阅读说明：本技术 一种双鸟苷酸环化酶改造基因、编码蛋白、工程菌及其构建方法和应用 (Modified gene of diguanylate cyclase, encoded protein, engineering bacterium, construction method and application thereof ) 是由 李晓燕 王宏 傅得响 张燕 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双鸟苷酸环化酶改造基因、编码蛋白、工程菌及其构建方法和应用；该双鸟苷酸环化酶改造基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该双鸟苷酸环化酶改造基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其工程菌由克隆有SEQ ID NO.1所示基因的重组质粒转入大肠杆菌中获得,还公开了上述工程菌的构建方法及应用该工程菌生产双鸟苷酸环化酶,所得的双鸟苷酸环化酶进一步应用于转化三磷酸鸟苷生成环鸟苷二磷酸的方法。该双鸟苷酸环化酶改造基因在大肠杆菌中的表达量高,根据双鸟苷酸环化酶改造基因编码的双鸟苷酸环化酶耐热性极强,最适反应温度为90℃,在70℃下保存6h保留70％的活性,该酶的比活力高、不容易出现产物抑制作用。(The invention discloses a modified gene of diguanylate cyclase, a coded protein, an engineering bacterium, a construction method and application thereof; the nucleotide sequence of the modified gene of the diguanylate cyclase is shown as SEQ ID NO. 1; the amino acid sequence of the modified gene coding protein of the diguanylate cyclase is shown as SEQ ID NO. 2; the engineering bacterium is obtained by transferring the recombinant plasmid cloned with the gene shown in SEQ ID NO.1 into escherichia coli, and also discloses a construction method of the engineering bacterium and a method for producing diguanylate cyclase by applying the engineering bacterium, wherein the obtained diguanylate cyclase is further applied to converting guanosine triphosphate to generate cyclic guanosine diphosphate. The modified gene of the diguanylate cyclase has high expression level in escherichia coli, the diguanylate cyclase coded by the modified gene of the diguanylate cyclase has extremely strong heat resistance, the optimal reaction temperature is 90 ℃, 70% of activity is reserved after the gene is stored for 6 hours at 70 ℃, the specific activity of the enzyme is high, and the product inhibition effect is not easy to occur.)

一种双鸟苷酸环化酶改造基因、编码蛋白、工程菌及其构建方 法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程与化学工程技术领域，具体涉及一种双鸟苷酸环化酶改造基因、改造基因编码蛋白、表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌及其构建方法，以及该工程菌在产双鸟苷酸环化酶和双鸟苷酸环化酶生物催化合成c-di-GMP方面的应用。

背景技术

环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是广泛存在于各类细菌中的小分子第二信使，第二信使在调控生物膜的形成、毒力因子的产生以及适应环境等生物过程发挥着重要的作用。环鸟苷二磷酸被大多数细菌利用，并涉及参与多种生理过程；环鸟苷二磷酸调控的细胞功能包括诱导细胞-细胞信号的转导、生物膜的形成、运动性、以及毒力等等；环鸟苷二磷酸通过结合不同的受体发挥调节作用，这些受体包括Pi1Z、退化的GGDEF、EAL、HD-GYP结构域、转录因子和核糖开关。在诸多的细菌当中，胞内高浓度的环鸟苷二磷酸可以促进生物膜的形成，而低浓度的环鸟苷二磷酸则促进病原体运动和致病因子的合成；随着环鸟苷二磷酸调控机理的深入研究，其在医药领域的市场及应用前景非常广阔。

目前，环鸟苷二磷酸的生产方法主要有化学法和生物酶法。Kawai R等公开了一种化学合成c-di-GMP的方法，以3'-O-[(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5'-O-(4,4'-二甲氧三苯甲基)-2'-O-叔丁基二甲基氯硅烷-N2-异丁酰鸟嘌呤核苷(S1)为原料，对它进行水解、β消除、脱三苯甲基反应得到中间体S2；S2的3’-磷酸基和5’-羟基发生分子间的酯化反应、再脱去三苯甲基得到中间体S4；S4通过分子内酯化反应形成环状的中间体S5；S5经β消除反应得到S6；S6经过最后的脱保护反应、结晶干燥得到环鸟苷二磷酸成品S7，总得率约为30％，该方法合成步骤多，产率低，涉及大量剧毒有机溶剂；已公开的其他合成方法均为耗时、昂贵、低效的多步骤合成路线，存在使用大量危险化学品、对环境不友好、不适合大规模工业化生产的问题。

