一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法

文档序号：1237398 发布日期：2020-09-11 浏览：28次 >En<

阅读说明：本技术 一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法 (Novel genome editing tool (Lb2Cas12a-RVR) and construction method and application method thereof ) 是由谷峰刘潇宇林莉于 2020-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)及其构建方法和应用方法,其技术方案要点是包括包括编码表达Lb2Cas12a-RVR突变型蛋白编码质粒pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR,编码蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示,该新型改造的基因组编辑工具及其构建方法和应用方法,以解决在精确位点特异性基因编辑的低活性和低保真性的问题,有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选,药物开发,致病突变纠正等进行深入研究,其在人类细胞中具有基因组编辑活性,并且具有更好的的PAM灵活性、高保真度和特殊的切割方式。(The invention discloses a novel genome editing tool (Lb2Cas12a-RVR) and a construction method and an application method thereof, and the technical scheme is characterized by comprising a mutant protein coding plasmid pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR for coding and expressing Lb2Cas12a-RVR, wherein the DNA sequence of the coding protein is shown as SEQ ID NO. 1.)

一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)及其构建方法和应用方法

技术领域

本发明涉及一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)及其构建方法和应用方法。

背景技术

作为新型的基因组编辑工具，CRISPR家族新成员Cas12a近几年来受到广泛的关注，并在人类细胞以及动植物模型的基因治疗领域崭露头角。Cas12a介导的靶向基因组工程技术已经实现了广泛的研究和医学应用。然而现有的研究多集中于FnCas12a，AsCas12a和LbCas12a，受限于此，哺乳动物相关的基因组编辑研究也多围绕AsCas12a和LbCas12a展开，然而，对于在精确位点特异性的人类基因组编辑中的广泛应用，有限的靶选择谱和低活性、低保真度仍将是其介导应用的瓶颈。因此，迫切需要开发具有用于操纵人类基因组的改进特征的新型Cas12a核酸酶。

此外，细胞基因组在染色体自我复制的过程中由于受到各种内源性或者外源性因素的影响，存在多种形式的损伤，并由此引发一系列细胞学反应。DNA的损伤类型很多，其中以DNA双链断裂(double strand break,DSB)最为严重。且DNA DSB的修复比其他类型的DNA损伤更加困难，不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡，而错误修复则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等。DNA损伤的不完全修复可导致基因组不稳定，机体细胞为了对抗损伤，进化出多个修复系统来确保基因组的完整性，其中同源重组修复(homologousrecombination repair,HDR)是DNA DSB损伤修复的主要方式。HDR主要发生在有丝***的S期和G2监测点，因DNA DSB而导致断裂DNA末端与姐妹染色单体进行结合并进行修复。

基于申请者之前的研究(Tu,M.et al.A'new lease of life':FnCpf1 possessesDNAcleavage activity for genome editing in human cells.Nucleic acidsresearch.2017；45(19):11295-304)，申请者高度怀疑三个Cas12a同源蛋白(Lb2Cas12a，PcCas12a和PmCas12a)具有基因组编辑活性，尽管最初的研究(Zetsche B.et al.Cpf1 isa single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell.2015；163(3):759-71))将它们排除在现有的被广泛接受的基因组编辑工具之外。因此，将其开发为更高效的人类基因组编辑工具，能够极大地扩充申请者对基因编辑器的应用，Lb2Cas12a及突变体在基础研究、临床治疗、微生物育种、植物育种等具有广拓的应用，尤其是为临床疾病治疗提供强有力的研究工具。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种新型改造的基因组编辑工具及其构建方法和应用方法，该新型改造的基因组编辑工具及其构建方法和应用方法，以解决在精确位点特异性基因编辑的低活性和低保真性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正等进行深入研究。其在人类细胞中具有基因组编辑活性，并且具有更好的的PAM灵活性、高保真度和特殊的切割方式。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种新型改造的基因组编辑工具，包括编码表达Lb2Cas12a-RVR突变型蛋白编码质粒pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR，编码蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种基因编辑工具的构建方法，包括以下步骤：

步骤21：包括引物，所述引物上设置相应突变，所述引物序列如SEQ ID NO.7所示；

步骤22：从pY011(pcDNA3.1-hLb2Cpf1)载体上扩增片段1，序列如SEQ ID NO.2，扩增片段2，序列如SEQ ID NO.3；

步骤23：将扩增后的片段与骨架通过ClonExpress II One Step Cloning Kit得到突变后载体pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR。

