具有混合糖同步发酵能力的重组微生物及利用其的二醇的生成方法

文档序号：1301699 发布日期：2020-08-07 浏览：33次 >En<

阅读说明：本技术 具有混合糖同步发酵能力的重组微生物及利用其的二醇的生成方法 (Recombinant microorganism having ability to synchronously ferment mixed sugars and method for producing diol using same ) 是由朴钟明切拉杜莱·拉希纳辛格宋孝鹤于 2018-11-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及如下的重组微生物,即,对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力,并且,具有二醇生成能力。(The present invention relates to a recombinant microorganism having a capability of simultaneous fermentation of two or more sugars in a lignocellulose saccharification liquid and a capability of producing a diol.)

技术领域

本发明涉及具有混合糖同步发酵能力的重组微生物及利用其的二醇的生成方法。

背景技术

二醇不仅是在工业上广泛使用的化合物，还是用作多种化学中间体的化合物，其效用很高。例如，2，3-丁二醇为可用作1，3-丁二烯(1，3-Butadiene)和甲基乙基酮(Methylethyl ketone，MEK)的前体(Precursor)的工业上的潜在性非常高的化学物质，上述1，3-丁二烯为合成橡胶(Synthetic rubber)的主要原料物质，上述甲基乙基酮为溶剂。并且，2，3-丁二醇的冰点非常低，可直接只用作防冻剂(Antifreezing agent)，辛烷值(Octanenumber)高，可与现有的汽油(Gasoline)混合来用作辛烷值促进剂(octane booster)。并且，1，3-丙二醇可用作聚酯或聚氨酯等高分子单体，并且，可用作化妆品及个人卫生用品等的用于改善性质的添加剂。尤其，在通过1，3-丙二醇与对苯二甲酸(terephthalic acid)的聚合反应生成的直线性的芳香族聚酯——聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT，polytrimethyleneterephthalate)中，在高分子链上具有在半晶体(semi-crystal)分子结构上产生的称为纽结(kink)的独特的扭曲，因此，形态稳定性优秀，由于这种结构特性，可适用于纤维、包装及薄膜、无纺布结构物、工程塑料等多种领域。

上述二醇可通过化学合成工序或微生物发酵工序生成。但是，化学合成工序具有在工序过程中产生环境污染物质或合成费用高的问题。另一方面，通过从可再生的资源发酵微生物来生成二醇的工序具有环保优点，但是，当用于工业上时，具有谷物价格的上升、菌株的发酵收率低、生产率低等的问题。

例如，在利用纤维素类生物质(树、油棕空果串(empty fruit bunch，EFB)、玉米秸秆，稻草等的木本生及草本生(以下，统称为“木质纤维素”))的情况下，这些为非食用生物质，因此，可不与食用生物质(谷物等)竞争，能够以低价生产，作为工业用生物原料具有优势。但是，在来源于木质纤维素的生物质中，混合有戊糖及己糖，微生物通过降解物阻遏(降解产物阻遏)机制先将己糖用于代谢，之后，将戊糖用于代谢。因此，糖消耗速度慢，发酵时间增加，生产率降低。并且，在发酵液中残存如木糖的戊糖的情况下，难以分离及纯化二醇。

因此，在研究可有效利用木质纤维素生物质来进行代谢的微生物的过程中，本发明人发明了具有优秀的戊糖及己糖的同步发酵能力的重组微生物。

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于，提供具有优秀的戊糖及己糖同步发酵能力的重组微生物。

本发明的另一目的在于，通过利用上述重组微生物来生成二醇。

用于解决问题的方案

为了实现上述目的，本发明提供一种重组微生物，对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力，并且，具有二醇生成能力。

并且，本发明提供一种二醇的生成方法，包括：准备包含两种以上的糖的培养基的步骤；在上述培养基接种上述重组微生物的步骤；以及培养上述重组微生物的步骤。

发明效果

本发明提供具有混合糖同步发酵能力的微生物及利用其的二醇的生成方法。

附图说明

图1简要示出产酸克雷伯氏菌的己糖及戊糖的代谢途径。

图2示出保藏编号为KCTC 12132BP的产酸克雷伯氏菌的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图3示出比较例1的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图4示出实施例1的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图5示出实施例2的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图6示出实施例3的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图7示出实施例4的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图8示出实施例5的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图9示出实施例6的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图10示出实施例7的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图11示出实施例8的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图12示出实施例9的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。

图13为利用模拟液来分批发酵比较例1的重组菌株的结果。

图14为利用模拟液来分批发酵实施例3的重组菌株的结果。

图15为利用来源于紫芒的糖化液来分批发酵实施例3的重组菌株的结果。

图16为利用来源于树的糖化液来分批发酵实施例3的重组菌株的结果。

图17为利用模拟液来分批补料发酵比较例1的重组菌株的结果。

图18为利用模拟液来分批补料发酵实施例3的重组菌株的结果。

图19为利用来源于树的糖化液来分批补料发酵实施例3的重组菌株的结果。

附图标记说明：

■：葡萄糖

◆：木糖

●：2，3丁二醇

▲：乳酸。

具体实施方式

本发明涉及一种重组微生物，对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有的同步发酵能力，并且，具有二醇生成能力。

并且，本发明涉及一种二醇的生成方法，包括：准备包含两种以上的糖的培养基的步骤；在上述培养基接种上述重组微生物的步骤；以及培养上述重组微生物的步骤。

以下，详细说明本发明。

木质纤维素糖化液

本发明的重组微生物对木质纤维素糖化液具有耐性，并且，对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力。上述木质纤维素糖化液为对木质纤维素原料(例如，树、油棕空果串、玉米秸秆，甘蔗秸秆、芦苇、紫芒、稻草等)进行水解的水解产物，优选地，为对木质纤维素原料进行水解并去除木质素后剩余的水解产物。上述木质纤维素糖化液中包含混合糖，上述混合糖包含两种以上的糖。优选地，上述糖化液中包含葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、纤维二糖等戊糖、葡萄糖等己糖及二糖类，尤其，葡萄糖及木糖的含量高。

木质纤维素糖化液耐性

本发明的重组微生物对木质纤维素糖化液具有耐性。对木质纤维素糖化液具有耐性意味着上述重组微生物可在包含糖化液的培养基中生长，微生物的生长不被糖化液中的成分抑制。

同步发酵能力

本发明的重组微生物对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力。同步发酵能力意味着一种糖不会先于另一种糖发酵。本发明的重组微生物对于两种以上的糖具有同步发酵能力，因此，在成为同步发酵能力的目标的糖之间，防止一种糖妨碍另一种糖的代谢的现象(即，降解物阻遏(降解产物阻遏))。