c-di-GMP的合成受双鸟苷酸环化酶控制，生物酶法主要是使用双鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase，DGC，EC 2.7.7.65)将三磷酸鸟苷(GTP)催化生成c-di-GMP；DGC的活性位于GGDEF结构域中，该结构域含有保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe氨基酸序列，目前已有11个细菌物种中的27个DGC或类似蛋白的三级结构被鉴定，酶法生产c-di-GMP虽然具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、转化率高等优势，但目前的双鸟苷酸环化酶还是存在表达量低、比活力低、成本高、产物抑制等问题，例如通过海栖热袍菌产的双鸟苷酸环化酶容易沉淀而且容易出现产物抑制；因此，在酶法生产环鸟苷二磷酸的过程中，如何获得低成本、高表达量、不容易出现产物抑制的双鸟苷酸环化酶是目前存在的关键问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种双鸟苷酸环化酶改造基因，本发明通过基因组数据库挖掘及同源序列比对等虚拟筛选手段，结合分子生物学手段从下颚假热菌中获得双鸟苷酸环化酶基因序列，同时采用分子生物学和过程优化手段对来源于下颚假热菌的双鸟苷酸环化酶基因序列进行改造得到双鸟苷酸环化酶改造基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该双鸟苷酸环化酶改造基因在大肠杆菌中的表达量高。

本发明的第二个目的是提供上述双鸟苷酸环化酶改造基因编码的蛋白，该蛋白即为双鸟苷酸环化酶，该双鸟苷酸环化酶的耐热性极强，最适反应温度为90℃，在70℃下保存6h保留70％的活性。

本发明的第三个目的是提供一种表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌，该工程菌可以高效表达双鸟苷酸环化酶，解决了现有技术中双鸟苷酸环化酶表达量低、比活力低、容易出现产物抑制的问题。

本发明的第四个目的是提供上述工程菌的构建方法。

本发明的第五个目的是提供一种应用上述工程菌产双鸟苷酸环化酶的方法，通过该方法得到的双鸟苷酸环化酶的比活力可以达到0.047IU/mg，远高于现有报道的双鸟苷酸环化酶。

本发明的第六个目的是提供一种应用上述双鸟苷酸环化酶生产环鸟苷二磷酸的方法，该方法以双鸟苷酸环化酶作为催化剂转化三磷酸鸟苷生产环鸟苷二磷酸，在50℃，底物浓度为15mmol/L时c-di-GMP的积累量为6.10mmol/L，转化率达到81.33％，极大地克服了现有技术中存在的底物抑制作用。

本发明所采用的第一个技术方案是：一种双鸟苷酸环化酶改造基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所采用的第二个技术方案是：一种双鸟苷酸环化酶改造基因编码蛋白，该编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明所采用的第三个技术方案是：一种表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌，所述工程菌由重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌中获得，所述重组质粒由SEQ ID NO.1所示的基因克隆到质粒载体上获得。

进一步的，所述大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)和Shuffle T7中的一种；所述质粒载体为pET28a、pET32a和pET39a中的一种。

本发明所采用的第四个技术方案是：一种构建表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌的方法，包括以下步骤：

S1：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行人工合成得到双鸟苷酸环化酶改造基因；

S2：采用NcoI和XhoI双酶切双鸟苷酸环化酶改造基因和质粒载体，对酶切产物进行胶回收；

S3：用T4连接酶连接酶切产物，并将连接产物转化到表达宿主大肠杆菌中；

S4：挑取单菌落接种到装有LB液体培养基的试管中，37℃，220rpm下培养8-12h；提取重组质粒；

S5：进行酶切验证，将含有双鸟苷酸环化酶改造基因的重组质粒进行测序验证，选出双鸟苷酸环化酶改造基因完全正确的菌株，即为表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌。

