发酵。术语“嗜温生物”通常是指在中等温度(15℃-35℃)下生长得最好的微生物。
可用于制造发酵乳制品的乳酸菌包括但不限于属于乳杆菌属种(Lactobacillusspp.)、双歧杆菌属种(Bifidobacterium spp.)、链球菌属种(Streptococcus spp.)、乳球菌属种(Lactococcus spp.)的细菌，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，以及明串珠菌属种。起子培养物中菌株的具体选择应当取决于要制造的发酵乳制品的具体类型。
在优选的实施方案中，起子培养物包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株。
在优选的实施方案中，乳酸菌选自由来自乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属和明串珠菌属的细菌组成的组。
在本发明的具体实施方案中，发酵乳制品是使用一种或多种选自由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组的乳酸菌菌株获得的产品。
发酵方法
在添加起子培养物并使乳基质经历合适的条件之后，开始进行发酵方法，并持续一段时间。本领域普通技术人员知道如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧气、碳水化合物的添加、微生物的数量和特征以及所花费的工艺时间。此方法可能需要三个小时、四个小时、五个小时、六个小时或更长时间。
这些条件包括设定适合于具体起子培养物菌株的温度。例如，当起子培养物包含嗜温乳酸菌时，温度可以设定为约30℃，并且如果培养物包含嗜热乳酸菌菌株，则温度保持在约35℃至50℃的范围内，例如40℃至45℃。发酵温度的设定还取决于添加到发酵中的酶，酶可以由本领域普通技术人员容易地确定。在本发明的具体实施方案中，发酵温度为35℃至45℃，优选37℃至43℃，并且更优选40℃至43℃。
可以使用本领域已知的任何方法终止发酵。通常，取决于工艺的各种参数，可以通过使乳基质不适合起子培养物的菌株生长来终止发酵。例如，当达到目标pH时，可以通过快速冷却发酵乳制品进行终止。已知在发酵期间发生酸化，这导致形成由酪蛋白簇和链组成的三维网络。术语“目标pH”是指发酵步骤结束时的pH。目标pH取决于要获得的发酵乳制品，并且可以由本领域普通技术人员容易地确定。
在本发明的具体实施方案中，进行发酵直至达到pH 5.0，包括直至达到pH 4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8或3.7。优选地，进行发酵，直到达到4.0至5.0之间的目标pH，更优选地达到4.0至4.6之间的目标pH。在优选的实施方案中，进行发酵，直到达到低于4.6的目标pH。
磷脂酶
乳包含磷脂。磷脂由于其非极性亲脂特性而与乳脂结合。磷脂，例如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由在外部(sn-1)和中间(sn-2)位置被两个脂肪酸酯化和在第三位置被磷酸酯化的甘油组成。磷酸进而可以被酯化为氨基醇。磷脂可以被磷脂酶水解成溶血磷脂，而溶血磷脂进而可以被溶血磷脂酶水解。
磷脂酶是通常在活生物体中，尤其在磷脂的代谢和生物合成中起关键作用的基本酶。这些酶参与磷脂的水解，可以区分几种类型的磷脂酶活性。磷脂酶A可以进一步分为磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)或A2(EC3.1.1.4.)，它们水解一个脂肪酰基(分别在sn-1和sn-2位置)形成溶血磷脂。磷脂酶B(EC 3.1.1.5)水解溶血磷脂中剩余的脂肪酰基。其他磷脂酶是磷脂酶C(EC 3.1.4.3)和磷脂酶D(EC 3.1.4.4)。本发明的方法所用的磷脂酶可以是任何磷脂酶或磷脂酶的任何组合。
在优选的实施方案中，可用于本申请的磷脂酶是磷脂酶A。更优选，磷脂酶是磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)和/或磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)。在其他实施方案中，磷脂酶是磷脂酶B(EC 3.1.1.5)或C(EC 3.1.4.3)。