重组微生物的同步发酵能力

本发明的重组微生物对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力。优选地，本发明的重组微生物具有选自由木糖、阿拉伯糖及纤维二糖组成的组中的一种以上的糖和葡萄糖的同步发酵能力。更优选地，本发明的重组微生物对于木糖的同步发酵率为90％以上，优选地，本发明的重组微生物对于木糖的同步发酵率为95％以上。

同步发酵率(％)＝[(总投入糖(g)－发酵后总残留糖(g))/总投入糖(g)]×100

例)木糖同步发酵率(％)

木糖同步发酵率＝[(总投入木糖量(g)－发酵后残留木糖量(g))/(总投入木糖量(g))]×100

二醇

本发明的二醇为碳数为5以下的二醇。优选地，本发明的二醇为丁二醇，更优选地，本发明的二醇为2，3-丁二醇。

重组微生物

本发明涉及一种，对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力，并且，具有二醇生成能力。上述重组微生物对于木质纤维素糖化液具有耐性，更优选地，对于木质纤维素糖化液中的微生物生长抑制物质具有耐性。并且，上述重组微生物具有己糖及戊糖的同步发酵能力，优选地，具有葡萄糖及木糖的同步发酵能力。

优选地，上述重组微生物为重组克雷伯菌属(Klebsiella)。更优选地，本发明的重组微生物为重组产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

相比于野生型微生物，本发明的重组微生物可以抑制降解产物(catabolite)阻遏机制。优选地，相比于野生型微生物，本发明的重组微生物更加抑制磷酸转移酶系统(PTS，Phosphotransferase system)的葡萄糖特异性磷酸转移酶IIA组分(Glucose-specificphosphotransferase enzyme IIA component of PTS)或葡萄糖特异性磷酸转移酶IIBC组分(Glucose-specific phosphotransferase enzyme IIBC component of PTS)。

相比于野生型微生物，本发明的重组微生物可以为更加增强将木糖通过木酮糖(xylulose)转换为木酮糖-5-P或核酮糖(Ribulose)-5-P或核糖(Ribose)-5-P或果糖(Fructose)-6-P或赤藓糖-4-P(erythrose-4-P)或甘油醛(Glyceraldehyde)-3-P的途径的重组微生物。优选地，在本发明的重组微生物为增强选自由木糖异构酶、木酮糖激酶、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶、核糖5-磷酸异构酶、转醛醇酶及转酮醇酶组成的组中的一种以上的酶的活性的重组微生物。

优选地，在本发明的重组微生物抑制环磷酸腺苷(cAMP，cyclic adenosinemonophosphate)的受体蛋白的环磷酸腺苷受体活性。更优选地，在本发明的重组微生物中，对环磷酸腺苷激活的全局转录因子进行编码的基因产生突变，由此抑制上述基因表达，或者突变的基因过表达而抑制环磷酸腺苷受体活性。

优选地，在本发明的重组微生物中，需抑制将丙酮酸转换为乳酸的途径。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)控制丙酮酸向乳酸转换。可通过抑制上述乳酸脱氢酶来抑制将丙酮酸转换为乳酸的途径。上述乳酸脱氢酶的抑制可通过乳酸脱氢酶的表达抑制、乳酸脱氢酶活性抑制等来实现。例如，可使作为对乳酸脱氢酶进行编码的基因的乳酸脱氢酶A(ldhA)缺失，或者使上述基因产生突变(使一部分碱变异、取代或删除或者导入一部分碱来抑制正常基因表达等的突变)，或者普通技术人员可选择转录过程或翻译过程中的基因表达控制等适当的方法来抑制乳酸脱氢酶。

并且，优选地，在本发明的重组微生物中，需抑制将丙酮酸转换为乙酰辅酶A及甲酸的途径。丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)在兼性厌氧条件下催化将丙酮酸转换为乙酰辅酶A和甲酸(途径1)。

途径1

丙酮酸→乙酰辅酶A+甲酸

可通过抑制上述丙酮酸甲酸裂解酶来抑制将丙酮酸转换为乙酰辅酶A的途径及转换为甲酸的途径。上述丙酮酸甲酸裂解酶的抑制可通过丙酮酸甲酸裂解酶的表达抑制、丙酮酸甲酸裂解酶的酶活性抑制等实现。例如，可使作为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因的甲酸裂解酶B(pflB)缺失，或者使上述基因产生突变(使一部分碱变异、取代或删除或者导入一部分碱来抑制正常基因表达等的突变)，或者普通技术人员可选择转录过程或翻译过程中的基因表达控制等适当的方法来抑制丙酮酸甲酸裂解酶。

图1示出本发明的重组产酸克雷伯氏菌中的与野生型菌株相比更加增强或抑制的途径及用于控制上述途径的酶的基因。为了减少如乳酸(lactate)、甲酸(formate)、乙醇(ethanol)的副产物，去除了乳酸脱氢酶A、甲酸裂解酶B基因。抑制了参与降解产物(catabolite)阻遏机制的途径(crr、ptsG、crp)，扩增表达参与木糖(戊糖)的提取(uptake)及代谢的途径(xylA、xylB、rpe、rpiA、tktAB、talB)。

包含两种以上的糖的培养基

优选地，包含两种以上的糖的培养基为包含来源于木质纤维素的糖化液的培养基。上述培养基可包含选自由木糖、阿拉伯糖及纤维二糖组成的组中的一种以上的糖和葡萄糖。此时，可包含5.5：4.5至9：1的重量比的糖化液中的葡萄糖和木糖，优选地，可包含5.5：4.5至8.0：2.0的重量比的糖化液中的葡萄糖和木糖。

重组微生物的二醇生成能力

通过下述方式计算本发明的重组微生物的二醇生成能力。

-二醇生产率(g/L/h)：单位时间、单位体积生成的二醇量

(此时，在分批方法及分批补料方法中，二醇生产率以指数生长期(exponentialphase)为基准，在连续培养中，以在总相(phase)中生成的累积的二醇量为基准计算。)

-2，3-丁二醇生产率(g/L/h)：单位时间、单位体积生成的2，3-丁二醇量(此时，在分批方法及分批补料方法中，2，3-丁二醇生产率以指数生长期为基准，在连续培养中，以在总相中生成的累积的2，3-丁二醇量为基准计算)