一种Lb2Cas12a-RVR基因编辑工具的应用方法，包括以下步骤：

步骤33：包括构建针对某致病基因DNA靶点的crRNA，在真核细胞中共引入crRNA和Lb2Cas12a-RVR表达载体，使其在靶位点发生原位修复；

步骤34：构建评估Lb2Cas12a-RVR编辑活性、效率和保真性的GFP报告系统，其利用的GFP基因序列为SEQ ID NO.4；

步骤35：构建Lb2Cas12a-RVR基因修复模板RS1-GFP细胞系，其利用的RS1-GFP基因序列为SEQ ID NO.5；

步骤36：对于处理后的真核细胞基因组DNA进行抽提，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量测序DNA文库，并进行高通量测序。

本发明的有益效果：通过

附图说明

图1为pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR质粒模式图；

图2为pSin-GFP质粒模式图；

图3为pSin-RS1-GFP质粒模式图；

图4为pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR在RS1基因中进行HDR修复的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。其中相同的零部件用相同的附图标记表示。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“底面”和“顶面”、“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。

参照图1至4所示，本实施例的一种新型改造的基因组编辑工具，包括编码表达Lb2Cas12a-RVR突变型蛋白编码质粒pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR，编码蛋白的DNA序列如SEQID NO.1所示。

上述改进具体为：SEQ ID NO.1 Lb2Cas12a-RVR基因序列(人工合成)

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本实施例的一种基因编辑工具的构建方法，包括以下步骤：

步骤21：包括引物，所述引物上设置相应突变，所述引物序列如SEQ ID NO.7所示；

步骤22：从pY011(pcDNA3.1-hLb2Cpf1)载体上扩增片段1，序列如SEQ ID NO.2，扩增片段2，序列如SEQ ID NO.3；

步骤23：将扩增后的片段与骨架通过ClonExpress II One Step Cloning Kit得到突变后载体pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR。

上述改进具体为：SEQ ID NO.2扩增片段1序列(人工合成)

SEQ ID NO.3扩增片段2序列(人工合成)

ggcgtgctgctgctgaaggacggcaagtactatctgggcatcatgaacacaagcgccaataaggccttcgtgaatccccctgtggccaagaccgagaaggtgtttaagaaggtggattacaagctgctgccagtgcccaaccagatgctgccaaaggtgttctttgccaagagcaatatcgacttctataacccctctagcgagatctactccaattataagaagggcacccacaagaagggcaatatgttttccctggaggattgtcacaacctgatcgacttctttaaggagtctatcagcaagcacgaggactggagcaagttcggctttaagttcagcgatacagcctcctacaacgacatctccgagttctatcgcgaggtggagaagcagggctacaagctgacctatacagacatcgatgagacatacatcaatgatctgatcgagcggaacgagctgtacctgttccagatctataataaggactttagcatgtactccaagggcaagctgaacctgcacacactgtatttcatgatgctgtttgatcagcgcaatatcgacgacgtggtgtataagctgaacggagaggcagaggtgttctataggccagcctccatctctgaggacgagctgatcatccacaaggccggcgaggagatcaagaacaagaatcctaaccgggccagaaccaaggagacaagcaccttcagctacgacatcgtgaaggataagcggtatagcaaggataagtttaccctgcacatccccatcacaatgaacttcggcgtggatgaggtgaagcggttcaacgacgccgtgaacagcgccatccggatcgatgagaatgtgaacgtgatcggcatcgaccggggcgagagaaatctgctgtacgtggtggtcatcgactctaagggcaacatcctggagcagatctccctgaactctatcatcaataaggagtacgacatcgagacagattatcacgcactgctggatgagagggagggcggcagagataaggcccggaaggactggaacaccgtggagaatatcagggacctgaaggccggctacctgagccaggtggtgaacgtggtggccaagctggtgctgaagtataatgccatcatctgcctggaggacctgaactttggcttcaagaggggccgccagaaggtggagaagcaggtgtaccagaagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattacctggtcatcgacaagagccgcgagcagacatcccctaaggagctgggaggcgccctgaacgcactgcagctgacctctaagttcaagagctttaaggagctgggcaagcagtccggcgtgatctactatgtgcctgcctacctgacctctaagatcgatccaaccacaggcttcgccaatctgttttatatgaagtgtgagaacgtggagaagtccaagagattctttgacggctttgatttcatcaggttcaacgccctggagaacgtgttcgagttcggctttgactaccggagcttcacccagagggcctgcggcatcaattccaagtggaccgtgtgcaccaacggcgagcgcatcatcaagtatcggaatccagataagaacaatatgttcgacgagaaggtggtggtggtgaccgatgagatgaagaacctgtttgagcagtacaagatcccctatgaggatggcagaaatgtgaaggacatgatcatcagcaacgaggaggccgagttctaccggagactgtataggctgctgcagcagaccctgcagatgagaaacagcacctccgacggcacaagggattacatcatctcccctgtgaagaataagagagaggcctacttcaacagcgagctgtccgacggctctgtgccaaaggacgccgatgccaacggcgcctacaatatcgccagaaagggcctgtgggtgctggagcagatcaggcagaagagcgagggcgagaagatcaatctggccatgaccaacgccgagtggctggagtatgcccagacacacctgctgaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatcctacccatacgatgttccagattacgcttatccctacgacgtgcctgattatgcatacccatatgatgtccccgactatgcctaa

