阅读说明：本技术 一种中药血盆草中的吲哚类生物碱及其提取纯化方法和应用 (Indole alkaloid in traditional Chinese medicine herba Rubi Corchorifolii, and extraction and purification method and application thereof ) 是由 杨武德 郭正红 陶小艳 於祥 隋怡 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种中药血盆草中的吲哚类生物碱及其提取纯化方法和应用,对血盆草进行止血活性初探、止血活性部位化学成分的分离和止血物质基础的活性筛选等研究,通过这些研究,初步掌握了血盆草的止血药效,分析贵州产血盆草止血活性部位的化学成分组成以及确定血盆草的止血物质基础,在此基础上,能科学评价血盆草的民间用药依据,同时为止血新药的研发、血盆草质量评价标准提供实践基础；为血盆草资源的开发及利用提供科学依据。(The invention relates to indole alkaloid in a traditional Chinese medicine of the blood basin grass and an extraction and purification method and application thereof, wherein the blood basin grass is researched for the initial detection of hemostatic activity, the separation of chemical components of hemostatic active parts, the activity screening of hemostatic material bases and the like, and through the researches, the hemostatic efficacy of the blood basin grass is preliminarily mastered, the chemical component composition of the hemostatic active parts of the blood basin grass in Guizhou province is analyzed, and the hemostatic material bases of the blood basin grass are determined; provides scientific basis for the development and utilization of the blood basin grass resource.)

一种中药血盆草中的吲哚类生物碱及其提取纯化方法和应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体涉及一种中药血盆草中的吲哚类生物碱及其提取纯化方法和应用。

背景技术

止血药为加速血液凝固、降低毛细血管的通透性或促进血管断端收缩，使出血停止的药物；可用于治疗各种原因引起的出血或出血性疾病。止血药不仅在临床上应用广泛，在生活中也广泛使用，具有重要的临床意义与研究价值。

据相关统计，中国医院用止血药的用量基本保持一个相对稳定的上升的用药水平趋势；如果单纯西医西药治疗，往往会出现促成高凝状态而带来危险后果，某些不适用症状或有术后后遗症的情况还需禁用或慎用此类西药，如肾功能不全或术后有血尿的情况；传统止血药物可带来较多不良反应，且均未能解决止血却又不促进血栓形成、免疫排斥等问题。中西结合已经成为研发新型止血药的一条思路，按照合理用药的安全、有效、经济与适当这四个基本原则，中药辩证论治以止血，可作用于生理学止血、凝血与纤维蛋白溶解三大系统。根据中药辨证治疗的临床方案的介入，与西医西药相辅相成，中草药的应用，还可减低医疗费用，减轻患者经济负担，体现了中医药在治疗疾病中的优越性。

到现在为止，在研究中药止血作用的同时，从植物中分离鉴定了一些止血活性成分。据报道，从鹿衔草全草中分离得到的醌类化合物梅笠草素，有抗出血作用和类维生素K样活性；苯丙素苷类化合物异毛蕊花苷被证实具有极强地抑制氧化溶血作用；从金丝桃属植物分离到的蟛蜞菊内酯和去甲蟛蜞菊内酯也具有很好的止血活性；小蓟主要止血成分之一咖啡酸，能收缩局部血管，抑制纤溶而达到止血效果。其他某些活性成分作用机制尚不明确，所以，加大对止血中药、民族药及单体化合物的止血机制研究，寻找止血效果好、机制明确和临床应用前景广阔的止血新药刻不容缓；制定具有止血活性单体化合物作为止血中药的质量控制的指标，为临床上合理、安全和有效用药提供保障。