本发明所采用的第五个技术方案是：一种应用上述工程菌产双鸟苷酸环化酶的方法，包括以下步骤：

S1：将构建的工程菌接入含有卡那霉素的LB平板37℃培养；

S2：挑取单菌落至含有卡那霉素的LB培养基中培养，形成种子液；

S3：将种子液转接至含有卡那霉素的LB培养基中，培养至OD_600nm为0.6，1.7和3.2；

S4：加入IPTG，诱导2，4，6和8h后收集菌体；

S5：将菌体破碎离心取上清液，经纯化后得纯双鸟苷酸环化酶液。

进一步的，上述工程菌产双鸟苷酸环化酶的方法，包括以下具体步骤：

S1：将构建的工程菌接入含有50mg/L卡那霉素的LB平板37℃培养12-16h；

S2：挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养8-12h，形成种子液；

S3：将种子液以2％的接种量转接至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养至OD_600nm为0.6，1.7和3.2；

S4：分别加入终浓度为0.05、0.1、0.5和1.0mmol/L的IPTG，在22，26，30和34℃下诱导发酵，诱导2，4，6和8h后收集菌体，用50mM Tris，pH8.0洗涤菌体；

S5：将菌体破碎，离心收集上清液并经过镍柱纯化，得到纯化后的双鸟苷酸环化酶液。

本发明所采用的第六个技术方案是：一种应用上述双鸟苷酸环化酶生产环鸟苷二磷酸的方法，包括以下步骤：

S1：配制含有三磷酸鸟苷、双鸟苷酸环化酶、氯化镁和Tris-HCl缓冲液的反应液于反应器皿中；

S2：反应液在35-70℃下反应，用氢氧化钠调节反应液pH至7.0；

S3：反应结束后，煮沸5min终止反应。

进一步的，所述步骤S1中三磷酸鸟苷的浓度为2-100mmol/L；双鸟苷酸环化酶的浓度为1mIU/mL～50mIU/mL；氯化镁的终浓度为5-20mmol/L；Tris-HCl缓冲液的pH为6.0-8.0。

进一步的，所述步骤S2具体为将反应器皿置于水浴锅中调控反应温度，使反应液在35-70℃下反应，每隔2h用氢氧化钠调节反应液pH至7.0，反应时间为2h-48h。

上述技术方案的有益效果：

(1)本发明通过基因组数据库挖掘和同源序列比对等虚拟筛选手段，结合分子生物学手段从下颚假热菌(Pseudothermotoga hypogea)中获得双鸟苷酸环化酶基因序列，同时采用分子生物学和过程优化手段对来源于Pseudothermotoga hypogea的双鸟苷酸环化酶基因序列进行改造得到双鸟苷酸环化酶改造基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该双鸟苷酸环化酶改造基因能在后期大肠杆菌工程菌中顺利高效表达，提高工程菌产双鸟苷酸环化酶的活力。

(2)双鸟苷酸环化酶改造基因编码的双鸟苷酸环化酶耐热性极强，最适反应温度为90℃，在70℃下保存6h保留70％的活性，稳定性好；其比活力达到0.047IU/mg，远高于现有报道的双鸟苷酸环化酶。

(3)发酵得到的粗酶液经纯化后得到纯双鸟苷酸环化酶，将纯双鸟苷酸环化酶用以转化生产环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)，反应体系成分明确，有利于后续产物分离纯化。

(4)通过本发明双鸟苷酸环化酶改造基因编码的双鸟苷酸环化酶作为催化剂转化三磷酸鸟苷生产环鸟苷二磷酸，在50℃，底物浓度为15mmol/L时c-di-GMP的积累量为6.10mmol/L，转化率达到81.33％，极大地克服了现有技术中的双鸟苷酸环化酶存在底物抑制问题。

附图说明

图1为本发明双鸟苷酸环化酶分离纯化的蛋白电泳图(其中，SM为上样液，FT为上柱穿透液，E为洗脱液)；

图2为温度对双鸟苷酸环化酶催化活性的影响；

图3为不同温度下双鸟苷酸环化酶的稳定性；

图4为环鸟苷二磷酸的结构式；

图5为本发明转化液高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例一

双鸟苷酸环化酶改造基因的获得

(1)以海栖热袍菌的双鸟苷酸环化酶氨基酸序列在NCBI数据库中进行Blast，发现其与来源于下颚假热菌(Pseudothermotoga hypogea)的双鸟苷酸环化酶的序列一致性为48.72％，查找获得Pseudothermotoga hypogea来源的双鸟苷酸环化酶的核苷酸序列；