SEQ ID NO.6 crRNA序列(人工合成)

SEQ ID NO.7引物序列(人工合成)

实施例1：pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR质粒构建

(1)利用PCR方法，在引物上设置相应突变N512R+K518V+N522R，pY011(pcDNA3.1-hLb2Cas12a)载体上扩增含RVR突变位点的序列，将扩增后的片段与骨架通过ClonExpressII One Step Cloning Kit得到突变后载体pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR。

(2)质粒构建实验中所用到的PCR体系如下：

Template:10ng；Forward Primer:(10μM)1μl；Reverse Primer:(10μM)1μl；

dNTP:0.5μl；DNA polymerase(Vazyme,P501):0.5μl；5x Buffer:10μl；RNase-Water补齐至50μl。

PCR程序如下：

95℃，3min；95℃，15sec,60℃，15sec,72℃，1min；35cycles；72℃，3min。

本实施例的一种Lb2Cas12a-RVR基因编辑工具的应用方法：

步骤33：包括构建针对某致病基因DNA靶点的crRNA，在真核细胞中共引入crRNA和Lb2Cas12a-RVR表达载体，使其在靶位点发生原位修复；

步骤34：构建评估Lb2Cas12a-RVR编辑活性、效率和保真性的GFP报告系统，其利用的GFP基因序列为SEQ ID NO.4；

步骤35：构建Lb2Cas12a-RVR基因修复模板RS1-GFP细胞系，其利用的RS1-GFP基因序列为SEQ ID NO.5；

上述改进具体为：SEQ ID NO.4 GFP序列(人工合成)

ctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcgataa

SEQ ID NO.5 RS1-GFP序列(人工合成)

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实施例2：pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR活性测试GFP报告系统的建立

(1)构建pSin-GFP慢病毒载体，其包含GFP基因(如SEQ ID NO.4所示)，IRES和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因。pSin-GFP和辅助质粒共转HEK-293T细胞，收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤，分装后于-80℃保存备用。

(2)HEK-293细胞复苏：把冻存HEK-293细胞的管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，待液体完全融化后(大概1～1.5min)，取出用75％的酒精擦拭消毒后放置于超净工作台；把上述细胞悬液转移至装有5ml培养基的15ml的离心管中，1500rpm，离心5min；弃上清，加1ml培养基重悬细胞。转移至装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布在培养皿中；

标好细胞种类和日期、培养人姓名等，放到37℃，5％的CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后更换培养基。完全培养基的配制：DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％Pen./Strep.(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)

(3)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于6孔板，调整细胞密度为3.0×105个细胞/孔；根据慢病毒滴度测定结果，感染适量的慢病毒pSin-GFP，同时加终浓度为4μg/ml的polybrene；感染慢病毒12h后换液，48h后传代到10cm皿，用1μg/ml浓度的抗生素Puromycin筛选；10d后，在显微镜下挑取单克隆细胞，获得整合有RS1-GFP基因的单克隆HEK-293-GFP细胞系。

(4)单克隆HEK-293-GFP细胞扩大培养，该克隆中GFP基因的拷贝数经过qPCR检测，确定为单拷贝,即HEK-293-SC1细胞。

辅助质粒为pVSVg和psPAX2(申请人实验室保存)。

慢病毒pSin-GFP，保存于-80℃。

实施例3：pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR在特定位点效率的测定

(1)pJET-U6-sgRNA设计：在GFP基因序列的不同位点，根据后续评估要求设计crRNA；

(2)HEK-293-SC1细胞计数后接种于12孔板，每孔的细胞密度为1.8×105个细胞/孔；

(3)细胞生长24h后通过转染试剂TurboFect(Thermo Fisher,#R0531)转染pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR(750ng)和pJET-U6-crRNA(250ng)；

