阅读说明：本技术 一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法 (Liquid milk preparation method based on reduction of cow milk sensitization ) 是由 郑艳 梁肖娜 孙敬 杨慧 程娇 杨梅 曹雪妍 王宗洲 武俊瑞 岳喜庆 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法,包括以下步骤：(1)脱脂；(2)预热；(3)酶解：预热后,取脱脂牛乳,以点滴滴加方式依次添加上述三种蛋白酶溶液于脱脂乳中,并进行酶解；酶解时间为60-120 min,温度50-60℃,分时段调节pH,获得酶解液；(4)灭酶。所述低致敏性液体乳中分子量小于5000道尔顿的小肽约占99%。所述降低牛乳致敏性的液体乳制备方法用于降低牛乳中多个致敏原蛋白的致敏性,所述牛乳致敏原蛋白包括酪蛋白,αs<Sub>1</Sub>-酪蛋白,αs<Sub>2</Sub>-酪蛋白,β-酪蛋白,k-酪蛋白,α-乳白蛋白,β-乳球蛋白,免疫球蛋白,乳铁结合蛋白中的一种或几种。(The invention relates to a liquid milk preparation method based on cow milk allergenicity reduction, which comprises the following steps of (1) degreasing, (2) preheating, (3) enzymolysis, namely preheating, taking the skim milk, sequentially adding the three protease solutions into the skim milk in a dropping and dripping mode, and carrying out enzymolysis, wherein the enzymolysis time is 60-120 min, the temperature is 50-60 ℃, the pH is adjusted in different periods, an enzymolysis solution is obtained, and (4) enzyme is inactivated, small peptides with the molecular weight less than 5000 daltons in the hypoallergenic liquid milk account for about 99% 1 Casein, α s 2 -one or more of casein, β -casein, k-casein, α -lactalbumin, β -lactoglobulin, immunoglobulin, lactoferrin.)

一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法

技术领域

本发明涉及乳制品加工技术领域，具体涉及到一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法。

背景技术

近年来食物过敏已成为人们日益关注的食品安全和公共卫生关键问题之一，牛乳是引起食物过敏的八种食品之一。大量的研究表明，婴幼儿牛乳过敏率为2~6%，成人约占0.1~0.5%。牛乳中含有致敏蛋白高达30多种，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白因含量较高表位众多，且致敏性较强，被认为是牛乳中主要致敏原。此外，牛乳中αs₁-酪蛋白、αs₂-酪蛋白、β-酪蛋白、k-酪蛋白、免疫球蛋白，牛血清白蛋白和乳铁结合蛋白等，近年来也成为了降低或消除乳蛋白致敏性的热点。

目前，牛乳脱敏方法主要有高压、热处理以及酶降解等。其中，酶解法因工艺简单，操作性强，而受到广泛关注。酶法是一种较为常用的蛋白改性方法，可以破除或降低牛乳致敏蛋白的致敏表位，也可以通过断裂一些化学键来破坏致敏原表位的一级结构，从而降低牛乳致敏性。为了消除或降低牛乳蛋白的致敏性Penas等人采用酶解与髙静压相结合处理乳清蛋白溶液，研究其对降低β-LG的致敏性的影响，确定了降低β-LG致敏性最好的两种酶及其相应条件。浙江大学冯凤琴等人通过碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶复合处理使β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的抗原性均下降90%以上；浙江工业大学孙培龙等人将乳清蛋白酶解产物用于大鼠被动皮肤过敏试验，发现能显著降低大鼠蓝斑。

目前，国内外对于牛乳致敏性的研究，仅仅局限于针对牛乳中某一种单一致敏蛋白，而对牛乳整个体系的致敏性研究及低致敏性牛乳制品的开发尚处于起步阶段，因此本发明提供了一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法。

发明内容

为了弥补上上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法，利用酶法降低或消除牛乳中致敏原蛋白，从而达到同时降低多种牛乳致敏蛋白的致敏性，制备出低敏性液体乳。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