-收率(％)：[2，3-丁二醇生成量(g)/碳源(g)]×100

-浓度(g/L)：单位体积生成的代谢产物的量

发明实施方式

参照详细后述的实施例及附图，就能明确本发明的优点、特征及实现这些优点及特征的方法。但是，本发明并不局限于以下所公开的实施例，而是能够以互不相同的多种形态体现，本实施例只用于使本发明的公开更加完整，并为了向本发明所属技术领域的普通技术人员完整地告知本发明的范畴而提供，本发明仅由发明要求保护范围来定义。

材料及方法

野生型菌株使用保藏编号为KCTC 12132BP的产酸克雷伯氏菌菌株(2012年2月8日保藏，韩国生命工程研究院)。

通过液相色谱法分析糖。此时，所使用的流动相为0.01N的H2SO4溶液，所使用的柱为Bio-Rad公司的Aminex87H。

通过下述方法制备在本发明的实验例中使用的来源于树的糖化液。

切碎废木材并添加到包含70％的硫酸的官能团，之后，在约100℃左右的温度条件下搅拌30分钟并进行反应，由此进行预处理。向预处理的浆料添加适当量的水来进行水解。通过上述方式水解的溶液包含来源于纤维素(cellulose)及半纤维素(hemicelluloses)的葡萄糖、木糖，由此，以多种糖的混合物形态存在(以下，将上述糖的混合物称为“混合糖”)。若利用压滤机将上述水解溶液压缩至约3bar，则液中包含混合糖，在过滤器的内部中，将木质素分离成固体。利用阴离子交换树脂从通过上述方式从水解溶液去除木质素并剩余的溶液(包含有)分离硫酸，并生成具有约100g/L的混合糖浓度的来源于树的糖化液。再次浓缩通过上述方式生成的来源于树的糖化液，使得混合糖浓度成为约200g/L，将上述浓缩物用作用于连续培养的培养液。

通过下述方法制备在本发明的实验例中使用的来源于紫芒的糖化液。

切碎紫芒并添加到包含70％的硫酸的官能团，在约100℃的温度条件下搅拌30分钟并进行反应，由此进行预处理。向预处理的浆料添加适当量的水来进行水解。通过上述方式水解的溶液包含来源于纤维素及半纤维素的葡萄糖、木糖，由此，以多种糖的混合物形态存在(以下，将上述糖的混合物称为“混合糖”)。利用阴离子交换树脂从上述水解溶液(包含有混合糖)分离硫酸，并生成具有约100g/L的混合糖浓度的来源于紫芒的糖化液。再次浓缩通过上述方式生成的来源于紫芒的糖化液，使得混合糖浓度成为约200g/L，将上述浓缩物用作用于连续培养的培养液。

实验例1：制备重组菌株

比较例1：制备产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B

为了克隆产酸克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增作为靶基因的乳酸脱氢酶A(序列1)和甲酸裂解酶B(序列2)的同源部位(表1)。

此时，为了提高靶基因的重组概率，所扩增的脱氧核糖核酸(DNA)片段可包含抗生素耐性基因等，为了之后去除染色体中重组的抗生素耐性基因，还可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的果聚糖蔗糖转移酶(sacB)基因。

表1

通过电穿孔法(electroporation，25uF，200Ω，18kV/cm)向保藏编号为KCTC12132BP的产酸克雷伯氏菌传递所制备的上述脱氧核糖核酸片段。此时，通过传递包含乳酸脱氢酶A基因的同源部位的脱氧核糖核酸片段来制备了去除乳酸脱氢酶A基因的重组产酸克雷伯氏菌。之后，向去除上述乳酸脱氢酶A基因的重组产酸克雷伯氏菌传递包含甲酸裂解酶B基因的同源部位的脱氧核糖核酸片段。

结果，制备了去除作为靶基因的乳酸脱氢酶A及甲酸裂解酶B的重组产酸克雷伯氏菌(产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B)。

实施例1：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶BΔcrr

为了克隆产酸克雷伯氏菌的葡萄糖特异性磷酸转移酶IIA组分，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的crr(序列3)的同源部位。

表2

此时，为了提高靶基因的重组概率，所扩增的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基因等，为了之后去除染色体中重组的抗生素耐性基因，还可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的果聚糖蔗糖转移酶基因。

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)向比较例1的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B传递包含所制备的上述crr基因的同源部位的脱氧核糖核酸片段。

结果，制备了还去除作为靶基因的crr的重组产酸克雷伯氏菌(产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶BΔcrr)。

实施例2：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶BΔptsG

为了克隆产酸克雷伯氏菌的磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性磷酸转移酶IIBC组分，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的ptsG(序列4)的同源部位(表3)。

表3

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)向比较例1的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B传递包含所制备的上述ptsG基因的同源部位的脱氧核糖核酸片段。

结果，制备了去除作为靶基因的ptsG的重组产酸克雷伯氏菌(产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶BΔptsG)。

实施例3：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-xylAB

制备过表达质粒

为了制备扩增产酸克雷伯氏菌的靶基因表达的重组载体，在包含限制酶位点、多克隆位点(Multiple cloning site)及氯霉素耐性基因的pBBR1MCS(Kovach et al.，Biotechniques，800-802，1994)质粒克隆所要扩增的基因。在细菌克隆相应质粒后，在细胞中，通过质粒的复制机制扩增基因表达。

为了克隆对产酸克雷伯氏菌的D-木糖异构酶(xylose isomerase)进行编码的基因(xylA，序列5)和对木酮糖激酶(xylulokinase)进行编码的(xylB，序列6)，利用聚合酶链式反应分别扩增作为靶基因的xylA及xylB。此时，通过使用包含存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)的引物进行扩增(表4)。

表4

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含各自的基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶(T4 DNA ligase)将2个上述片段接合，由此制备pGSC-xylAB质粒。

扩增木糖异构酶和木酮糖激酶的表达

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-xylAB质粒。由此，制备了扩增xylAB基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-xylAB。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下对上述产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-xylAB进行1小时的培养并使其稳定化。并且，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散(spreading)并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落(Colony)。并且，小量纯化(Miniprep)被选出的菌落所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实施例4：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-rpe制备过表达质粒

为了制备扩增产酸克雷伯氏菌的靶基因表达的重组载体，在包含限制酶位点、多克隆位点及氯霉素耐性基因的pBBR1MCS(Kovach et al.，Biotechniques，800-802，1994)质粒克隆所要扩增的基因。在细菌克隆相应质粒后，在细胞中，通过质粒的复制机制扩增基因表达。

为了克隆对产酸克雷伯氏菌的D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase)的基因(rpe，序列7)，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的rpe。此时，通过使用包含存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)的引物进行扩增(表5)。