血盆草(学名：Salvia cavaleriei var.simplicifolia Stib.)又称反(翻)背红，贵州铜仁及大多地区称血盆草，分布在贵州、湖北、四川、广西等地，贵州各地区资源丰富；血盆草在民间以全草入药，主治吐血、咳血等症状，主要有凉血解毒、散瘀止血等功效；治疗范围广，疗效确切，是贵州苗族、侗族等少数民族常用止血的民间药物。在贵州各苗族地区(包括贵阳市城区)均有，资源丰富，合理开发和利用血盆草，有足够的资源基础。血盆草属唇形科鼠尾草属植物，Wu Y-B与彭琼等对1934年-2015年的文献报道进行了整理及系统的综述，这期间从本属植物中分离得到的单体成分近900余种，主要类型为二萜类、三萜类、酚酸类、糖苷类、生物碱类、黄酮类、木脂素类、脂肪酸类及其他类型等化合物。文献研究表明，关于血盆草的化学成分研究及其他相关研究报道不多，仅有何可群^[12]对血盆草的总黄酮含量测定，赵立敏等从血盆草的水提取物的正丁醇部分分离得到两个微量酚苷--异槲皮苷和紫云英，张孟科从中分离出45个化合物，陈琼从中分离出17个化合物，王和英等从中分离出13个化合物，但并未见有对其止血方面的相关研究报道。

随着现在对中药现代化研究日益深入和对中药民族药的认识的不断加深，为了能更有效地控制药材质量和对药材更有力的评价，更合理地利用药材资源和发掘药材资源，保证临床用药更加的准确、安全、有效，也必须进一步加强现代临床实践与传统中医理论的结合，利用现代科学手段，研究并总结中药材的止血作用机理、止血化学成分，对中药民族药止血成分和止血理论的充实、完善，才能打破一些中医药民间用药经验说，为更好的继承、发扬中药民族药，奠定科学基础，因此，探寻研究贵州民间止血药草血盆草的止血成分、用药机理及用药合理性，为民间药草血盆草的开发、利用及资源评价有积极意义。

贵州地处我国云贵高原东部，居长江、珠江两大河流上游的分水岭地带，气候属亚热带高原山地型。由于贵州的生态环境特殊及自然条件的复杂多样，孕育了无比丰富而特有的药物资源，生长环境的不同，药物往往与其同属植物的化学成分差异较大；贵州民族地区用血盆草止血的基本机理尚未清楚，鉴于其在贵州民间的多种用途，其止血基础研究报道又极少，有效成分不清(止血)，有必要对其进行深入系统的研究，有利于进一步掌握和评价贵州民间药草血盆草运用的科学性。

为对贵州民间药草血盆草的止血作用进行相关研究，本发明对血盆草进行止血活性初探、止血活性部位化学成分的分离和止血物质基础的活性筛选等研究，通过这些研究，初步掌握了血盆草的止血药效，分析贵州产血盆草止血活性部位的化学成分组成以及确定血盆草的止血物质基础，在此基础上，能科学评价血盆草的民间用药依据，同时为止血新药的研发、血盆草质量评价标准提供实践基础；为血盆草资源的开发及利用提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药血盆草中的吲哚类生物碱；

本发明的另一目的是提供一种中药血盆草中的吲哚类生物碱提取纯化方法；

本发明的另一目的是提供一种中药血盆草中的吲哚类生物碱在止血药物方面的应用。

本发明所述吲哚类生物碱为吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚。

本发明所述吲哚-3-甲酸乙酯化合物表征为：

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***；

¹H-NMR(600 MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150 MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2

本发明所述3-羧基吲哚化合物表征为：

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：比例为35:1的二氯甲烷-甲醇展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4

本发明所述吲哚类生物碱的提取纯化方法具体为：取7～12kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用80～98％工业乙醇回流提取2～5次，每次1～3h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1300～2300g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取4～8次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏210～360g、氯仿部位浸膏180～320g、乙酸乙酯部位浸膏140～240g、正丁醇部位浸膏150～265g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；36～62mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯4.5～7.8mg；

7～13g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，160～275mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚3.1～5.2mg。

优选的，本发明所述吲哚类生物碱的提取纯化方法具体为：取8～11kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用85～97％工业乙醇回流提取2～4次，每次1～3h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1500～2100g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取5～7次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏230～340g、氯仿部位浸膏200～300g、乙酸乙酯部位浸膏160～220g、正丁醇部位浸膏170～245g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；36～62mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯5～7mg；

8～12g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，180～255mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚3.5～4.8mg。

进一步优选的，本发明所述吲哚类生物碱的提取纯化方法具体为：取9.3kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用95％工业乙醇回流提取3次，每次2h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1756g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取6次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏286.6g、氯仿部位浸膏244.9g、乙酸乙酯部位浸膏188.6g、正丁醇部位浸膏205.1g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；48mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯6mg；