磷脂酶A1根据标准酶EC分类定义为EC 3.1.1.32。
正式名称：磷脂酶A1
催化的反应：磷脂酰胆碱+水<＝>2-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子
注释：具有比EC 3.1.1.4更广泛的特异性。
磷脂酶A2根据标准酶EC分类定义为EC 3.1.1.4。
正式名称：磷脂酶A2。
替代名称：磷脂酰胆碱2-酰基水解酶、卵磷脂酶a、磷脂酶(phosphatidase)或磷脂酶(phosphatidolipase)。
催化的反应：磷脂酰胆碱+水<＝>异酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子
注释：还可作用于磷脂酰乙醇胺、胆碱缩醛磷脂和磷脂，从而除去附着在2位上的脂肪酸。
磷脂酶可以是任何来源的，如来自动物(例如哺乳动物)，例如来自胰腺(例如牛或猪的胰腺)或蛇毒或蜂毒。或者，磷脂酶可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，来自例如以下属或种：曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(A.niger)；网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、高大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如无根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，例如大豆核盘菌(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)，例如红色发癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如，维氏核盘菌(W.sclerotiorum)；芽孢杆菌属(Bacillus)，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华菌属(Edwardsiella)，迟缓爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，例如变形杆菌(P.vulgaris)；普罗维登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如福氏志贺菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。磷脂酶可以是真菌的，例如来自核菌纲(Pyrenomycetes)，例如镰孢菌属(Fusarium)，例如黄色镰孢菌(F.culmorum)、异孢镰孢菌(F.heterosporum)、腐皮镰孢菌(F.solani)、镶片镰孢菌(F.venenatum)的菌株，或尖孢镰孢菌(F.oxysporum)的菌株。磷脂酶也可以来自曲霉属(Aspergillus)内的丝状真菌菌株，例如泡盛曲霉(A.awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(A.oryzae)的菌株。优选的磷脂酶衍生自镰孢菌属的菌株，特别是衍生自镶片镰孢菌或尖孢镰孢菌，例如衍生自WO 98/26057中所述，特别是WO 98/26057的权利要求36所述的菌株DSM 2672。在其他实施方案中，磷脂酶是WO 00/32758(Novozymes A/S,Denmark)中公开的磷脂酶。另一优选的磷脂酶A是来自链霉菌属的磷脂酶A2，例如来自紫红链霉菌的PLA2。
磷脂酶是可商购的。在米曲霉中表达的来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)/尖孢镰菌的磷脂酶A1可以商标Ultra(Novozymes A/S,丹麦)获得。另一种优选的磷脂酶A1可以商标或
特别优选的磷脂酶是来自镰孢菌属种的磷脂酶A1。
磷脂酶A2可以以不同的商标名称发现。例如用于植物油脱胶而开发的动物(猪胰腺)来源的磷脂酶A2可以10L(Novozymes A/S,丹麦)获得。