表5

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含上述rpe基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶接合来制备pGSC-rpe质粒。

扩增D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶的表达

通过电穿孔法(25uF，20Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-rpe质粒。由此，制备了扩增rpe基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-rpe。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下对上述产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-rpe进行1小时的培养并使其稳定化。并且，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落。并且，小量纯化被选出的菌落所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实施例5：制备产酸克雷氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-rpiA

制备过表达质粒

为了扩增对产酸克雷伯氏菌的核糖5-磷酸异构酶(ribose 5-phosphateisomerase)进行编码的基因(rpiA，序列8)，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的rpiA。此时，通过使用包含存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)的引物进行扩增(表6)。

表6

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含上述rpiA基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶接合来之二比pGSC-rpiA质粒。

扩增核糖5-磷酸异构酶的表达

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-rpiA质粒。由此，制备了扩增rpiA基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-rpiA。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下对上述产酸克在雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-rpiA进行1小时的培养并稳定化。并且，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落。并且，小量纯化被选出的菌落所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实施例6：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-talB制备过表达质粒

为了克隆对产酸克雷伯氏菌的转醛醇酶B(transaldolase B)进行编码的基因(talB，序列9)，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的talB。此时，通过使用包含存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)的引物进行扩增(表7)。

表7

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含上述talB基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶接合来制备pGSC-talB质粒。

扩增转醛醇酶B的表达

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-talB质粒。由此，制备了扩增talB基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-talB。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下对上述产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-talB进行1小时的培养并使其稳定化。并且，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落。并且，小量纯化被选出的菌落所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实施例7：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-tktAB制备过表达质粒

为了同时克隆对产酸克雷伯氏菌的转酮醇酶(transketolase)进行编码的基因tktA(序列10)及tktB(序列11)(以下，称为“tktAB”)，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的tktAB(序列12)(表8)。此时，通过使用包含存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)的引物进行扩增。

表8

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含上述tktAB基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶接合来制备pGSC-tktAB质粒。

扩增转酮醇酶的表达

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-tktAB质粒。由此，制备了扩增talB基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-tktAB。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下对上述产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-tktAB进行1小时的培养并使其稳定化。并且，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散(spreading)并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落。并且，小量纯化被选出的菌落所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实施例8：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-crp(in)01

制备过表达质粒

制备用于扩增crp的一部分脱氧核糖核酸序列变更的基因表达的重组质粒，上述crp为对环磷酸腺苷-激活的全局转录因子(cAMP-activated global transcriptionfactor)进行编码的基因，上述环磷酸腺苷-激活的全局转录因子为来源于产酸克雷伯氏菌的环磷酸腺苷受体蛋白。

为了制备扩增产酸克雷伯氏菌的靶基因表达的重组载体，需在包含限制酶位点、多克隆位点、氯霉素耐性基因的pBBR1MCS(Kovach et al.，Biotechniques，800-802，1994)质粒克隆所要扩增的基因。在细菌克隆相应质粒后，在细胞中，通过质粒的复制机制扩增基因表达。

为了克隆对作为产酸克雷伯氏菌的环磷酸腺苷受体蛋白的环磷酸腺苷-激活的全局转录因子进行编码的基因——crp(in)01，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的crp(in)01(序列13)。上述crp(in)01基因为将crp基因的脱氧核糖核酸序列中的一部分变形的不同的基因，crp基因为参与降解产物阻遏(catabolite repression)的基因。一部分序列不同，因此，降解产物阻遏(catabolite repression)不进行工作，同时代谢葡萄糖(glucose)(C6)和木糖(xylose)(C5)，由此增加2，3-丁二醇的生产率。此时，在存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)，通过使用包含所变更的脱氧核糖核酸序列的引物进行扩增(表9)。

表9

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含上述crp(in)01基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶接合2个上述片段来制备pGSC-crp(in)01质粒。并且，将上述pGSC-crp(in)01质粒用作过表达质粒。

扩增环磷酸腺苷-激活的全局转录因子的表达

扩增对作为来源于产酸克雷伯氏菌的环磷酸腺苷-激活的全局转录因子进行编码的基因的crp(in)01的表达。

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-crp(in)01质粒。由此，制备了扩增crp(in)01基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-crp(in)01。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下对上述产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-crp(in)进行1小时的培养并使其稳定化，之后，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落。并且，小量纯化被选出的菌落所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实施例9：制备产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-crp(in)02

制备过表达质粒

制备用于扩增crp的一部分脱氧核糖核酸序列变更的基因表达的重组质粒，上述crp为对来源于产酸克雷伯氏菌的环磷酸腺苷-激活的全局转录因子进行编码的基因。

为了克隆对作为产酸克雷伯氏菌的环磷酸腺苷受体蛋白的环磷酸腺苷-激活的全局转录因子进行编码的基因——crp(in)02，利用聚合酶链式反应扩增作为靶基因的crp(in)02(序列14)。上述crp(in)02基因为crp基因的脱氧核糖核酸序列中的一部分变形的不同的基因，上述crp基因为参与降解产物阻遏(catabolite repression)的基因。一部分序列不同，因此，降解产物阻遏不进行工作，同时代谢葡萄糖(C6)和木糖(C5)，由此增加2，3-丁二醇的生产率。此时，在存在于质粒的多克隆位点的限制酶位点(XbaI、ApaI等)，通过使用包含所变更的脱氧核糖核酸序列的引物进行扩增(表10)。

表10

利用位于多克隆位点的限制酶相同地处理包含上述crp(in)02基因的脱氧核糖核酸片段和质粒，之后，利用T4脱氧核糖核酸连接酶接合2个上述片段来制备pGSC-crp(in)02质粒。并且，将上述pGSC-crp(in)02质粒用作过表达质粒。

扩增环磷酸腺苷-激活的全局转录因子的表达

扩增作为对俩源于产酸克雷伯氏菌的环磷酸腺苷-激活的全局转录因子进行编码的基因的crp(in)02的表达。

通过电穿孔法(25uF，200Ω，18kV/cm)在比较例1的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B克隆所制备的上述pGSC-crp(in)02质粒。由此，制备了扩增crp(in)02基因表达的作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-crp(in)02。

在执行电穿孔法后，在30℃的温度条件下，对上述产酸克雷伯氏菌Δ乳酸脱氢酶AΔ甲酸裂解酶B+pGSC-crp(in)02进行1小时的培养并使其稳定化，之后，在37℃的温度条件下，向包含氯霉素的LB复合固体培养基扩散并培养。之后，选出在包含氯霉素的固体培养基生长的菌落。并且，小量纯化被选出的菌落中所包含的质粒，并通过电泳确认是否克隆基因。