（1）脱脂

将新鲜牛乳在12000 r/min下高速离心20-30min，获得脱脂牛乳；

所述新鲜牛乳指标如下：蛋白质含量：2.8-3.5%；脂肪含量：3.0-5.0%；乳糖含量：4.0-5.6%；矿物质含量：0.5-0.7%；

（2）预热

将木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶各用蒸馏水稀释成浓度为1.0 g/mL的蛋白酶溶液；将脱脂牛乳和蛋白酶溶液分别置于50-60℃水浴内预热20 min；

所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为食品级原料；

（3）酶解

预热后，取脱脂牛乳，以点滴滴加方式依次添加上述三种蛋白酶溶液于脱脂乳中，获得脱脂乳和蛋白酶混合液、并进行酶解；酶解时持续均匀搅拌，搅拌速率为600 r/min，酶解时间为60-120 min，温度50-60℃，分时段调节pH，获得酶解液；

所述三种蛋白酶按照木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的顺序添加；

所述三种蛋白酶溶液的添加量分别按照三种蛋白酶的酶活力与底物蛋白质来添加，E/S比例按照2000:1~10000:1（E：酶活；S：蛋白质）；

所述分时段调节pH按照下述步骤：

a.将质量百分浓度为10%的柠檬酸水溶液添加入脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节脱脂乳和蛋白酶混合液pH值至6.0-7.0，酶解30-60min；

b.将质量百分浓度为18%碳酸氢钠水溶液加入上述脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节脱脂乳和蛋白酶混合液pH值至7.0-8.0，酶解30-60min；

（4）灭酶

酶解反应结束后将上述酶解液水浴灭酶10-15min，水浴温度为90~100℃，灭酶后将酶解液冷却至室温，再于5000 r/min高速离心10min-20min后分离沉淀，分离所得的上清液即为低致敏性液体乳。

进一步的，所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶溶液的添加量分别按照三种蛋白酶的酶活力与底物蛋白质来添加，E/S比例按照6000:1（E：酶活；S：蛋白质）,pH 6.0-7.0酶解40min，pH 7.0-8.0酶解40min，共酶解80min。

进一步的，所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶溶液的添加量分别按照三种蛋白酶的酶活力与底物蛋白质来添加，E/S比例按照10000:1（E：酶活；S：蛋白质）,pH6.0-7.0酶解40min，pH 7.0-8.0酶解40min，共酶解80min。

进一步的，所述低致敏性液体乳中分子量小于5000道尔顿的小肽约占99%。

本发明还提出了一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法的用途，其技术要点是：用于同时降低牛乳中多个致敏原蛋白的致敏性，所述牛乳致敏原蛋白包括酪蛋白，αs₁-酪蛋白，αs₂-酪蛋白，β-酪蛋白，k-酪蛋白，α-乳白蛋白，β-乳球蛋白，免疫球蛋白，乳铁结合蛋白中的一种或几种。

本发明的有益效果为：

（1）以天然脱脂牛乳为载体，保证其原有特性（自然pH、风味等），温和条件下酶法降低或破除牛乳中致敏乳蛋白，以达到降低其抗原性和致敏性目的；本发明操作简单易于控制，并且安全经济；制得的牛乳产品致敏性低、营养价值高，并且能够满足牛乳过敏患者的消费要求，且将具有良好的推广和应用前景。

（2）与传统牛乳制品相比较，本方法中分子量小于5000道尔顿的小肽约占99%，这可以促进肠道的消化吸收，且吸收率较高，不刺激肠胃等，可以满足人体对营养素的基本需求。

（3）与传统牛乳制品相比较，本方法中牛乳致敏蛋白被酶解成小肽和氨基酸，这些小肽和氨基酸不仅有利于人体消化和吸收，且具有较低的致敏性，同时具有增强人体免疫，促进机体生长，降低血压和胆固醇等生物学功能。