在优选的实施方案中，磷脂酶是
在一些实施方案中，本发明的方法所用的磷脂酶衍生自或可获得自本文提及的任何来源。术语“衍生”在本文中是指磷脂酶可能已经从天然存在的生物中分离出来，即该酶氨基酸序列的特性与天然酶相同。术语“衍生”还表示酶可能已经在宿主生物中重组产生，该重组产生的酶具有与天然酶相同的特性或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个缺失、***和/或取代的氨基酸，即是天然氨基酸序列的突变体和/或片段的重组产生的酶。天然酶的含义包括天然变体。此外，术语“衍生”包括通过例如肽合成以合成方式产生的酶。术语“衍生”还包括已经例如通过糖基化磷酸化等在体内或体外修饰的酶。在本文中，术语“可获得的”是指该酶具有与天然酶相同的氨基酸序列。该术语包括已经从天然存在的生物中分离出的酶，或者已经在相同类型的生物或另一类型生物中重组表达的酶，或者是例如通过肽合成以合成方式产生的酶。对于重组产生的酶，术语“可获得的”和“衍生”是指酶的特征，而不是重组产生酶的宿主生的特征。
因此，可以使用任何合适的技术从微生物中获得磷脂酶。例如，可以通过合适的微生物发酵，随后通过本领域已知的方法从所得发酵液或微生物中分离磷脂酶来获得磷脂酶制剂。磷脂酶也可以通过使用重组DNA技术获得。这样的方法通常包括培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，所述重组DNA载体包含编码所述磷脂酶的DNA序列，并且所述DNA序列与适当的表达信号可操作地连接，从而所述宿主细胞能够在培养基中在允许磷脂酶表达的条件下表达酶，并从培养物中回收酶。也可以将该DNA序列并入宿主细胞的基因组中。DNA序列可以是基因组来源、cDNA来源或合成来源或其组合，并且可以根据本领域已知的方法分离或合成。可以纯化这样的磷脂酶。本文所用术语“纯化”涵盖不含衍生它的微生物的成分的磷脂酶。术语“纯化的”还涵盖不含来自天然生物的成分的磷脂酶，磷脂酶是由所述天然生物获得的，这也称为“基本上纯的”磷脂酶，并可能与天然存在且未例如通过缺失、取代或***一个或多个氨基酸残基而遗传修饰的磷脂酶特别相关。纯化可通过例如过滤、沉淀或色谱法进行。
本申请中使用的磷脂酶可以是任何合适的形式，例如干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定的液体或受保护的酶的形式。颗粒可以例如按照美国专利第4,106,991号和美国专利第4,661,452号所公开的内容来产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包被。液体酶制剂可以例如通过根据建立的方法加入稳定剂例如糖、糖醇或另一种多元醇、乳酸或另一种有机酸来稳定。受保护的酶可以根据欧洲专利第238,216号公开的方法制备。
可以将磷脂酶的活性测定为脂肪酸中和期间氢氧化钠消耗的速率。相对于卵磷脂酶(磷脂酶)标准，可以以卵磷脂酶单位(LEU)表达这种活性。该方法是本领域已知的。例如，可以使用卵磷脂作为底物相对于磷脂酶标准品测量磷脂酶A1活性。磷脂酶A1催化卵磷脂水解为溶血卵磷脂和游离脂肪酸。在标准条件下(pH＝8.0；40°±0.5)，用0.1N的氢氧化钠滴定释放的脂肪酸。1LEU定义为，在标准条件下(pH＝8.0；40°±0.5)导致与稀释为1LEU标称活性的卵磷脂酶标准品相同的氢氧化钠消耗速率(以microeq/min为单位)的酶量。该方法可以使用用来进行滴定实验的自动化系统或标准实验室设备来进行。
磷脂酶的添加
可以在发酵之前，在发酵开始时，或在发酵期间，将磷脂酶添加到乳基质中。表述“在发酵开始时”是指，在将起子培养物添加到乳基质中之前不久、同时或之后不久。在此，术语“不久”是指小于30分钟。表述“在发酵期间”是指发酵开始后和发酵结束前的发酵期间的任何时间。
在本发明的一个实施方案中，在发酵步骤之前将磷脂酶添加到乳基质中。在本发明的另一个实施方案中，在发酵步骤开始时将磷脂酶添加到乳基质中。在本发明的另一个实施方案中，在发酵期间将磷脂酶添加到发酵乳中。发酵步骤可以通过冷却处理来终止。
要添加到乳基质中的磷脂酶的量取决于许多参数，包括磷脂酶活性和乳基质的组成，例如脂肪含量等。这种量可以通过常规实验来确定。