(4)真核细胞转染方法：将需要转染的质粒按比例混合好后，再混入含有1.5μl转染试剂Turbofect的50μl DMEM，吹打混匀，并在室温放置15min后，加入含有1ml DMEM(Gibco,C11995500CP)+10％FBS(Gibco,16000 044)培养基，和1.8×105个细胞/孔的HEK-293-SC1细胞的12孔板中进行转染。

(5)转染后24h更换新鲜的培养基，48h后收集细胞，通过流式细胞术检测绿色荧光细胞的比率，根据比率判断Lb2Cas12a-RVR在特定位点的可用性。

实施例4：Lb2Cas12a-RVR基因修复模板RS1-GFP细胞系的建立

1、重组载体pSin-RS1-GFP的构建方法为：

通过PCR扩增RS1-GFP基因(如SEQ ID NO.5所示)，克隆到pSin-EF2-LIN28-Pur载体上，得到重组pSin-RS1-GFP载体。

pSin-EF2-LIN28-Pur载体的制备方法见http://www.addgene.org/16580，为已知技术。

2、获得整合有RS1-GFP基因的单克隆HEK-293细胞系的方法为：

(1)HEK-293细胞计数后接种于6孔板，每孔的细胞密度为3.0×105个细胞/孔；

(2)细胞生长24h后，在6孔板中加入适量的慢病毒pSin-RS1-GFP，同时加终浓度为4μg/ml的聚凝胺(polybrene)；

(3)HEK-293细胞感染慢病毒pSin-RS1-GFP 12h后换液，48h后传代，稀释后接种到10cm皿，用浓度为1μg/ml的抗生素嘌呤霉素(Puromycin)筛选；

(4)10天后，在显微镜下挑选单克隆细胞，获得整合有RS1-GFP基因的单克隆HEK-293-RS1-GFP细胞系。

实施例5：pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR在X连锁视网膜劈裂症致病基因的原位同源重组修复(a.Sanger测序检测结果 b.HDR修复比率 c.单克隆 Sanger测序检测结果)；

(1)构建同源重组修复模板质粒pSin-EGFP-iires-puro-RS1，其包含不含启动子的GFP(绿色荧光蛋白)和Puro基因以及X连锁视网膜劈裂症致病基因RS1。其中，在RS1基因的3’端含有终止密码子；

(2)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293-RS1-GFP细胞计数后接种于12孔板，调整细胞密度为0.5×105个细胞/孔，37℃，5％CO2培养箱内培养；24h后将针对RS1致病基因DNA靶点的crRNA和Lb2Cas12a-RVR表达载体共转入HEK-293细胞中，轻轻摇晃混匀；放置在37℃，5％CO2培养箱内培养24h后更换新鲜培养基，48h后可观察到细胞RS1基因修复后恢复绿色荧光的细胞；第3天收集细胞，并抽提细胞基因组DNA，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量测序DNA文库，并进行高通量测序。同时将基因组DNA的PCR产物通过T4连接酶(NEB)连接到pJET载体上，并进行转化，第二天挑取20个左右的单克隆，进行Sanger测序。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法

<130> 2019-7-10

<140> 2020100424061

<141> 2020-04-23

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3756

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtactatg agtccctgac caagcagtac cccgtgtcta agacaatccg gaatgagctg 60