10g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，212mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚4mg。

本发明所述吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚在止血药物方面的应用。

本发明所述吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚在止血药物制剂方面的应用。

本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料按常规工艺制备成药学上可接受的制剂，所述药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。

本发明所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；所述液体制剂为注射制剂、口服液。

本发明所述的药学上可接受的辅料没有限定，可以是填充剂、润滑剂、矫味剂、崩解剂、抗氧化剂、保湿剂、表面活性剂等本领域常用辅料中的一种或几种。

本发明原理：采用动物止血活性导向的方法从血盆草95％乙醇提取物的石油醚层中分离得到2个吲哚类生物碱，分别是吲哚-3甲酸乙酯和3-羧基吲哚，采用试管法测定吲哚类生物碱体外血浆复钙时间，结果发现吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚的结果呈阳性，且较阳性药(云南白药)的血浆复钙时间短明显缩短，证明该生物碱类化合物有明显的止血作用。

现有技术的问题及本发明的有益效果：

1、现有技术中如果采取单纯西医西药治疗，往往会出现促成高凝状态而带来危险后果，某些不适用症状或有术后后遗症的情况还需禁用或慎用此类西药，如肾功能不全或术后有血尿的情况；传统止血药物可带来较多不良反应，且均未能解决止血却又不促进血栓形成、免疫排斥等问题。

本发明从具有凉血解毒、散瘀止血的中药血盆草中分离得到2个吲哚类生物碱，药效学实验表明具有很好的止血作用，可直接开发成为止血药物或作为先导化合物合成一系列具有良好止血活性的药物。

2、本发明与空白组比较，吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚的血浆复钙时间明显缩短，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与阳性药物云南白药比较，化合物吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚血浆复钙时间缩短，且体外血浆复钙时间差异具有统计学意义(P<0.05)。因此本发明既解决了止血又解决了止血过程导致血栓形成、免疫排斥等问题。

附图说明

图1吲哚-3-甲酸乙酯的¹³C-NMR图

图2吲哚-3-甲酸乙酯的¹H-NMR图

图3 3-羧基吲哚的¹³C-NMR图

图4 3-羧基吲哚的¹H-NMR图

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。

实施例1

吲哚类生物碱的提取纯化方法

9.3kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用95％工业乙醇回流提取3次，每次2h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1756g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取6次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏(286.6g)、氯仿部位浸膏(244.9g)、乙酸乙酯部位浸膏(188.6g)、正丁醇部位浸膏(205.1g)以及水部位。

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶(100-200目)拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱色谱石油醚-乙酸乙酯(20:1～0:1)梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分(Fr.1～12)。

Fr.6经凝胶色谱柱(二氯甲烷-甲醇1:1)除色素后得6个组分(Fr.6.1～Fr.6.6)；Fr.6.6(48mg)经硅胶柱色谱石油醚-二氯甲烷(3:1)洗脱后得3个组分(Fr.6.6.1～Fr.6.6.3)，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物(吲哚-3-甲酸乙酯)(6mg)。

Fr.9(约10g)经凝胶色谱柱(二氯甲烷-甲醇1:1)除色素后，TLC跟踪得到5个组分(Fr.9.1～Fr.9.5)，Fr.9.5(212mg)采用湿法上样经两次二氯甲烷-甲醇体系(40:1、35:1)柱层析后刮板得到化合物(3-羧基吲哚)(4mg)。

化合部表征：

化合物1：吲哚-3甲酸乙酯

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)，

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2

化合物2：3-羧基吲哚

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：二氯甲烷-甲醇35:1展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4

实施例2

吲哚类生物碱的提取纯化方法

取7kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用8％工业乙醇回流提取2次，每次3h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1300g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取8次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏210g、氯仿部位浸膏180g、乙酸乙酯部位浸膏140g、正丁醇部位浸膏150g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；36mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯4.5mg；

7g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，160mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚3.1mg。

化合部表征：

化合物1：吲哚-3甲酸乙酯

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)，

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2

化合物2：3-羧基吲哚

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：二氯甲烷-甲醇35:1展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4

实施例3

吲哚类生物碱的提取纯化方法

取12kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用98％工业乙醇回流提取2次，每次1h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏2300g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取4次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏360g、氯仿部位浸膏320g、乙酸乙酯部位浸膏240g、正丁醇部位浸膏265g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；62mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯7.8mg；

13g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，275mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚5.2mg。

化合部表征：

化合物1：吲哚-3甲酸乙酯

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)，

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2.