实验例2：评价分批发酵时的葡萄糖和木糖的同步发酵能力

对于作为野生型菌株的保藏编号为KCTC 12132BP的产酸克雷伯氏菌、比较例1及实施例1至9的重组产酸克雷伯氏菌，通过分批发酵评价葡萄糖和木糖的同步发酵能力。将这些菌株接种在包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，在37℃的温度条件下培养16小时后，将此培养液接种在3L的复合培养基，由此进行评价，发酵条件如下，即，微氧条件(micro-aerobic condition；微氧速度：1vvm，搅拌速度：550rpm)，60g/L的初始葡萄糖浓度，40g/L的初始木糖浓度，pH6.5，培养温度：37℃。在发酵过程中，为了调节pH，使用5N的NaOH。对于上述野生型及重组克雷伯菌属，在发酵过程中，提取样品，测定所提取的试样的OD600(光密度(optical density))来测定生长速度，在13000rpm的条件下，对所提取的试样进行10分钟的离心分离后，通过液相色谱法(HPLC)分析上清液的代谢产物及2，3-丁二醇的浓度。

此时，在实施例3至9的重组菌株的情况下，向培养基内添加25mg/L的氯霉素来执行发酵。

结果，实施例1至9的重组菌株具有优秀的葡萄糖和木糖的同步发酵能力。具体如下，即，野生型菌株通过降解产物阻遏代谢葡萄糖后代替木糖，发酵时间相当长(图2)。另一方面，比较例1的菌株通过降解产物(catabolite)的阻遏机制消耗葡萄糖后消耗木糖(图3)。实施例1及实施例2的重组菌株同时代谢葡萄糖和木糖(图4：实施例1，图5：实施例2)。在实施例3至实施例7的重组菌株的情况下，过表达与木糖代谢相关的基因，由此改善木糖的利用(图6：

实施例3，图7：实施例4，图8：实施例5，图9：实施例6，图10：实施例7)。实施例8及9的重组菌株也同时代谢葡萄糖和木糖，经判断，由于突变的crp基因的过表达，降解产物阻遏机制被抑制，从而同时代谢葡萄糖和木糖(图11：

实施例8，图12：实施例9)(表11)。并且，这些菌株的发酵副产物如下述表12。

表11

表12

实验例3：根据木质纤维素生物质种类的葡萄糖和木糖的同步发酵能力评价

对根据木质纤维素生物质的种类及糖化液中的糖比例的本发明的重组菌株的葡萄糖和木糖的同步发酵能力进行评价。

<3-1>评价利用模拟液时的葡萄糖和木糖的同步发酵能力

对于比较例1及实施例3的重组产酸克雷伯氏菌，通过利用模拟液的分批发酵评价葡萄糖和木糖的同步发酵能力。将这些菌株接种在包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，在37℃的温度条件下培养16小时，之后，将此培养液接种在3L的复合培养基，由此执行评价，发酵条件如下，即，微氧条件(微氧速度：1vvm，搅拌速度：550rpm)，60g/L的初始葡萄糖浓度，40g/L的初始木糖浓度，pH6.5，培养温度：37℃(以6：4的重量比混合葡萄糖：木糖)。在发酵过程中，为了控制pH，使用了5N的NaOH。对于上述野生型及重组克雷伯菌属，在发酵过程中提取样品，通过测定所提取的试样的OD600(光密度)来测定生长速度，在13000rpm的温度条件下，对所提取的试样进行10分钟的离心分离后，通过液相色谱法分析上清液的代谢产物及2，3-丁二醇的浓度。

此时，在实施例3的情况下，向培养基内添加25mg/L的氯霉素来执行发酵。

结果，在比较例1的菌株中，全部消耗葡萄糖和木糖需要46小时以上(图13)。相反，在实施例3的菌株中，全部消耗葡萄糖和木糖需要30小时(图14)，经确认，快速利用并代谢混合糖。

<3-2>评价利用来源于紫芒的糖化液时的葡萄糖和木糖的同步发酵能力

对于比较例1及实施例3的重组产酸克雷伯氏菌，通过利用紫芒的木质纤维素糖化液的分批发酵评价葡萄糖和木糖的同步发酵能力。将这些菌株接种在包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，在37℃的温度条件下培养16小时，之后，将此培养液接种在3L的复合培养基，发酵条件如下，即，微氧条件(微氧速度：1vvm，搅拌速度：550rpm)，100g/L的初始来源于紫芒的糖浓度，pH6.5，培养温度：37℃(以7：3的重量比包含葡萄糖：木糖，70g/L的葡萄糖，30g/L的木糖)。在发酵过程中，为了控制pH，使用了5N的NaOH。对于上述野生型及重组克雷伯菌属，在发酵过程中提取样品，通过测定所提取的试样的OD600(光密度)来测定生长速度，在13000rpm的条件下对所提取的试样进行10分钟的离心分离后，通过液相色谱法分析上清液的代谢产物及2，3-丁二醇的浓度。

结果，在实施例3的菌株中。全部消耗葡萄糖和木糖需要20小时(图15)，经确认，快速利用并代谢混合糖。

<3-3>评价利用来源于树的糖化液时的葡萄糖和木糖的同步发酵能力

对于比较例1及实施例3的重组产酸克雷伯氏菌，通过利用树的木质纤维素糖化液的分批发酵评价葡萄糖和木糖的同步发酵能力。将这些菌株接种在包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，在37℃的温度条件下培养16小时，之后，将此培养液接种在3L的复合培养基，由此执行评价，发酵条件如下，即，微氧条件(微氧速度：1vvm，搅拌速度：550rpm)，100g/L的初始来源于紫芒的糖浓度，pH6.5，培养温度：37℃(以7：3的重量比包含葡萄糖：木糖，70g/L的葡萄糖，30g/L的木糖)。在发酵过程中，为了控制pH，使用了5N的NaOH。对于上述野生型及重组克雷伯菌属，在发酵过程中提取样品，通过测定所提取的试样的OD600(光密度)来测定生长速度，在13000rpm的条件下对所提取的试样进行10分钟的离心分离后，通过液相色谱法分析上清液的代谢产物及2，3-丁二醇的浓度。