(2)将来源于Pseudothermotoga hypogea的双鸟苷酸环化酶的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，主要是将稀有密码子剔除，并加上NcoI和XhoI酶切位点，得到双鸟苷酸环化酶改造基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列送至上海捷瑞公司进行人工合成，得到目的基因(双鸟苷酸环化酶改造基因)。

实施例二

表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌的构建

(1)将来源于Pseudothermotoga hypogea的双鸟苷酸环化酶的核苷酸序列根据E.coli的密码子偏好性进行密码子优化，主要是将稀有密码子剔除，并加上NcoI和XhoI酶切位点，得到双鸟苷酸环化酶改造基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行人工合成(上海捷瑞公司)得到双鸟苷酸环化酶改造基因；

(3)采用NcoI和XhoI双酶切双鸟苷酸环化酶改造基因和质粒载体，酶切产物进行胶回收；质粒载体为pET28a、pET32a和pET39a中的一种；

(4)用T4连接酶连接酶切产物，将连接产物转化到表达宿主BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)或Shuffle T7中；

(5)挑取单菌落接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，220rpm下培养8-12h；提取重组质粒；

(6)进行酶切验证，将含有双鸟苷酸环化酶改造基因的重组质粒进行测序验证，确认重组质粒的阅读框正确，选出双鸟苷酸环化酶改造基因完全正确的菌株，即为表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌。

实施例三

应用表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌生产双鸟苷酸环化酶

(1)将构建的工程菌接入含有50mg/L卡那霉素的LB平板37℃培养12-16h；

(2)挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养8-12h，形成种子液；

(3)将种子液以2％的接种量转接至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养至OD_600nm为0.6，1.7和3.2；

(4)分别加入终浓度为0.05、0.1、0.5和1.0mmol/L的IPTG，在22，26，30和34℃四个温度下诱导发酵，诱导2，4，6和8h后收集菌体，用50mM Tris，pH8.0洗涤菌体；

(5)将菌体破碎，离心发酵液收集上清液，上清液经过纯化，得到纯化后的双鸟苷酸环化酶液。

实施例四

双鸟苷酸环化酶的纯化及性能测定

(1)双鸟苷酸环化酶的纯化

1)上样液的准备：用原发酵液体积十分之一的预冷平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4)重悬菌体；取5mL菌体重悬液，采用超声破碎，输出功率200W，工作5s，停7s，循环30次，整个过程中细胞保持冰浴；细胞破碎液在4℃，12000rpm下离心10min，上清液即为上样液；

2)平衡柱填料：先后采用10倍于柱填料体积的平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4)冲洗柱填料，待紫外蛋白检测器示数稳定后，调为零点；

3)上样：用不超过1mL/min的流速进样，在检测器示数达到最大值后接取适量流出穿透液；

4)洗杂：上样结束后，先后采用10倍于柱填料体积的平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4)冲洗柱填料以除去杂蛋白；

5)洗脱：冲洗过后，采用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，400mM咪唑，500mM NaCl，pH7.4)洗脱目标蛋白(双鸟苷酸环化酶)，待检测器示数开始上升时分管接收流出液，流出液中即含有纯化的双鸟苷酸环化酶。

双鸟苷酸环化酶分离纯化的蛋白电泳图见图1，其中SM为上样液，FT为上柱穿透液，E为洗脱液。

(2)性能测定：双鸟苷酸环化酶酶活力的测定

酶活力(IU)定义：35℃和pH8.0下每分钟催化产生1μmol c-di-GMP所需的酶量。

双鸟苷酸环化酶酶活力的测定：1ml反应体系中，20μL DGC酶液，1mmol/L的GTP，20mmol/L的MgCl₂，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，35℃下反应1h，立即沸水浴中加热5min终止反应。

酶的比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数IU。

测得双鸟苷酸环化酶比活力达到0.047IU/mg，远高于现有报道的双鸟苷酸环化酶。

该双鸟苷酸环化酶应用于食品、化工、化妆品以及制备药物领域。

(3)性能测定：温度对双鸟苷酸环化酶活力及稳定性的影响

将双鸟苷酸环化酶分别置于30、35、40、50、60、70、80、90℃，保温2h、4h、6h，然后测定剩余酶活力，以活性最高值作为100％对照；如图2、3所示，双鸟苷酸环化酶低于70℃条件下放置，酶活力相对稳定，损失不大，说明该酶的热稳定性较好。当温度高于80℃条件下放置，双鸟苷酸环化酶活力迅速下降，2h后剩余酶活力约为20％。