（4）与低致敏性牛乳奶粉相比较，本方法的低致敏性液体乳不仅能够满足婴幼儿的生长需求，而且可以满足除婴幼儿以外的且具有牛乳过敏病史的各类消费人群的营养需求，提高其生物学利用率，改善肠胃环境，刺激免疫反应和提高婴幼儿等免疫力。

（5）与低致敏性牛乳蛋白相比较，本方法的低致敏性液体乳，弥补了前人仅局限于针对某单一蛋白的致敏性研究，而以整个牛乳为研究体系，在保持牛乳风味前提下，降低或消除牛乳中致敏原蛋白，这就为牛乳制品的进一步研发开辟了新路径和提供了新思路。

具体实施方式

实施例1一种基于降低牛乳致敏性的液体乳制备方法，包括以下步骤：

（1）脱脂

将新鲜牛乳在12000 r/min下高速离心20-30min至完全脱脂，获得脱脂牛乳；

所述新鲜牛乳指标如下：蛋白质含量：2.8-3.5%；脂肪含量：3.0-5.0%；乳糖含量：4.0-5.6%；矿物质含量：0.5-0.7%。

（2）预热

将木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶各用蒸馏水稀释成浓度为1 .0 g/mL的蛋白酶溶液；将脱脂牛乳和蛋白酶溶液分别置于50-60℃水浴内预热20 min；

所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为食品级原料，；

（3）酶解

预热后，取脱脂牛乳，以点滴滴加方式依次添加上述三种蛋白酶溶液于脱脂乳中，获得脱脂乳和蛋白酶混合液、并进行酶解；所述酶解时持续均匀搅拌，搅拌速率为600 r/min，酶解时间为60-120 min，温度50-60℃，分时段调节pH，获得酶解液；

所述三种蛋白酶按照木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的顺序添加；

所述三种蛋白酶溶液的添加量分别按照三种蛋白酶的酶活力与底物蛋白质来添加，E/S比例按照2000:1-10000:1（E：酶活；S：蛋白质）；

所述分时段调节pH按照下述步骤：

a.将质量百分浓度为（10%）的柠檬酸水溶液添加入脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节脱脂乳和蛋白酶混合液pH值至6.0-7.0，酶解30-60min；

b.将质量百分浓度为（18%）碳酸氢钠水溶液加入上述脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节脱脂乳和蛋白酶混合液pH值至7.0-8.0，酶解30-60min；

（4）灭酶

酶解反应结束后将上述酶解液迅速水浴灭酶10-15min，水浴温度为90~100℃，灭酶后迅速将酶解液冷却至室温，再于5000 r/min高速离心10min~20min后分离沉淀，分离所得的上清液即为低致敏性液体乳。

所述低致敏性液体乳中分子量小于5000道尔顿的小肽约占99%。

实施例2不同处理对液体乳中主要蛋白致敏性降低率的影响

（1）牛乳样品：所述新鲜牛乳各指标如下：蛋白质含量：3.5%；脂肪含量： 5.0%；乳糖含量：5.6%；矿物质含量：0.7%；

（2）试验方法：

处理1：牛乳样品，采用间接ELISA方法测定，所述间接ELISA方法参照Elena,PRESTAMO, Guadalupe, BAEZA, Luisa M, MARTINEZMOLERO, Isabel M, GOMEZ,Rosario. Effects of combined high pressure and enzymatic treatments on thehydrolysis and immunoreactivity of dairy whey proteins[J]. InternationalDairy Journal, 2006, 18(9):918-22。

处理2：

将新鲜牛乳在12000 r/min下高速离心20-30min至完全脱脂，获得脱脂牛乳；将木瓜蛋白酶用蒸馏水稀释成浓度为1.0 g/mL的蛋白酶溶液，将木瓜蛋白酶溶液按照酶与底物中蛋白质比为6000:1（E/S）添加，酶解温度为60℃，酶解80min，酶解期间持续搅拌目的是使酶解体系中pH值保持相对稳定以及酶解充分；灭酶方法参照实施例1。