atccctatcg gcaagacact ggataacatc cgccagaaca atatcctgga gagcgacgtg 120

aagcggaagc agaactacga gcacgtgaag ggcatcctgg atgagtatca caagcagctg 180

atcaacgagg ccctggacaa ttgcaccctg ccatccctga agatcgccgc cgagatctac 240

ctgaagaatc agaaggaggt gtctgacaga gaggatttca acaagacaca ggacctgctg 300

aggaaggagg tggtggagaa gctgaaggcc cacgagaact ttaccaagat cggcaagaag 360

gacatcctgg atctgctgga gaagctgcct tccatctctg aggacgatta caatgccctg 420

gagagcttcc gcaactttta cacctatttc acatcctaca acaaggtgcg ggagaatctg 480

tattctgata aggagaagag ctccacagtg gcctacagac tgatcaacga gaatttccca 540

aagtttctgg acaatgtgaa gagctatagg tttgtgaaaa ccgcaggcat cctggcagat 600

ggcctgggag aggaggagca ggactccctg ttcatcgtgg agacattcaa caagaccctg 660

acacaggacg gcatcgatac ctacaattct caagtgggca agatcaactc tagcatcaat 720

ctgtataacc agaagaatca gaaggccaat ggcttcagaa agatccccaa gatgaagatg 780

ctgtataagc agatcctgtc cgatagggag gagtctttca tcgacgagtt tcagagcgat 840

gaggtgctga tcgacaacgt ggagtcttat ggcagcgtgc tgatcgagtc tctgaagtcc 900

tctaaggtga gcgccttctt tgatgccctg agagagtcta agggcaagaa cgtgtacgtg 960

aagaatgacc tggccaagac agccatgagc aacatcgtgt tcgagaattg gaggaccttt 1020

gacgatctgc tgaaccagga gtacgacctg gccaacgaga acaagaagaa ggacgataag 1080

tatttcgaga agcgccagaa ggagctgaag aagaataaga gctactccct ggagcacctg 1140

tgcaacctgt ccgaggattc ttgtaacctg atcgagaatt atatccacca gatctccgac 1200

gatatcgaga atatcatcat caacaatgag acattcctgc gcatcgtgat caatgagcac 1260

gacaggtccc gcaagctggc caagaaccgg aaggccgtga aggccatcaa ggactttctg 1320

gattctatca aggtgctgga gcgggagctg aagctgatca acagctccgg ccaggagctg 1380

gagaaggatc tgatcgtgta ctctgcccac gaggagctgc tggtggagct gaagcaggtg 1440

gacagcctgt ataacatgac cagaaattat ctgacaaaga agcctttctc taccgagaag 1500

gtgaagctga actttaatcg cagcacactg ctgcgcggct gggatcggaa tgtggagaca 1560

gaccgcctgg gcgtgctgct gctgaaggac ggcaagtact atctgggcat catgaacaca 1620

agcgccaata aggccttcgt gaatccccct gtggccaaga ccgagaaggt gtttaagaag 1680

gtggattaca agctgctgcc agtgcccaac cagatgctgc caaaggtgtt ctttgccaag 1740

agcaatatcg acttctataa cccctctagc gagatctact ccaattataa gaagggcacc 1800

cacaagaagg gcaatatgtt ttccctggag gattgtcaca acctgatcga cttctttaag 1860

gagtctatca gcaagcacga ggactggagc aagttcggct ttaagttcag cgatacagcc 1920

tcctacaacg acatctccga gttctatcgc gaggtggaga agcagggcta caagctgacc 1980

tatacagaca tcgatgagac atacatcaat gatctgatcg agcggaacga gctgtacctg 2040

ttccagatct ataataagga ctttagcatg tactccaagg gcaagctgaa cctgcacaca 2100

ctgtatttca tgatgctgtt tgatcagcgc aatatcgacg acgtggtgta taagctgaac 2160

ggagaggcag aggtgttcta taggccagcc tccatctctg aggacgagct gatcatccac 2220

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accttcagct acgacatcgt gaaggataag cggtatagca aggataagtt taccctgcac 2340

atccccatca caatgaactt cggcgtggat gaggtgaagc ggttcaacga cgccgtgaac 2400

agcgccatcc ggatcgatga gaatgtgaac gtgatcggca tcgaccgggg cgagagaaat 2460

ctgctgtacg tggtggtcat cgactctaag ggcaacatcc tggagcagat ctccctgaac 2520

tctatcatca ataaggagta cgacatcgag acagattatc acgcactgct ggatgagagg 2580

gagggcggca gagataaggc ccggaaggac tggaacaccg tggagaatat cagggacctg 2640

aaggccggct acctgagcca ggtggtgaac gtggtggcca agctggtgct gaagtataat 2700

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gtgcctgcct acctgacctc taagatcgat ccaaccacag gcttcgccaa tctgttttat 3000

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ctgcagatga gaaacagcac ctccgacggc acaagggatt acatcatctc ccctgtgaag 3420

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aaaaagggat cctacccata cgatgttcca gattacgctt atccctacga cgtgcctgat 3720

tatgcatacc catatgatgt ccccgactat gcctaa 3756

<210> 2

<211> 1569

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2