黔北麻羊timp1基因真核表达载体的构建方法
阅读说明：本技术 黔北麻羊timp1基因真核表达载体的构建方法 (Construction method of eukaryotic expression vector of TIMP1 gene of northern Guizhou goat ) 是由 陈祥 洪磊 唐文 周志楠 敖叶 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法。本发明能在构建黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体时,免除繁琐步骤,简化操作,节省科研成本。本发明通过简单的方法克隆黔北麻羊TIMP1基因并构建真核表达载体,为黔北麻羊基因检测提供基础方法,便于从基因水平研究其对黔北麻羊繁殖相关性状的影响,为黔北麻羊产羔性状的分子机制提供理论依据。(The invention discloses a construction method of a TIMP1 gene eukaryotic expression vector of a Qianbei goat. The invention can avoid fussy steps, simplify the operation and save the scientific research cost when constructing the eukaryotic expression vector of the TIMP1 gene of the Qianbei ma sheep. The invention clones the TIMP1 gene of the Qianbei ma sheep and constructs a eukaryotic expression vector by a simple method, provides a basic method for detecting the gene of the Qianbei ma sheep, is convenient to research the influence of the gene on the reproduction-related traits of the Qianbei ma sheep from the gene level, and provides a theoretical basis for the molecular mechanism of the lamb-bearing traits of the Qianbei ma sheep.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是基于黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法。
背景技术
基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是一种内源性的金属蛋白酶活性抑制剂，最初被认为主要作用于调节基质金属蛋白酶活性和抑制细胞外基质的转化，包括调节细胞增殖、分化、凋亡等，并且在细胞外基质的稳态中发挥关键作用(Lambert et al.，2004)。TIMP1基因是在20世纪70年代初，以胶原酶抑制剂的形式在体外培养的人皮肤成纤维细胞、人血清以及牛软骨和主动脉提取物中发现的。有研究人员发现，TIMP1基因参与调控小鼠的生殖周期，主要作用于子宫和卵巢(Nothnick et al.,2000)。更为重要的是，TIMP1基因也被认为是类固醇生成的调节剂(Boujard et al.，1995)。在绵羊上，发现TIMP1基因在子宫中的表达受激素影响，如***的调控(Hampton et al.，1995)。而在山羊上，Jiayin Peng etal.(2015)研究发现TIMP1基因可以增加山羊输卵管上皮细胞的增殖，表明TIMP1基因在促进输卵管上皮细胞的存活中发挥重要作用。因此，TIMP1基因的功能不仅局限的作为基质金属蛋白酶的抑制剂，其对动物的繁殖方面的重要作用也逐渐受到人们的关注，可以为提高动物的繁殖性能研究提供新思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法。
本发明是这样实现的：黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，包含如下步骤进行：
1)提取黔北麻羊卵巢组织的RNA，经逆转录获得黔北麻羊卵巢组织的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得TIMP1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与pMD19-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP-N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体；
2)用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pMD19-T载体连接；连接体系：pMD19-T载体1ul，目的片段5ul，buffer 1ul，T4DNA连接酶1ul，ddH2O1ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有AMP抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16hPCR检测菌液阳性克隆，提取重组质粒测序验证；
3)双酶切体系如下：重组质粒、pEGFP-N3(+)空载体各8ul，EcoRⅠ2ul，BamHⅠ2ul，10×QuickCut Green Buffer 2ul，ddH2O补足20ul，37℃恒温水浴锅中酶切3h，用1.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pEGFP-N3(+)空载体；连接体系：pEGFP-N3(+)空载体10ul，目的片段2ul，buffer 1.5ul，T4DNA连接酶1.5ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有5ul卡钠抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h菌液检测阳性克隆，提取重组质粒，双酶切鉴定，阳性克隆。