技术人员可以使用本领域已知的用于优化酶促反应的方法来确定进行磷脂酶处理的合适条件。考虑到所需的发酵乳制品的特性，技术人员将知道如何调节诸如pH、温度和磷脂酶的量等参数，以获得所需的结果。待用于本发明方法中的磷脂酶的量可以取决于在具体处理条件下具体磷脂酶对存在的磷脂的活性。例如，当如实施例中所示使用磷脂酶A时，所添加的磷脂酶的量可以为每克脂肪0.1-50LEU，例如在0.5-25LEU，或每克脂肪1-10LEU。
发酵乳制品
术语“发酵乳制品”是通常根据相关官方规定定义的术语，并且该标准在本领域中是众所周知的。表述“发酵乳制品”是指食品或饲料产品，其中食品或饲料产品的制备涉及用乳酸菌使乳基质发酵。本文所用的“发酵乳制品”包括但不限于诸如嗜热发酵乳制品(例如酸奶)和嗜温发酵乳制品(例如酸奶油和酪乳，以及发酵乳清、夸克和清爽干酪)等产品。与干酪制品相比，发酵乳制品在发酵结束时通常具有较低的目标pH。
更特别是，本文公开的方法可以用于获得嗜热发酵乳制品，例如酸奶，特别是凝固酸奶，和嗜温发酵乳，例如夸克。
在本发明的一个实施方案中，发酵乳制品是酸奶产品。术语“酸奶”具有其通常的含义，并且通常根据相关的官方规定来定义，并且该标准在本领域中是众所周知的。酸奶产品可以选自由“搅拌型产品”、“凝固型产品”或“可饮用产品”组成的组。
“搅拌型产品”是在发酵后保持机械处理的发酵乳制品。机械处理通常但并非唯一地通过搅拌、泵送、过滤或均化凝胶，或将其与其他成分混合来获得。“凝固型产品”是基于接种了起子培养物，例如一种起子培养物，并包装，然后在包装中发酵的乳的产品。术语“可饮用产品”包括饮料，例如“饮用酸奶”、“稀释的饮用酸奶”或类似产品，其可以是通过乳杆菌属种和嗜热链球菌的组合发酵生产的乳制品。
在优选的实施方案中，发酵乳制品选自夸克、奶油干酪、清爽干酪、希腊酸奶、大豆酸奶、冰岛酸奶(skyr)、浓缩酸奶(labneh)、酪乳、酸奶油、酸味乳(sour milk)、培养乳、克非尔、拉西酸奶奶昔(lassi)、咸酸奶(ayran)、特瓦罗格(twarog)、薄荷酸奶(doogh)、斯美塔那、养乐多和达喜(dahi)。更优选，发酵乳制品是酸味乳、培养乳、克非尔、拉西酸奶奶昔、咸酸奶、薄荷酸奶、养乐多或达喜。
蛋白质含量
通过本文公开的方法生产的发酵乳制品含有的蛋白质含量为0.5重量％至10重量％。发酵乳制品也可以是蛋白质含量为1重量％至4.0重量％的低蛋白质产品。或者，发酵乳制品可以是蛋白质含量高于3.5重量％的高蛋白质产品。
在本发明的具体实施方案中，乳基质的特征在于蛋白质含量(w/w)小于0.5％，小于0.7％，小于0.9％，小于1.0％，小于1.3％，小于1.5％，小于2.0％，小于2.5％，小于3.0％，小于3.5％，小于4.0％，小于4.5％，小于5.0％，小于5.5％，小于6.0％，小于6.5％，小于7.0％，小于7.5％，小于8.0％，小于8.5％，小于9.0％，小于9.5％，小于10.0％，小于10.5％，小于11.0％，小于11.5％，小于12.0％，小于12.5％，小于13.0％，小于13.5％，小于14.0％,小于14.5％或小于15.0％。
脂肪含量
本申请的发明人已经发现磷脂酶对发酵乳制品质地的积极影响。已经观察到，当乳基质的脂肪含量较高时，影响更大，从而使得其特别适用于发酵脂肪含量较高的产品。
在本发明的具体实施方案中，乳基质的特征在于脂肪含量(w/w)为至少0.5％，例如至少0.6％，至少0.7％，至少0.8％，至少0.9％，至少1.0％，至少1.1％，至少1.3％，至少1.5％，至少2.0％，至少2.5％，至少3.0％，至少3.5％，至少4.0％，至少4.5％，至少5.0％，至少5.5％，至少6.0％，至少6.5％，至少7.0％，至少7.5％，至少8.0％，至少8.5％，至少9.0％，至少9.5％，至少10.0％，至少10.5％，至少11.0％，至少11.5％，至少12.0％，至少12.5％，至少13.0％，至少13.5％，至少14.0％，至少14.5％，或至少15.0％。在一些实施方案中，脂肪含量为至少16.0％，至少17.0％，至少18.0％，至少19.0％，至少20.0％，至少21.0％，至少22.0％，至少23.0％，至少24.0％，至少25.0％，至少26.0％，至少27.0％，至少28.0％，至少29.0％，至少30.0％，至少35.0％，至少40.0％，至少45.0％，至少50.0％，或更高。乳基质中脂肪含量的调节是本领域技术人员已知的，例如通过向乳基质中添加奶油。