处理3：

将新鲜牛乳在12000 r/min下高速离心20-30min至完全脱脂，获得脱脂牛乳；将木瓜蛋白酶用蒸馏水稀释成浓度为1.0 g/mL的蛋白酶溶液，将木瓜蛋白酶溶液按照酶与底物中蛋白质比为6000:1（E/S）添加，酶解温度为60℃，酶解物pH值采用酸度计实时测定，a.将质量百分浓度为10%的柠檬酸水溶液添加入脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节pH值范围为6.0-7.0，酶解80min，酶解期间持续搅拌目的是使酶解体系中pH值保持相对稳定以及酶解充分；灭酶方法参照实施例1。

处理4：

将新鲜牛乳在12000 r/min下高速离心20-30min至完全脱脂，获得脱脂牛乳；将木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶各用蒸馏水稀释成浓度为1.0 g/mL的蛋白酶溶液，将三种蛋白酶溶液按照酶与底物中蛋白质比为6000:1（E/S）依次添加，酶解温度为60℃，

酶解过程PH值调节方法：

步骤1：将质量百分浓度为（10%）的柠檬酸水溶液添加入脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节脱脂乳和蛋白酶混合液pH值至6.0-7.0，酶解40min；

步骤2：将质量百分浓度为（18%）碳酸氢钠水溶液加入上述脱脂乳和蛋白酶混合液中，调节脱脂乳和蛋白酶混合液pH值至7.0-8.0，酶解40min；

酶解过程pH值测定采用酸度计实时测定，酶解期间持续搅拌目的是使酶解体系中pH值保持相对稳定以及酶解充分；灭酶方法参照实施例1。

（3）主要蛋白致敏性降低率测定结果

新鲜牛乳通过上述四个处理后，测定各处理灭酶后液体乳的十个蛋白的致敏降低率，表1为上述四个处理的主要蛋白致敏性降低率对比表，由结果可见，新鲜牛乳通过处理4的降低牛乳致敏性的液体乳制备方法获得的10个供试蛋白的致敏降低率均高于处理1-处理3。由此可见，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶依次添加入脱脂牛乳酶解，酶解过程PH值分段调节方法可以在温和条件下降低或破除牛乳中致敏乳蛋白，以达到降低其抗原性和致敏性目的。

表1 牛乳中主要蛋白致敏性降低率对比表

实施例3 不同酶与底物添加量对液体乳蛋白致敏性降低率的影响

采用如下方法体外模拟人体胃肠道消化，测定液体乳中蛋白致敏性降低率：

A.模拟胃消化：取适量液体乳在 5%甲酸中溶解，浓度为 1 mg/mL，胃蛋白酶与底物比为 1%，在 37℃下孵育 1 h，在沸水中加热 5 分钟停止反应。

B.模拟肠道消化：取适量液体乳溶解于磷酸盐缓冲液（pH7.0）胰蛋白酶与底物比为 1%，糜蛋白酶与底物比为 1%，弹性蛋白酶与底物比为 0.2%，在 37℃下孵育 1 h。在沸水中加热 5 min 停止反应。

本实施例中各处理水解度测定方法为：OPA法。

对照处理：所述液体乳采用新鲜牛乳，所述新鲜牛乳为辉山乳业提供的新鲜巴氏杀菌脱脂乳，量取150mL脱脂牛乳，采用间接ELISA法，测定水解度为0.1%，各个致敏蛋白的致敏性降低率均无检出。

处理1-处理7方法中所述液体乳采用降低牛乳致敏性的液体乳制备方法获得，脱脂、预热、酶解PH值调节，灭酶等条件参照实施例1的降低牛乳致敏性的液体乳制备方法；所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为食品级，且购于诺维信（中国）生物技术有限公司。所用新鲜牛乳为辉山乳业提供的新鲜巴氏杀菌脱脂乳。