所述的引物包括上游引物EcoRⅠ和下游引物BamHⅠ，其中上游引物EcoR ⅠF的序列5’-CCG ATGGCCCTCTTTGCACCCAT-3’；单下划线部分为保护碱基，双下划线部分为酶切位点；下游引物BamHⅠR的序列：5’-GC
所述的PCR反应体系为：所述的PCR扩增的反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μL，模板cDNA 1.0μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，ddH2O 7μL，PCR的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，56.6℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明能在构建黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体时，免除繁琐步骤，简化操作，节省科研成本。本发明通过简单的方法克隆黔北麻羊TIMP1基因并构建真核表达载体，为黔北麻羊基因检测提供基础方法，便于从基因水平研究其对黔北麻羊繁殖相关性状的影响，为黔北麻羊产羔性状的分子机制提供理论依据。
附图说明
图1TIMP1基因CDS区扩增产物；
图2TIMP1基因的菌液PCR结果；
图3TIMP1PFGFP-N3(+)重组质粒的凝胶电泳结果；
图4PFGFP-N3(+)-TIMP1重组质粒的双酶切结果。
具体实施方式
本发明的实施例1：黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，本实施例的动物来自贵州省习水县富兴牧业有限公司，选择三只健康的(2-3岁)黔北麻羊母羊各三只屠宰，采集卵巢组织，置于液氮中保存，以用于组织总RNA提取。
本实施例所需主要试剂有：逆转录试剂盒、琼脂糖、高纯度质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒等购自北京康为世纪生物科技有限公司；T-克隆PCR产物克隆试剂盒等购自上海生工生物工程技术有限公司，Goldview染料2×Taq Master Mix、琼脂糖、、TOP10感受态细胞、LB培养基、氨苄霉素等购自北京鼎国生物工程技术有限公司等。DM2000DNA Marker、限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和T4 DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司。
黔北麻羊卵巢组织RNA的提取
(1)取约100mg组织样品于研钵中加入液氮研磨成粉末状，转移至含有1ml Trizol的1.5ml离心管中,上下颠倒混匀，静置10min后，再加入200μl氯仿，冰上放置3min；
(2)4℃12000rpm，离心15min，移液枪吸取上清至新离心管，加入500μl异丙醇颠倒混匀，冰上静置10min，4℃12000rpm，离心10min；
(3)弃上清，保留白色沉淀物(白色沉淀为RNA)，加入75％的乙醇1ml，冰上静置2min，4℃7500rpm，离心10min。重复操作此步骤一次；
(4)弃上清，将离心管倒置在滤纸上晾10min。加入30μl DEPC水，放置55-60℃孵化箱中孵育15min；
(5)取1μl RNA于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，OD260/OD280的值在1.8～2.0效果最佳，将RNA于-80℃冰箱保存备用。
RNA的逆转录反应
将提取的质量符合标准的卵巢组织RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA第一链。将提取后的RNA按20μL体系进行反转录为cDNA，体系为：dNTP Mix 4μL、RT Buffer 4μL、primerMix 2μL、RNA模板2μL、DTT 2μL、HiFiscript 1μL和RNase-Free Water 5μL加入PCR小管，振荡混匀，离心后，于PCR仪上42℃孵育50min，85℃孵育5min；反应结束后，取1μL反应产物于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，-20℃保存备用。
TMP1基因的引物设计
根据Genebank上传的LYRM1基因的CDS区序列，设计TIMP1基因的引物(Primier5.0软件)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，TIMP1基因的引物序列信息见表1。
表1TIMP1基因的引物序列信息
TIMP1基因CDS区扩增
以逆转录获得的cDNA为模板进行TIMP1基因CDS区扩增，反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μL(10μM)，模板cDNA 1.0μL，2×EsTaq MasterMix 10μL，ddH2O 7μL，PCR的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。将PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
TIMP1基因CDS区扩增产物的回收纯化
(1)切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，装入称量后的1.5ml离心管中，称量凝胶的重量；
(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后放置75℃水浴锅中加热，使凝胶完全熔化；
(3)加0.5个体积Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；