在优选的实施方案中，乳基质的特征在于脂肪含量为0.5％至10.0％(w/w)，优选为1.0％至9.0％，优选为3.0％至7.0％，优选为4.0％至6.0％，更优选4.5％至5.5％。已经发现，当脂肪含量较高，磷脂酶对质地的影响较高。
均质化
按照本发明的教导，可以提供降低或甚至消除了此类产品通常所需的均质化水平的发酵乳制品，从而降低制造商的运营成本。因此，在一个实施方案中，用于制备此类产品的乳基质未被均质化。然而，在一些优选的实施方案中，取决于发酵乳制品的类型，仍可以使乳基质均质化。均质化水平优选低于250巴(bar)，包括小于240巴，小于220巴，小于200巴，小于190巴，小于180巴，小于170巴，小于160巴，小于150巴，小于140巴，小于130巴，小于120巴，小于110巴，小于100巴，小于90巴，小于80巴,小于70巴，小于60巴，小于50巴。在本申请的上下文中，如果在多个阶段进行均质化，则均质化水平是指在所有阶段中施加的总压力。例如，如果在两个阶段进行均质化分，首先在120巴下进行，然后是在60巴下进行，则乳基质的均质化水平为180巴。
凝乳酶
本申请的发明人还发现，进一步添加凝乳酶(EC 3.4.23.4)可以有利地改善发酵乳制品的质地。凝乳酶是属于广泛的肽酶类的天冬氨酸蛋白酶，通常在干酪生产中用作乳凝固酶。
牛凝乳酶，尤其是小牛凝乳酶，既可以作为胃酶提取物(凝乳酶；包含天然产生的凝乳酶)也可以作为重组产生的凝乳酶(通常在细菌、酵母或真菌宿主细胞中表达)(见例如WO95/29999)商业获得。WO2002036752、WO2013174840和WO2015/128417已经描述了其他非牛凝乳酶，例如单峰驼(Camelus dromedarius)凝乳酶或其变体。优选的凝乳酶包括商业可得的凝乳酶，例如M以及Plus(Chr.HansenA/S丹麦)。
在优选的实施方案中，该方法另外包括在发酵期之前，在发酵期开始时或在发酵期期间将凝乳酶添加到乳基质中的步骤。要添加到乳基质中的凝乳酶的量取决于许多参数，包括凝乳酶活性、乳基质的组成，例如蛋白质含量，例如酪蛋白含量等。本领域技术人员可以根据本领域已知的用于优化酶促反应的方法选择合适条件。用于测定凝乳酶活性的测定法是本领域已知的。凝乳酶活性可以根据标准化方法来测量，并以每克国际乳凝固单位(IMCU/g)表示。
在一个优选的实施方案中，用于生产发酵乳制品的方法包括，将具有至少一种乳酸菌菌株的起子培养物添加到乳基质中，使乳基质发酵一段时间，直到达到目标pH，其中在发酵期开始时，将磷脂酶和凝乳酶同时或一个接一个地添加到乳基质中。
在一个优选的实施方案中，用于生产嗜热发酵乳制品的方法包括，将具有至少一种乳酸菌菌株的起子培养物添加到乳基质中，使乳基质发酵一段时间，直至达到目标pH，其中在发酵期之前，将磷脂酶和凝乳酶分别添加到乳基质中。
在又一个优选的实施方案中，用于生产酸奶产品的方法包括，将具有至少一种乳酸菌菌株的起子培养物添加到乳基质中，使乳基质发酵一段时间，直至达到目标pH，其中在发酵期期间，将磷脂酶和凝乳酶同时添加到乳基质中。
贮藏
优选将发酵乳制品贮藏至少两天，例如至少3天，至少4天，更优选至少5天，至少6天，至少7天，至少8天，至少9天，至少10天，至少11天，至少12天，至少13天和至少14天。在新鲜乳制品行业中，产品在生产后通常会在3-5天内到达消费者手中，通常不迟于7天。
本文中所用术语“贮藏”或“贮藏的”是指在适当条件下保持产品，直到将其分发给消费者，进行消费为止。这样的条件在工业上是已知的，并且可以由熟练的从业者确定。
试剂盒
在另一方面，本发明提供了包含起子培养物和一种或多种磷脂酶的试剂盒。起子培养物包含一种或多种用于生产本申请提及的发酵乳制品的乳酸菌。试剂盒所含的乳酸细菌可以例如包括乳杆菌属种和乳球菌属种。它们可以是用于批量起子繁殖的冷冻或冻干培养物的形式，或作为旨在直接接种到发酵容器或桶中以生产发酵乳制品的所谓“直投式”(Direct Vat Set,DVS)培养物。试剂盒所包括的磷脂酶可以是磷脂酶A、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B或磷脂酶C或其组合。试剂盒还可以包含一种或多种凝乳酶。