处理1：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制2000:1，pH 6.0-7.0酶解60min，pH 7.0-8.0酶解60min，共酶解120min，水解度为5.6%，α-乳白蛋白致敏性降低率为2.3%，β-乳球蛋白致敏性降低率为10.2%，酪蛋白致敏性降低率为15.5%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为3.3%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为4.8%，β-酪蛋白致敏性降低率为5.1%，k-酪蛋白致敏性降低率为2.2%，免疫球蛋白致敏性降低率为1.3%，牛血清白蛋白致敏性降低率为2.7%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为2.3%。

处理2：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制4000:1，pH 6.0-7.0酶解60min，pH 7.0-8.0酶解60min，共酶解120min，水解度为8.9%，α-乳白蛋白致敏性降低率为4.6%，β-乳球蛋白致敏性降低率为23.2%，酪蛋白致敏性降低率为19.7%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为6.4%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为5.9%，β-酪蛋白致敏性降低率为4.1%，k-酪蛋白致敏性降低率为2.3%，免疫球蛋白致敏性降低率为1.9%，牛血清白蛋白致敏性降低率为3.2%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为3.6%。

处理3：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制6000:1，pH 6.0-7.0酶解60min，pH 7.0-8.0酶解60min，共酶解120min，水解度为11.5%，α-乳白蛋白致敏性降低率为6.4%，β-乳球蛋白致敏性降低率为34.5%，酪蛋白致敏性降低率为42.6%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为12.4%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为9.9%，β-酪蛋白致敏性降低率为10.1%，k-酪蛋白致敏性降低率为8.9%，免疫球蛋白致敏性降低率为3.7%，牛血清白蛋白致敏性降低率为4.6%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为5.3%。

处理4：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制8000:1，pH 6.0-7.0酶解60min，pH 7.0-8.0酶解60min，共酶解120min，水解度为15.3%，α-乳白蛋白致敏性降低率为9.4%，β-乳球蛋白致敏性降低率为56.3%，酪蛋白致敏性降低率为67.6%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为25.4%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为13.9%，β-酪蛋白致敏性降低率为18.7%，k-酪蛋白致敏性降低率为17.2%，免疫球蛋白致敏性降低率为4.8%，牛血清白蛋白致敏性降低率为5.1%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为5.9%。

处理5：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制10000:1，pH 6.0-7.0酶解60min，pH 7.0-8.0酶解60min，共酶解120min，水解度为19.9%，α-乳白蛋白致敏性降低率为10.9%，β-乳球蛋白致敏性降低率为80.2%，酪蛋白致敏性降低率为89.7%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为29.9%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为21.3%，β-酪蛋白致敏性降低率为19.6%，k-酪蛋白致敏性降低率为19.0%，免疫球蛋白致敏性降低率为5.8%，牛血清白蛋白致敏性降低率为6.3%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为7.2%。

处理6：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制10000:1，pH 6.0-7.0酶解30min，pH 7.0-8.0酶解30min，共酶解60min，水解度为10.9%，α-乳白蛋白致敏性降低率为7.9%，β-乳球蛋白致敏性降低率为34.2%，酪蛋白致敏性降低率为69.7%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为19.2%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为17.7%，β-酪蛋白致敏性降低率为14.7%，k-酪蛋白致敏性降低率为12.8%，免疫球蛋白致敏性降低率为6.9%，牛血清白蛋白致敏性降低率为7.5%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为8.0%。

处理7：

量取150mL脱脂牛乳，将三种蛋白酶溶液调制0.1 g/mL，酶与底物比添加量调制10000:1，pH 6.0-7.0酶解40min，pH 7.0-8.0酶解40min，共酶解80min，水解度为17.4%，α-乳白蛋白致敏性降低率为11.9%，β-乳球蛋白致敏性降低率为84.8%，酪蛋白致敏性降低率为90.7%，αs₁-酪蛋白致敏性降低率为29.3%，αs₂-酪蛋白致敏性降低率为27.7%，β-酪蛋白致敏性降低率为17.7%，k-酪蛋白致敏性降低率为15.1%，免疫球蛋白致敏性降低率为6.9%，牛血清白蛋白致敏性降低率为8.5%和乳铁结合蛋白致敏性降低率为9 .0%。