(4)将步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，倒掉滤液；加入500μlBuffer W1，12000g离心30s，弃滤液；
(5)加入700μlBuffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液，重复此步骤一次；
(6)将制备管放回2ml离心管中，12000g空离心2min；
(7)将制备管置于1.5ml离心管中，加入30μl Eluent，室温静置5min，12000rpm离心1min洗脱DNA；
(8)用Eluent校正超微量紫外分光光度计，对胶回收产物进行浓度和纯度的检测，存于-20℃冰箱；
CDS区扩增胶回收产物与Pucm-T载体连接
在PCR管中依次加入PUCm-T载体(50ng)1ul，目的条带回收产物5μL，10×LigationBuffer 1μL，50％PEG 4000 1μL，Sterilized ddH2O1μL，T4DNA Ligase 1μL，混匀构建10μL的连接反应体系，16℃金属浴连接过夜。
质粒转化与蓝白斑筛选
质粒转化：
(1)将100ul感受态细胞置于冰上解冻，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；
(2)加入上述5ul连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；
(3)42℃水浴热激90s，在冰上放置20min；
(4)加入700ul LB培养基，37℃摇床200rpm振荡培养1h；
(5)4000rpm离心5min，用移液枪吸掉500ul上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；
(6)将细菌悬液均匀涂布在含100ul氨苄青霉素抗性的LB平板上；
(7)先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
筛选
在超净工作台中，观察氨苄青霉素抗性的LB平板上菌落的生长情况，用移液枪在火焰旁挑取单个白色单菌落分别加入盛有AMP抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h。
菌液PCR鉴定
以培养的菌液为模板，按照如下体系和条件进行PCR扩增，初步检测载体构建情况。PCR反应体系：上、下游引物各1.0μL，模板1.0μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，ddH2O补充至20ul。PCR的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。将PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统观察目的条带。
重组质粒提取
按照康为世纪高纯度质粒小提试剂盒说明书对PCR鉴定正确的菌液进行质粒提取，按如下步骤进行操作：
(1)取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，6200×g离心3min收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。
(2)向菌体沉淀中加入250ul的Buffer P1(已加入RNase A)，涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，确保菌块彻底混匀。
(3)向离心管中加入250ul Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液清凉粘稠。注意温和混匀，不要剧烈震荡，以免造成基因组DNA污染，此步骤所用时间应不超过5min，以免质粒受到破坏。
(4)向离心管中加入350ul Buffer N3，立即温和的上下颠倒混匀4-6次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min。注意Buffer N3加入后立即混匀，以避免产生局部沉淀。
(5)将步骤(4)中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管。
(6)向吸附柱中加入750ul的Buffer PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以将残存的乙醇去除，将收集的质粒置于-20℃保存备用。选取克隆成功的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
重组质粒和pEGFP-N3(+)空载体的双酶切
对重组质粒和PEGFP-N3(+)空载体进行EcoR Ⅰ和BamHⅠ双酶切，酶切体系如下；
37℃恒温水浴锅中酶切4h，用1％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书对目的条带和pEGFP-N3(+)空载体的大片段进行凝胶回收，按如下体系和条件进行连接反应：
pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体的克隆纯化
对pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体进行克隆纯化，并且分别进行菌液PCR鉴定和质粒提取，对重组质粒进行双酶切鉴定，对鉴定正确的菌液送上海生工生物有限公司双向测序。
重组载体的菌液保存
将鉴定正确的重组质粒的菌液加入到2ml离心管中，等比例加入50％的甘油，上下颠倒混匀，用PV膜封口，-80℃冰箱保存。
序列表
<110> 贵州大学
<120> 黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 山羊(Capra hircus)
<400> 1
ccggaattca tggccctctt tgcacccat 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 山羊(Capra hircus)
<400> 2
gcggatcctc aggccccccg gggccgca 28