结果，在实施例3的菌株中，全部消耗葡萄糖和木糖需要22小时(图16)，经确认，快速利用并代谢混合糖。

实验例4：评价分批补料时的葡萄糖及木糖的同步发酵能力

<4-1>利用模拟液的分批补料培养

对于比较例1及实施例3的重组菌株，通过利用模拟液(以6:4的重量比混合葡萄糖：木糖)进行分批补料培养，由此评价葡萄糖及木糖的同步发酵能力。此时，培养方法如下，即，当葡萄糖或木糖的浓度降低至20g/L以下时，将50g/L的葡萄糖与木糖的混合液作为进料溶液(Feeding Solution)来投入，除此之外，与上述<3-1>相同。

结果，在比较例1的情况下，随着培养时间的推移，积聚木糖，在培养70小时之后，木糖量积聚到140g/L以上为止。生产83.5g/L的2，3-丁二醇，每小时生产率为1.67g/L/h(图17)。在实施例3的重组菌株的情况下，生产93g/L的2，3-丁二醇，每小时生产率为2.02g/L/h，收率为40％(与0.4g的2，3丁二醇(2，3-BDO)/g总糖量相同)。木糖未被积聚，而是与葡萄糖一同消耗(图18)。

<4-2>利用来源于树的糖化液的分批补料培养

对于实施例3的重组菌株，通过利用来源于树的糖化液(以7：3的重量比包含葡萄糖：木糖)来进行分批补料培养，由此评价葡萄糖及木糖的同步发酵能够力。此时，培养方法如下，即，当葡萄糖或木糖浓度降低至20g/L以下时，将50g/L的葡萄糖与木糖的混合液作为进料溶液来投入除此之外，与上述<3-3>相同。

结果，在实施例3的重组菌株的情况下，生产75g/L的2，3-丁二醇，没小时生产率为1.63g/L/h，收率为40％(与0.4g的2，3丁二醇/g总糖量相同)。木糖未被积聚，而是与葡萄糖一同消耗(图19)。

工业实用性

本发明涉及对于木质纤维素糖化液中的两种以上的糖具有同步发酵能力，并且具有二醇生成能力的重组微生物。

序列表文本

序列1：乳酸脱氢酶A的同源碱基序列。

序列2：甲酸裂解酶B的同源碱基序列。

序列3：crr的同源碱基序列。

序列4：ptsG的同源碱基序列。

序列5：xylA的碱基序列。

序列6：xylB的碱基序列。

序列7：rpe的碱基序列。

序列8：rpiA的碱基序列。

序列9：talB的碱基序列。

序列10：tktA的碱基序列。

序列11：tktB的碱基序列。

序列12：tktAB的碱基序列。

序列13：crp(in)01的碱基序列。

序列14：crp(in)02的碱基序列。

保藏信息

保藏机构：韩国生命工程研究院

保藏编号：KCTC12132BP

保藏日期：20120208

国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约

国际格式

对于原保藏的保藏证书

根据7.1发行

保藏人：SEUNG,Doyoung

地址：韩国大田广域市儒城区文旨洞104-4 GS加德士(GS Caltex Corporation)R&D中心

序列表

<110> GS 加德士

<120> 具有混合糖同步发酵能力的重组微生物及利用其的二醇的生成方法

<130> DOP180026PCT/US

<150> KR10-2017-0164591

<151> 2017-12-01

<160> 14

<170> PatentIn 版本 3.2

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 1

atgaaaatcg ctgtgtatag tacaaaacag tacgacaaga agtatctgca gcatgttaat 60

gatgcatatg gctttgaact ggagtttttt gacttcctgc taaccgaaaa aaccgccaaa 120

accgccaacg gctgtgaagc ggtgtgtatc ttcgtaaacg atgacggtag ccgcccggta 180

cttgaagaac tgaaagccca cggcgtgcag tacatcgcgc tgcgctgcgc ggggttcaac 240

aacgttgacc tcgatgccgc caaagagctg ggcctgcggg tggtgcgcgt cccggcctac 300

tcgccggaag cggtcgctga gcacgcgatc ggcatgatga tgtcgctgaa ccgccgcatt 360

caccgtgcct atcagcgcac ccgcgacgcg aacttctctc tggaagggct gaccggtttc 420

accatgcacg gtaaaaccgc cggcgttatt ggcaccggta aaatcggcgt cgccgcgctg 480

cgcattctta aaggcttcgg tatgcgtctg ctggcgtttg atccctaccc aagcgccgcc 540

gcgctggata tgggcgtgga gtatgtcgat cttgaaaccc tgtaccggga gtccgatgtt 600

atctcactgc actgcccact gaccgatgaa aactaccatt tgctgaacca tgccgcgttc 660

gatcgcatga aagacggggt gatgatcatc aacaccagcc gcggcgcgct catcgattcg 720

caggcagcga tcgacgccct gaagcatcag aaaattggcg cgctggggat ggacgtgtat 780

gagaacgaac gcgatctgtt ctttgaagat aagtctaatg acgtgattca ggatgatgtg 840

ttccgccgtc tctccgcctg ccataacgtc ctgtttaccg gtcaccaggc gtttctgacc 900

gcggaagcgt tgatcagcat ttcgcaaacc accctcgaca acctgcgtca agtggatgca 960

ggcgaaacct gtcctaacgc actggtctga 990

<210> 2

<211> 2283

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 2

atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60

cagaacgaag tcaacgtccg cgacttcatc cagaaaaact ataccccgta cgaaggtgac 120

gagtccttcc tggctggcgc aactgacgcg accaccaagc tgtgggacac cgtaatggaa 180

ggcgttaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgatacttc ccttgcatcc 240

accatcactt ctcatgacgc tggctacatc gagaaaggtc tcgagaaaat cgttggtctg 300

cagactgaag ctccgctgaa acgcgcgatt atcccgttcg gcggcatcaa aatggtcgaa 360

ggttcctgca aagcgtacga tcgcgagctg gacccgatgc tgaagaaaat cttcactgaa 420

taccgtaaaa ctcacaacca gggcgtgttt gacgtttaca ccaaagacat cctgaactgc 480

cgtaaatctg gtgttctgac cggtctgccg gatgcctatg gccgtggtcg tatcatcggt 540

gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gacttcctga tgaaagacaa atacgctcag 600