化合物2：3-羧基吲哚

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：二氯甲烷-甲醇35:1展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4

实施例4

取8kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用85％工业乙醇回流提取2次，每次3h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1500g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取5次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏230g、氯仿部位浸膏200g、乙酸乙酯部位浸膏160g、正丁醇部位浸膏170g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；36mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯5mg；

8g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，180mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚3.5mg。

化合部表征：

化合物1：吲哚-3甲酸乙酯

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2

化合物2：3-羧基吲哚

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：二氯甲烷-甲醇35:1展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4

实施例5

取11kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用97％工业乙醇回流提取4次，每次1h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏2100g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取7次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏340g、氯仿部位浸膏300g、乙酸乙酯部位浸膏220g、正丁醇部位浸膏245g以及水部位；

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱以20:1～0:1的色谱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分Fr.1～12；

Fr.6经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后得6个组分Fr.6.1～Fr.6.6；62mg的Fr.6.6经硅胶柱以比例为3:1的色谱石油醚-二氯甲烷洗脱后得Fr.6.6.1～Fr.6.6.3共3个组分，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物吲哚-3-甲酸乙酯7mg；

12g的Fr.9经凝胶色谱柱以比例为1:1的二氯甲烷-甲醇除色素后，TLC跟踪得到5个组分Fr.9.1～Fr.9.5，255mg的Fr.9.5采用湿法上样，以比例为40:1、35:1的二氯甲烷-甲醇体系经两次柱层析后刮板得到化合物3-羧基吲哚4.8mg。

化合部表征：

化合物1：吲哚-3甲酸乙酯

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2.

化合物2：3-羧基吲哚

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：二氯甲烷-甲醇35:1展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4

实施例6

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入1/9的糊精，制粒，得颗粒剂。

实施例7

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入1/9的糊精，混匀，装入胶囊，得胶囊剂。

实施例8

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入1/10的糊精混合均匀，干燥，制成丸剂。

实施例9

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入1/10的糊精，制粒，压片，制成片剂。

实施例10

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入13倍量的注射用水，搅拌，过滤，灭菌，得注射剂。

实施例11

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入9倍量的注射用水，搅拌，过滤，冻干，得冻干粉剂。

实施例12

取吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚任意一种化合物作为原料药，加入13倍量纯净水，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。

为了进一步验证本发明的可行性及有效性，筛选出最佳方案，发明人进行了一系列的试验，具体如下：

传统止血药物可带来较多不良反应，且均未能解决止血却又不促进血栓形成、免疫排斥等问题。中西结合已经成为研发新型止血药的一条思路，中药辩证论治以止血，可作用于生理学止血、凝血与纤维蛋白溶解三大系统。本发明从具有凉血解毒、散瘀止血的中药血盆草(Salvia cavaleriei Levl.var.simplicifolia Stib.)中分离得到2个吲哚类生物碱，药效学实验表明具有很好的止血作用，可直接开发成为止血药物或作为先导化合物合成一系列具有良好止血活性的药物。

原理：采用动物止血活性导向的方法从血盆草95％乙醇提取物的石油醚层中分离得到2个吲哚类生物碱，分别是吲哚-3甲酸乙酯和3-羧基吲哚，采用试管法测定吲哚类生物碱体外血浆复钙时间，结果发现吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚的结果呈阳性，且较阳性药(云南白药)的血浆复钙时间短明显缩短，证明该生物碱类化合物有明显的止血作用。

1.实验方法

1.1吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚的提取与分离

提取与纯化方法：

9.3kg干燥的血盆草全草粉碎成粗粉后，用95％工业乙醇回流提取3次，每次2h，减压浓缩，回收溶剂，得到醇提浸膏1756g；将其按1：1混悬于水中分散后，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行1：1的萃取，每种极性溶剂萃取6次，每种萃取液分别合并，经旋转蒸发仪回收溶剂，分别得到石油醚部位浸膏(286.6g)、氯仿部位浸膏(244.9g)、乙酸乙酯部位浸膏(188.6g)、正丁醇部位浸膏(205.1g)以及水部位。