发酵乳制品的质地
本发明还提供了磷脂酶用于改善发酵乳制品质地的新用途。可以使用本领域众所周知的方法就流变性质对质地进行表征，包括测量产品的“剪切应力(粘度)”或“凝胶硬度”。剪切应力和凝胶硬度的SI单位是帕斯卡(Pa)。本发明人已经观察到，凝胶硬度和粘度均可得以改善。
在具体实施方案中，该用途使得在贮藏7天后，在13℃下以60 1/s的剪切速率测量的发酵乳制品例如酸奶的粘度增加。
术语“剪切应力”决定粘度。粘度(单位为Pas)定义为“剪切应力”(Pa)/剪切速率(1/s)。可以在不同点报告剪切应力值。感官实验已经表明，当以60 1/s的剪切速率(与口中的第一印象良好地相关)和300 1/s的剪切速率(与吞咽困难相关的黏着性)测量粘度时，流变测量值与感官之间具有最佳的相关性。
发酵乳制品的“凝胶硬度”可以通过所谓的频率扫描来测量，该频率扫描测量随振荡频率变化的凝胶的复数模量(G*)。在1.52Hz处的G*值可以用作产品的“凝胶硬度”。可以通过所谓的恒定速率测量来测量产品的粘度，测量随剪切速率变化的产品的剪切应力。
在60 1/s或300 1/s的剪切速率下测量时，与对照产品相比，该产品是以相同方式但不使用磷脂酶生产的发酵乳制品，根据本发明的教导生产的发酵乳制品可以实现粘度或凝胶硬度的增加。
在一个实施方案中，当以60 1/s(Pa)作为剪切应力测量时，使用磷脂酶在发酵乳制品中产生的粘度比不使用磷脂酶的产品所产生的粘度高至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约50％。
在另一个实施方案中，当以300 1/s(Pa)作为剪切应力测量时，使用磷脂酶在发酵乳制品中产生的粘度比不使用磷脂酶的产品所产生的粘度高至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％。
在另一个实施方案中，使用磷脂酶在发酵乳制品中产生的凝胶硬度(在1.52Hz下的G*)比不使用磷脂酶的产品所产生的凝胶硬度高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)术语“a(一个/种)”和“an(一个/种)”和“所述(the)”以及类似的指示语的使用，应解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(即，表示“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的所有精确值都代表相应的近似值(例如，针对具体因子或测量值而提供的所有精确的示例性值可以视为也提供了在适当情况下用“约”修饰的相应的近似测量值)。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。不应将说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
实施例
本文描述和要求保护的本发明的范围不受本文公开的具体方面的限制，因为这些方面旨在作为本发明的几个方面的说明。任何等同方面都意图落入本发明的范围内。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述和以下实施例，本发明的各种修改对于本领域技术人员会变得显而易见。这样的修改也意图落入所附权利要求的范围内。若有冲突，以本公开(包括定义)为准。
实施例1
制备了含有1.5％或5.0％脂肪的酸奶产品。在第7天和第30天，评估磷脂酶对流变性质的影响。
乳基质的制备：
脱脂乳粉和全脂乳粉(Fonterra Co-operative Group Limited，新西兰)用于制备以下实施例的乳基质。
表1.乳基质的组成(w/w)
样品
脱脂乳粉
全脂乳粉
水
1
8.60％
5.30％
86.10％
2
8.60％
5.30％
86.10％
3
8.10％
9.00％
82.90％
4
8.10％
9.00％
82.90％
使用Silverson混合器在45℃–50℃下将该成分与水混合。水合时间为20分钟。在两个阶段(第一阶段150巴，第二阶段50巴；总计200巴)中，用GEA Lab均质器使乳基质均质化，并在85℃下巴氏灭菌30分钟，然后冷却。