ttcgtttctc tgcaagagaa actggaaaac ggcgaagatc tggaagcaac catccgtctg 660

cgcgaagaaa tctctgaaca gcaccgcgcg ctgggtcaga tcaaagaaat ggcggctaaa 720

tatggctgcg atatctctgg tcctgctacc accgctcagg aagctatcca gtggacctac 780

ttcggttacc tggctgccgt aaaatctcag aacggcgcgg caatgtcctt cggtcgtacc 840

tccagcttcc tggacatctt catcgaacgt gacctgaaag ccggtaaaat caccgagcaa 900

gacgcacagg aaatgattga ccacctggtc atgaaactgc gtatggttcg tttcctgcgt 960

acccctgaat atgatgaact gttctctggc gacccgatct gggcaacaga atctatcggc 1020

ggtatgggcg ttgacggccg tactctggtc accaaaaaca gcttccgttt cctgaacacc 1080

ctgtacacca tggggccgtc tccggagccg aacatcacca ttctgtggtc tgaaaaactg 1140

ccgctgagct tcaaaaaata cgccgcgaaa gtgtccatcg atacctcttc tctgcagtac 1200

gagaacgatg acctgatgcg tcctgacttc aacaacgatg actacgctat cgcttgctgc 1260

gtaagcccga tggttgttgg taagcaaatg cagttcttcg gcgcgcgtgc taacctggcg 1320

aaaaccatgc tgtacgcaat caacggcggc gttgatgaaa aactgaaaat gcaggttggt 1380

cctaaatctg aaccgatcaa aggcgacgtt ctgaacttcg acgaagtgat ggaccgcatg 1440

gatcacttca tggactggct ggctaaacag tacgtcactg cgctgaacat catccactac 1500

atgcacgaca agtacagcta cgaagcttcc ctgatggcgc tgcacgaccg tgatgttatc 1560

cgcaccatgg catgtggtat cgcaggtctt tccgttgcgg ctgactccct gtctgcaatc 1620

aaatatgcga aagttaaacc gattcgtgac gaaaacggtc tggctgtcga cttcgaaatc 1680

gaaggcgaat acccgcagtt tggtaacaac gactctcgcg tcgatgatat ggccgttgac 1740

ctggttgaac gtttcatgaa gaaaattcag aaactgcaca cctaccgcaa cgctatcccg 1800

actcagtccg ttctgaccat cacctctaac gttgtgtatg gtaagaaaac cggcaacacc 1860

cctgacggtc gtcgcgctgg cgctccgttc ggaccaggtg ctaacccgat gcacggccgt 1920

gaccagaaag gcgctgttgc ctctctgacc tccgttgcaa aactgccgtt tgcttacgcg 1980

aaagatggta tttcttacac cttctctatc gtgccgaacg cgctgggtaa agacgacgaa 2040

gttcgtaaaa ctaacctcgc cggcctgatg gatggttact tccaccacga agcgtccatc 2100

gaaggcggtc agcatctgaa cgtcaacgtt atgaaccgcg aaatgctgct cgacgcgatg 2160

gaaaacccgg aaaaatatcc gcagctgacc atccgcgtat ccggctacgc agtacgtttt 2220

aactccctga ctaaagaaca gcagcaggac gttattactc gtaccttcac tcagaccatg 2280

taa 2283

<210> 3

<211> 510

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 3

atgggtttgt tcgataaatt gaaatctctg gtttctgatg acaaaaaaga caccggaact 60

attgagattg ttgccccgct ctctggcgag atcgtcaaca ttgaagacgt gccggatgta 120

gttttcgcgg aaaaaattgt gggtgatggc attgctatca aacctactgg caacaaaatg 180

gttgcgccgg tagatggtac catcggtaaa atttttgaaa ccaaccatgc tttttcaatc 240

gaatctgata gcggcattga actgttcgtt cacttcggta ttgataccgt tgaactgaaa 300

ggcgaaggct tcaaacgtat cgctgaagaa ggccagcgcg tgaaagtcgg cgacccggtt 360

atcgaattcg atctgccgct gctggaagag aaagccaagt ctaccctgac tccggttgtt 420

atctccaaca tggacgagat caaagagctg atcaaactgt ccggtagcgt aaccgtgggt 480

gaaactccgg ttatccgcat caagaagtaa 510

<210> 4

<211> 1434

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 4

atgtttaaga atgcatttgc taacctgcag aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60

tccgtactgc ctatcgcagg tatcctgctg ggcgtcggtt ccgcaaactt cagctggctg 120

ccagccgtag tttcccacgt catggcggaa gcgggcggtt cggtcttcgc taacatgccg 180

ctgatctttg ctatcggtgt cgcacttggc ttcactaaca acgacggcgt atccgctctg 240

gcatcggtcg tcgcttacgg catcatggtg aaaaccatgt ccgtggttgc acctctggtc 300

ctgcatttac ctgctgaaga gattgcggct aaacacctgg cggatactgg cgtactcggc 360

ggtattatct ccggtgccat cgcagcgtac atgttcaacc gcttctaccg catcaaattg 420

cctgagtatc tgggcttctt tgcgggcaag cgttttgtgc caattatctc cggtctggca 480

gcgatcttca ctggtgtgat cctgtccttt atctggccgc cgatcggtac cgcaatccag 540

actttctccc agtgggctgc ttaccagaac ccggttgtgg cgttcggtat ctacggcttc 600

attgaacgct gcctggtgcc gtttggtctg caccacatct ggaacgttcc tttccagatg 660

cagattggtg aatacaccaa cgcagccggt caggtcttcc acggcgatat tccgcgctac 720

atggcaggcg acccgaccgc gggcaaactg tccggcggct tcctgttcaa aatgtacggt 780

ctgccggccg ctgctatcgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcaaaagtg 840

ggcggtatca tgatctccgc agcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900

gagttctcct ttatgttcgt tgcgccgatc ctgtacgtta tccatgcgat tctggcaggc 960

ctggccttcc cgatctgtat cctgctgggt atgcgtgacg gtacttcgtt ctctcatggt 1020

ctgatcgact tcatcgtact gtccggcaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatagtc 1080

ggcatctgct atgcgatcgt ttactacgtg gtgttccgcg ttctgatcaa agcgctggat 1140

ctgaaaaccc cgggtcgtga agatgcaacc gaagacagca aagctggcgc caccagcgaa 1200

atggctccgg cactgattgc cgctttcggc ggtaaagaga acattactaa ccttgacgca 1260

tgtatcaccc gtctgcgcgt gagcgtagcg gatgtggcga aagttgatca ggctggcctg 1320

aaaaaactgg gtgccgcagg cgtggttgtt gcaggttcag gcgttcaggc tattttcggt 1380

accaaatccg ataacctgaa aactgaaatg gatgaataca tccgcagcaa ctaa 1434

<210> 5

<211> 1323

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 5

atgcagacct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggcccgaa atccgctaac 60