实施例五

应用双鸟苷酸环化酶纯酶催化生成c-di-GMP

(1)取250mL三角烧瓶，配制如下总体积为100mL的反应液：15mmol/L GTP，20mmol/L氯化镁，50mM Tris-HCl，pH7.0，双鸟苷酸环化酶的加量为0.0149IU/mL；

(2)将装有反应液的三角烧瓶置于50℃水浴锅反应，反应过程中每个2h用氢氧化钠调节pH至7.0，反应持续24h；

(3)反应结束后，煮沸5min终止反应；

(4)采用高效液相色谱法对环鸟苷二磷酸c-di-GMP进行定量分析；

色谱柱：C18(5um，4.6mm×150mm)，以0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈(95:5)为流动相，流速为1mL/min，检测波长为253nm，柱温为30℃。0.1mol/L磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠17.9g、磷酸二氢钾6.8g，加水900ml溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入四丁基溴化铵0.805g，加水至1000ml，摇匀。

环鸟苷二磷酸的结构式如图4所示；转化液高效液相色谱图如图5所示，图5中4.964min处为GTP峰，7.872min处为c-di-GMP峰；测得转化液中含有c-di-GMP6.10mmol/L，转化率达到81.33％。

本发明提供了一种双鸟苷酸环化酶改造基因、编码蛋白、工程菌及其构建方法和应用，包括将来源于Pseudothermotoga hypogea的双鸟苷酸环化的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，主要是将稀有密码子剔除，并加上NcoI和XhoI酶切位点，得到双鸟苷酸环化酶改造基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；根据双鸟苷酸环化酶改造基因编码蛋白，得到双鸟苷酸环化酶；构建表达双鸟苷酸环化酶改造基因的工程菌，并利用该工程菌生产双鸟苷酸环化酶，所得的双鸟苷酸环化酶进一步应用于转化三磷酸鸟苷生成环鸟苷二磷酸。

本发明通过基因组数据库挖掘和同源序列比对等虚拟筛选手段，结合分子生物学手段从下颚假热菌(Pseudothermotoga hypogea)中获得双鸟苷酸环化酶基因序列，同时采用分子生物学和过程优化手段对来源于Pseudothermotoga hypogea的双鸟苷酸环化酶基因序列进行改造得到双鸟苷酸环化酶改造基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该双鸟苷酸环化酶改造基因能在后期大肠杆菌工程菌中顺利高效表达，提高工程菌产双鸟苷酸环化酶的能力，提高双鸟苷酸环化酶的比活力。双鸟苷酸环化酶改造基因编码的双鸟苷酸环化酶耐热性极强，最适反应温度为90℃，在70℃下保存6h保留70％的活性，稳定性好；其比活力达到0.047IU/mg，远高于现有报道的双鸟苷酸环化酶。

发酵得到的粗酶液经纯化后得到纯双鸟苷酸环化酶用以转化生产环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)，反应体系成分明确，有利于后续产物分离纯化。通过本发明双鸟苷酸环化酶改造基因编码的双鸟苷酸环化酶作为催化剂转化三磷酸鸟苷生产环鸟苷二磷酸，在50℃，底物浓度为15mmol/L时c-di-GMP的积累量为6.10mmol/L，转化率达到81.33％，极大地克服了现有技术中双鸟苷酸环化酶存在的底物抑制作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

序列表

<110> 杭州美亚药业股份有限公司

<120> 一种双鸟苷酸环化酶基因、编码蛋白、工程菌及其构建方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1070