起子培养物：
起子培养物由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成。
磷脂酶：
在发酵开始时加入磷脂酶A1(来自丹麦Chr.Hansen A/S的PL；对于5％的脂肪，平均活性2600LEU/ml，剂量为0.021650％)。使用MilkoScan分析测定脂肪含量和蛋白质含量。
发酵：
在43℃下发酵4小时50分钟，达到最终pH 4.55±0.05。发酵产品通过后处理至23℃–25℃的板式热交换器冷却，并在冷却器出口处用背压阀在1巴的压力下进行平滑处理。
将样品贮藏在冷的室温(5℃–7℃)下。
表2.组成和发酵详情
样品
蛋白质含量
脂肪含量
磷脂酶
最终pH
发酵时间
1
4.00％
1.50％
--
4.51
4小时50分钟
2
4.00％
1.50％
0.00345％
4.49
4小时50分钟
3
4.00％
5.00％
--
4.51
4小时50分钟
4
4.00％
5.00％
0.01265％
4.49
4小时50分钟
测试在第7天和第30天贮藏的样品的粘度和凝胶硬度。
剪切应力和凝胶硬度的测量：
在流变仪(Anton Paar Modular Compact Rheometer MCR 302,Anton
选择60 1/s和300 1/s下的剪切应力进行分析，因为这与口中的质地(口感，第一印象)和黏着性(吞下发酵乳制品时)相关。
在流变仪(Anton Paar Modular Compact Rheometer MCR 302,Anton
结果如下所示，滞后曲线如图1所示。
表3.第7天时样品的流变学评估
表4.第30天时样品的流变学评估
如表3和表4所示，与对照样品相比(样品1和3)，用磷脂酶处理的样品(样品2和4)在60 1/s(口感，第一印象)和300 1/s(黏着性)下的粘度显示改善。在脂肪含量较高的样品(样品4)中效果更强。
实施例2
1.实验设置
在16个试验中，选择了部分析因设计(factorial-fractional design)来检查以下5个因子。目的是在更大的设计中证实磷脂酶对质地的影响，并检查显著性、与均质化压力水平的相互作用、与凝乳酶的相互作用以及与起子培养物的相互作用。
表5实验设置：因子因子是正交编码的：
因子
-1
+1
1-均质化压力
150巴
300巴
2-起子培养物
1
2
3-蛋白质含量
2.50％
4.50％
4-凝乳酶
无
是
5-磷脂酶
无
是
表6.实验设置：设计
表7.混杂结构(Aliasing Structure)
1
2345
2
1345
3
1245
4
1235
12
345
13
245
14
235
23
145
24
135
34
125
123
45
124
35
134
25
234
15
1234
5
关于三阶相互作用(5＝1234)，研究了第五因子。因此，考虑到二阶相互作用具有很小或为零的高概率，可以非常准确地估计所有一阶相互作用。
2.程序
用不同的参数制备含5.0％脂肪的酸奶产品。
乳基质的制备：
使用脱脂乳粉和乳脂粉(Fonterra Co-operative Group Limited,新西兰)制备以下乳基质。
表8.乳基质1的组成(蛋白质＝2.50％，脂肪＝5.00％)
成分
量(％)
脱脂乳粉
3.39
乳脂粉
9.07
水
87.54
表9.乳基质2的组成(蛋白质＝4.50％，脂肪＝5.00％)
成分
量(％)
脱脂乳粉
9.68
乳脂粉
8.98
水
81.34
将脱脂乳粉、乳脂粉和水用Silverson混合器在8℃–10℃下混合至少2个小时。用GEA Lab均器质将乳基质均质化。根据设置，在150巴(第一阶段120巴，第二阶段30巴)或300巴(第一阶段240巴，第二阶段60巴)下进行均质化。然后将均质的乳基质在85℃下巴氏灭菌30分钟并冷却。
制备和发酵：
根据设置，在发酵开始时与起子培养物一起添加磷脂酶和/或凝乳酶。
起子培养物：
使用来自实施例1的起子培养物(起子培养物1，1级)。为了比较，包括具有不同发酵动力学的第二起子培养物(起子培养物2，+1级)。两种起子培养物均由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成。