ccactggctt tccgtcatta caacccggat gagctggtgc tgggcaaacg gatggaagac 120

catttacgct ttgcggcctg ctactggcac accttctgct ggaacggtgc cgatatgttc 180

ggcgtgggct cctttaaccg cccgtggcag cagccgggtg aagcaatgga aatggcgaaa 240

cgtaaagccg atgtcgcttt tgagtttttc cataaactga acgtaccgta ctactgcttc 300

cacgacgtcg acgtttctcc tgaaggggca tcgctgaaag agtatgccaa taacttcgca 360

caaatggttg atgtgcttgc ggaaaaacag cagcaaagcg gcgtcaagct gctgtggggc 420

acggcaaact gctttacgaa cccgcgttac ggcgccggtg cggcaaccaa tccggatccg 480

gaagtgttca gctgggcggc gacccaggtg gtgaccgcga tggatgcgac ccacaaactg 540

ggcggtgaaa actacgtcct gtggggcggt cgcgaaggct atgaaaccct gctgaacacc 600

gacctgcgtc aggaacgcga gcagattggc cgcttcatgc agctggtcgt ggagcataaa 660

cataaaatcg gcttccaggg tacgctactg attgaaccga aaccgcagga gcccaccaag 720

catcagtacg attacgacgc gtctaccgtc tacggcttcc tgaaacagtt cggcctggaa 780

aaagagatca agctgaatat cgaagcgaac cacgcgacgc tggccggcca cacgttccac 840

cacgaaattg ctaccgccat cgccctcggc ctgtttggtt ccgttgacgc taaccgcggc 900

gacccgcagc tgggctggga tactgaccag ttcccgaaca gcgttgaaga gaacgcgctt 960

gtgatgtacg aaatccttaa agcgggcggc ttcaccaccg gcggcctgaa ctttgatgct 1020

aaagtgcgtc gtcagagcac cgacaaatac gacctgttct acggccacat cggtgcgatg 1080

gacaccatgg cgctggcgct gaaagtcgct gcccgtatga ttgaaggcgg cgagctggat 1140

aaacgcgttg ccaaacgcta tgccggctgg aacggcgagc tgggtcagca gatcctcaaa 1200

ggccagatga acctggcgga catcgcccag tatgccactc agcataacct ggcgccgcag 1260

caccagagcg gccatcagga actgcttgaa aacgtggtta accgctacct ctttgatcgc 1320

tga 1323

<210> 6

<211> 1455

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 6

atgtatatcg ggattgatct cggcacctcg ggcgttaagg ccattctgct caacgagcag 60

ggcgaggtcg tggcttcgca caccgaaaag ctcaacgtgt cgcgtccgca ccctttatgg 120

tctgaacaag atcctgagca ctggtggctg gcgacggacc gcgcgatgaa agcgttgggc 180

gcgcagcact ctttgcgcgc ggttaaagcg ttgggcattg cgggtcagat gcacggcgcg 240

acgctgctcg ataagcaaca gcgcgtcttg cgcccggcga tcttgtggaa tgatggccgc 300

tgcggcgagg agtgtgcgct gctggaggag gaagtcagcc gttcgcgaca gatcaccggt 360

aatctgatga tgccgggatt taccgcgccg aagctgttgt gggtgcaacg tcacgagcct 420

gagattttta ggcaagtcga taaggttctg ctgccaaaag attatttacg tttgcgtatg 480

accggtgagt ttgccagcga tatgtccgat gccgccggaa cgatgtggat ggacgtggcg 540

cgccgcgact ggagcgatga aatgctcgcc gcctgtgggt tgagccgcga taacatgcca 600

gcgcttttcg aaggatgcga agtgacgggc tcgctgcgtc cggccgtcgc gcaagcgtgg 660

aatatgccgg aagtattggt ggtggccggc ggcggcgaca acgcggcggg agcggttggc 720

gtaggtatgg cggatgcggg ccaggcgatg ctgtcgctgg ggacctcggg cgtctacttt 780

gccgtcagcg acggctttct tagcaaaccg gaaagcgccg ttcacagctt ctgccacgcg 840

ttgcctggac gctggcatct gatgtcggtc atgctgagcg cggcttcctg ccttgattgg 900

gcggcgacat taactggcct gggcacggtt ccggcgctga ttgcggcagc ggaagcggcg 960

aacgacgatg ccgatccggt ctggttcttg ccttatctct cgggtgaacg cacgccgcac 1020

aacaatccgc aggcgaaagg cgtctttttc ggcctgactc atcaacacgg tccggcggag 1080

ctggcgcggg cggtgctgga gggagttggt tatgctctgg cggacggcat ggatgtggtt 1140

cacgcctgcg gcgtcaaacc ggagagcgtc acgctgattg gcggcggcgc gcgcagcgcc 1200

tactggcggc aaatgctggc ggatataagc ggccagcagc ttgatttccg caccggcggc 1260

gatgtcggac cggcgcttgg cgcggcgcgg ctggcgcagc tggcgctgca tcgaaatgtc 1320

gcgttttccg atctgctccc gcagctcccg ctggaacagg ctcatcttcc ggatgccgaa 1380

cgctttgcgc gttacgcacc tcgtagggaa actttccgcc agatttatca gcagctttta 1440

ccgctgatgt cctga 1455

<210> 7

<211> 678

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 7

atgaagcagt atttgattgc cccttcgatt ctgtcggctg attttgcccg tctgggcgag 60

gacaccgcca atgcgttggc tgcgggtgcg gatgttgtgc actttgacgt gatggacaac 120

cactacgtgc cgaatctgac cattggcccg atggtgctga aatcactgcg aaattacggt 180

atcactgcgc cgattgacgt gcatttgatg gtcaagccgg ttgaccgcat cgtccctgat 240

tttgccgccg cgggcgccag catcattact ttccatccgg aagcttccga acacgttgac 300

cgcacgctgc agcttatcaa agagcacggc tgcaaagccg gtttggtgtt taacccggcg 360

acctccctga gctaccttga ttacgtaatg gataagctgg atgttattct gctgatgtcc 420

gtcaaccctg gctttggcgg tcagtctttt attccgcaca ccctggaaaa actgcgtgaa 480

gttcgtcgtc gcattgatga atccggctac gacatccgtc tggaagtcga cggcggcgta 540

aaagtcagca atatcgctga gattgccgcc gccggtgcgg atatgtttgt tgctgggtcg 600

gccattttcg atcagcctga ctacaaaaaa gtggtcgatc aaatgcgcag cgaattagca 660

aaggttagcc atggataa 678

<210> 8

<211> 678

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌

<400> 8