石油醚部位浸膏加溶剂溶解后用硅胶(100-200目)拌样，干法上硅胶柱，经硅胶柱色谱石油醚-乙酸乙酯(20:1～0:1)梯度洗脱，TLC跟踪，合并相同部分进行粗分段，得到12个组分(Fr.1～12)。

Fr.6经凝胶色谱柱(二氯甲烷-甲醇1:1)除色素后得6个组分(Fr.6.1～Fr.6.6)；Fr.6.6(48mg)经硅胶柱色谱石油醚-二氯甲烷(3:1)洗脱后得3个组分(Fr.6.6.1～Fr.6.6.3)，Fr.6.6.2经刮板后得到化合物1(吲哚-3-甲酸乙酯)(6mg)。

Fr.9(约10g)经凝胶色谱柱(二氯甲烷-甲醇1:1)除色素后，TLC跟踪得到5个组分(Fr.9.1～Fr.9.5)，Fr.9.5(212mg)采用湿法上样经两次二氯甲烷-甲醇体系(40:1、35:1)柱层析后刮板得到化合物2(3-羧基吲哚)(4mg)。

1.2化合物表征

化合物1：吲哚-3甲酸乙酯

结构式：

分子式：C₁₁H₁₁NO₂。

API-ES m/z：212[M+Na]⁺

状态：白色粉末(二氯甲烷)，

硅胶薄层检识：石油醚:乙酸乙酯(8:1)展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点，继续烘烤斑点变成***。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图1、图2。

化合物2：3-羧基吲哚

结构式：

分子式：C₉H₇NO₂

EI-MS m/z：161[M]⁺

熔点(mp)：232～234℃。

状态：淡黄色针状结晶(甲醇)

硅胶薄层检识：二氯甲烷-甲醇35:1展开后在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现橘黄色斑点。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)数据如下，谱图见图3、图4。

1.3体外止血活性实验

1.3.1动物、阳性对照药

健康家兔，2-4kg，青草喂养；云南白药胶囊(国药准字Z53020799，云南白药集团股份有限公司)；

1.3.2体外止血试验

1.3.2.1样品溶液的制备

取吲哚-3甲酸乙酯、3-羧基吲哚各5mg分别放置于PE管中，加1mL的去离子水，配制成5mg/mL浓度的溶液，置于超声清洗器中超声30min，再用微孔过滤器过滤制成澄清的样品溶液，备用。

1.3.2.2阳性对照药与M/40CaCl₂溶液的制备

取云南白药胶囊中的粉末0.05g，加10mL的去离子水溶解，再用0.45nm的微孔滤膜过滤，制得澄清的云南白药溶液(5mg/mL)，备用。

取无水CaCl2固体1.1100g，加400mL的去离子水溶解，配制成M/40CaCl2溶液，备用。

1.3.2.3抗凝血浆的制备

健康家兔经水合氯醛(10％，3.5mL/kg)腹腔注射麻醉后，用采血针和自带抗凝剂的负压采血管(枸橼酸钠1:9)在兔耳缘静脉取血，轻摇混匀后，以转速3000r/min离心30min，分离血浆，备用。

1.3.2.4试管法对体外血浆复钙时间的影响

取洁净的玻璃试管，用移液枪分别加入0.1mL的药物和0.1mL的M/40CaCl₂溶液，摇匀后放在试管架上，一并放入37℃的水浴锅中，加入0.1mL的抗凝血浆，开始计时，每隔10s倾斜一次试管观察，直至出现白色絮状纤维蛋白停止计时，这段时间即为血浆复钙时间。阳性对照组药物为云南白药溶液，空白对照组为去离子水。每组实验重复5次。

1.3.3结果与结论

1.3.3.1实验结果

样品的血浆复钙时间(N＝5，

^a:与空白组比较，P<0.05；^b:与阳性药比较，P<0.05

1.3.3.2实验结论

与空白组比较，吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚的血浆复钙时间明显缩短，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与阳性药物云南白药比较，化合物吲哚-3-甲酸乙酯、3-羧基吲哚血浆复钙时间缩短，且体外血浆复钙时间差异具有统计学意义(P<0.05)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。