磷脂酶和凝乳酶：
磷脂酶A1(来自丹麦Chr.Hansen A/S的
牛凝乳酶(来自丹麦Chr.Hansen A/S的Plus；对于2％酪蛋白，平均活性200IMCU/ml，剂量0.00026％)使用MilkoScan分析测定脂肪和蛋白质含量。
表10.样品1-16的组成和发酵详情
在43℃下进行发酵，直到pH达到4.55±0.05。记录发酵时间。发酵制品通过后处理至23℃–25℃的板式换热器进行冷却，并在冷却器出口处用背压阀在1巴的压力下进行平滑处理。
将样品贮藏于冷的室温(5℃–7℃)下。
如实施例1那样测试在第7天贮藏的样品的粘度和凝胶硬度。
表11.第7天时样品的流变学评估
使用逐步回归分析和多线性模型分析流变响应，该模型包括主要作用和一级相互作用：
响应＝cste+a.F1+b.F2+c.F3+d.F4+e.F5+f.F1.F2+g F1.F3…
消除了所有具有错误高于5％(P值>0.05)的风险的影响。
在60 1/s下的粘度
模型概述:
该模型解释超过98％的实验变化。
系数
图2绘出了不同因子的影响。
300 1/s下的粘度
模型概述:
该模型可解释超过98％的实验变化。
系数：
图3绘出了不同因子的影响。
第7天时的凝胶硬度(G*)
模型概述:
该模型解释了超过99％的实验变化。
系数：
正如上文所证明的，证实在两个粘度点测量的磷脂酶对质地的影响具有很高的显著性(p值＝0.012和0.019)，表明其对口感和黏着性的积极作用。在较低的均质化水平下，磷脂酶的作用较高(显著的负相互作用，p值＝0.036)。在150巴的均质化水平下，最大粘度增益为+145mPas。没有观察到与培养物的相互作用。不管发酵动力学如何，磷脂酶似乎都同样起作用。磷脂酶和凝乳酶之间没有负相互作用，表明它们的组合效果是纯加和的，并且最大增益可以达到+457mPas。这证实添加凝乳酶可以进一步改善质地。
对于凝胶硬度响应，可以引出类似的强效果和相同的结论。
实施例3
制备了含有2.03％脂肪和4.05％蛋白质的大豆酸奶。在第7天评估磷脂酶对流变性质的影响。
表12.用于制备大豆酸奶的组合物(w/w)
成分
规格
量(％)
中国大豆粉
Redman
22.50
糖
KSL,精制糖
5.00
水
自来水,PUB
72.50
表13.实施例3的样品
制备和发酵：
根据设置，在发酵期之前，在发酵期开始时，或在发酵期期间添加磷脂酶。
实施例3中使用的方法如下。将表12所示的组合物用Silverson混合器混合。混合温度/水合时间为45℃-50℃/20min。均质化使用GEA Lab均质器进行，预热为65-70℃，第一阶段的压力为150巴，第二阶段的压力为50巴，总计为200巴。用Scandinox水浴进行该过程，巴氏灭菌条件为85℃/30min，冷却温度小于10℃。发酵在scandinox Waterbath中进行，温度为43℃，最终pH为4.55±0.05。
大豆酸奶的后处理如下：使用中试处理单元(pilot treatment unit,PTU)，背压为1.0巴，冷却温度为23℃–25℃。
从实施例3获得的样品的流变学研究按如下进行。使用Anton Paar ModularCompact流变仪MCR 302进行流变学研究。测量温度为13℃，所用的程序为Stirred swing+Up_DownFlow。
表14.发酵详情
配方
S1
S2
最终pH
4.60
4.58
发酵时间
9小时10分钟
9小时10分钟
[email protected]+7
4.52
4.53
表15.D+7天的保质期后每个样品的振荡和滞后曲线
-Vis pt 1：在0.271s-1下的粘度(mpa.s)(初始状态，用匙舀取酸奶时的阻力)
-Vis pt 5：在60s-1下的粘度(与口中的质地良好地相关)
--Vis pt 21：在300s-1下的粘度(黏着性(吞咽难度)/口稠度)
-滞后面积：与抗剪切有关
-振荡G*@1.52Hz：与凝胶硬度相关
如对于大豆酸奶的上述内容所证明的，添加磷脂酶(
大豆酸奶的感官评估表明，与S1相比，S2的质地更厚，更光滑细腻(creamier)，涩味更少。因此，添加磷脂酶(
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