<212> DNA

<213> Pseudothermotoga hypogea

<400> 1

ccatgggctc aaagtttgaa acctgcgtgg agattctcca gtacttaggt gagatcgctt 60

cgaaacttct gagtgggcaa accgaaaatg tctatcaaga tgtcttggaa aaggccatga 120

agatcgtgcc tggagctcag gctggatcga ttcttgtgcg cgagaatgat cggttcgtgt 180

acgtcgcggc ggtggggtat gaacttgagg agcttcagaa agtgagcttc accgtcgaag 240

aggaggaaga atgggttggt cgtgatcgca gctacgcaat tgtcttacgt gaagacattg 300

agcgcttcga tgaagcctta ctcaaatctg ataaacgtgt aggtattttg gcaaatttcg 360

gtggaattaa aaagatcaaa gcaacattga tcattcctgt gcgcatcaaa aacgagctcg 420

cgttggtgct gaaccttgac aactttgaac gtagcgatgc tttcaacgag gattcgatcg 480

tcctggccaa ggtcttggct aacgtgctcg gaatcatctt caaccgtctg gagctcgaaa 540

atcaactccg cgtgaagaac cagttgttag agtacatgtc gtaccacgat actctcacca 600

atcttccaaa ccgccgtttg cttgaggagt tcgccgaaaa gatgctcaag ctggctaagc 660

gcgagaacaa acctttgagc atccttttca tggaccttga caagttcaaa ccgatcaacg 720

atacgtatgg gcaccaggtg ggagacgaag ttatgaaatt ggttgcggcc cgcctcgaac 780

gtttcacgcg ctccaacgat atggtctcac ggttcggtgg agatgaattc gtgatctcag 840

cgtacgattg ttcgaagcaa gatgcaaaag catttgccga gcgtctcatc aaagcgatgg 900

aagaaccgat gaaaatcgat caattaacgc ttcaactgag cgcttctgta ggtatcgcga 960

cgtttccgga agatggcgat gaactgacca agttgattcg tgttgcagac gaacgtctct 1020

acatggcgaa gaagagtgga tcgaagatcg tcacacaagg cctcgagtaa 1070

<210> 2

<211> 355

<212> PRT

<213> Pseudothermotoga hypogea

<400> 2

Met Gly Ser Lys Phe Glu Thr Cys Val Glu Ile Leu Gln Tyr Leu Gly

1 5 10 15

Glu Ile Ala Ser Lys Leu Leu Ser Gly Gln Thr Glu Asn Val Tyr Gln

20 25 30

Asp Val Leu Glu Lys Ala Met Lys Ile Val Pro Gly Ala Gln Ala Gly

35 40 45

Ser Ile Leu Val Arg Glu Asn Asp Arg Phe Val Tyr Val Ala Ala Val

50 55 60

Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val Ser Phe Thr Val Glu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Glu Trp Val Gly Arg Asp Arg Ser Tyr Ala Ile Val Leu Arg

85 90 95

Glu Asp Ile Glu Arg Phe Asp Glu Ala Leu Leu Lys Ser Asp Lys Arg

100 105 110

Val Gly Ile Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ile Lys Lys Ile Lys Ala Thr

115 120 125

Leu Ile Ile Pro Val Arg Ile Lys Asn Glu Leu Ala Leu Val Leu Asn

130 135 140

Leu Asp Asn Phe Glu Arg Ser Asp Ala Phe Asn Glu Asp Ser Ile Val

145 150 155 160

Leu Ala Lys Val Leu Ala Asn Val Leu Gly Ile Ile Phe Asn Arg Leu

165 170 175

Glu Leu Glu Asn Gln Leu Arg Val Lys Asn Gln Leu Leu Glu Tyr Met

180 185 190

Ser Tyr His Asp Thr Leu Thr Asn Leu Pro Asn Arg Arg Leu Leu Glu

195 200 205

Glu Phe Ala Glu Lys Met Leu Lys Leu Ala Lys Arg Glu Asn Lys Pro

210 215 220

Leu Ser Ile Leu Phe Met Asp Leu Asp Lys Phe Lys Pro Ile Asn Asp

225 230 235 240

Thr Tyr Gly His Gln Val Gly Asp Glu Val Met Lys Leu Val Ala Ala

245 250 255

Arg Leu Glu Arg Phe Thr Arg Ser Asn Asp Met Val Ser Arg Phe Gly

260 265 270

Gly Asp Glu Phe Val Ile Ser Ala Tyr Asp Cys Ser Lys Gln Asp Ala

275 280 285

Lys Ala Phe Ala Glu Arg Leu Ile Lys Ala Met Glu Glu Pro Met Lys

290 295 300

Ile Asp Gln Leu Thr Leu Gln Leu Ser Ala Ser Val Gly Ile Ala Thr

305 310 315 320

Phe Pro Glu Asp Gly Asp Glu Leu Thr Lys Leu Ile Arg Val Ala Asp

325 330 335

Glu Arg Leu Tyr Met Ala Lys Lys Ser Gly Ser Lys Ile Val Thr Gln

340 345 350

Gly Leu Glu

355