阅读说明：本技术 一种t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法 (Expression system of T7RNA polymerase and T7 promoter and method for expressing protein in eukaryote by using same ) 是由 王文雅 李君� 李强 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本申请涉及一种T7 RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法。所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev-RRE调控元件,该系统可使真核生物中T7转录的无5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质,从而实现连续稳定高效地表达外源蛋白。(The present application relates to an expression system of T7RNA polymerase and T7 promoter and a method for expressing protein in eukaryote using the same. The expression system comprises Vpu protein and/or Rev-RRE regulatory elements in HIV-1 retrovirus, and can transport mRNA transcribed by T7 without 5' cap structure to cytoplasm across nuclear membrane, thereby realizing continuous, stable and high-efficiency expression of foreign protein.)

一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生 物中表达蛋白质的方法

技术领域

本申请涉及一种基于HIV-1的Vpu和Rev-RRE元件的T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)和T7启动子表达系统，该表达系统可用于在真核细胞中持续稳定高效地表达蛋白。

背景技术

T7表达系统已被广泛地应用于蛋白质的表达，其中在原核生物中的应用最为普遍(参见，专利文献1)。最典型的代表是Novagen公司研发的pET系列质粒，这类质粒目前已被广泛地应用在大肠杆菌中高效地表达蛋白质。

对于真核生物，有研究者利用酵母菌株开展了T7表达系统的研究，但却没有得到积极的结果，只检测到T7 RNAP的表达，没有检测到T7启动子控制的目的蛋白的合成(参见，非专利文献1和2)。

还有研究者在哺乳动物细胞中以病毒(如牛痘病毒)作为载体构建存在于细胞质中的T7表达系统，存在于细胞质中的牛痘病毒载体会随着细胞分裂而丢失；同时，大量复制的牛痘病毒最终也会杀死宿主细胞。因此，该T7表达系统只能实现蛋白质在细胞质中的瞬时表达，难以实现持续稳定地表达目标蛋白(参见，非专利文献1和3)。

为实现真核细胞内持续稳定地表达蛋白质，关键点在于将细胞核内转录后再加工的真核mRNA通过核膜成功转运至细胞质，然后才能实现mRNA在细胞质内翻译成蛋白质。但是，由于细胞核内T7 RNAP转录出的mRNA没有5′帽子结构和3′poly(A)尾巴，不能被运输出细胞核，因此影响了细胞质内蛋白质的翻译合成，不能高效表达蛋白质。

对于T7 RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA，有研究发现，在细胞质内利用IRES结构可以帮助缺乏5′cap结构的真核生物mRNA翻译合成蛋白质(参见，非专利文献4)，但是，该研究并未涉及细胞核内的T7 RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA运输到细胞质的问题。同样，还有研究表明，在T7启动子启动的转录单元中添加真核生物终止子序列可以帮助T7RNAP转录产物产生3′poly(A)尾巴(参见，非专利文献5)，但是该研究也未解决如何将缺乏5′cap结构的mRNA从细胞核运输到细胞质的问题。

现有技术文献：

专利文献1：CN102643851A

非专利文献1：ELROY-STEIN O,FUERST T R,MOSS B.Cap-independenttranslation of mRNA conferred by encephalomyocarditis virus 5'sequenceimproves the performance of the vaccinia virus/bacteriophage T7 hybridexpression system[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1989,86(16):6126-30.

非专利文献2：Benton B M,Eng W-K,Dunn J J,et al.Signal-mediated importof bacteriophage T7 RNA polymerase into the Saccharomyces cerevisiae nucleusand specific transcription of target genes[J].Molecular and Cellular Biology,1990,10(1):353-60.

非专利文献3：Wang W,Li Y,Wang Y,et al.Bacteriophage T7 transcriptionsystem:an enabling tool in synthetic biology[J].Biotechnology Advances,2018.

非专利文献4：Elroy-Stein O,Moss B.Cytoplasmic expression system basedon constitutive synthesis of bacteriophage T7 RNA polymerase in mammaliancells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1990,87(17):6743-7.

非专利文献5：Ken Dower,Michael Rosbash,T7 RNA polymerase-directedtranscripts are processed in yeast and link 3′end formation to mRNA nuclearexport[J].RNA,2002,8:686–697.

发明内容

发明要解决的问题

本发明主要解决真核生物中T7表达系统转录的无5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质，连续稳定高效地表达重组蛋白的问题。

用于解决问题的方案

本发明人发现，人类免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录病毒基因组上存在编码Rev蛋白的基因，与Rev蛋白特异性结合的RNA称为Rev响应元件(Rev-responsive element，RRE)。Rev蛋白可以结合RRE，通过与剪接因子、剪接体相互作用抑制剪接，同时与核孔蛋白相互作用，将带有RRE的不完全剪接mRNA从细胞核运至细胞质。

HIV-1逆转录病毒还编码小的调节蛋白，其中Vpu蛋白是由81个氨基酸寡聚形成的膜蛋白，折叠成两个不同的结构域，即N端跨膜疏水性结构域和C端细胞质结构域。由于具有该结构，Vpu蛋白以寡聚体形式穿入细胞膜形成通道，能够改善细胞膜的通透性。

核定位信号(Nuclear Localization Singal,NLS)通常为短的氨基酸序列，它能辅助目标蛋白进入细胞核，核定位信号的引入可以使蛋白进入细胞核。当在膜蛋白上游添加NLS，膜蛋白会定位在细胞核核膜上。

本发明人基于以上事实，为解决T7表达系统转录mRNA跨核膜转运到细胞质的问题，提出如下两种设计方案：

1)在T7表达系统中引入HIV-1逆转录病毒中的Rev-RRE调控元件，Rev蛋白可以特异性结合RRE序列，将带有RRE序列的缺乏5`cap结构T7 RNAP转录的mRNA从细胞核运输至细胞质；

2)在T7表达系统中引入带有核定位序列的vpu基因，使其蛋白定位在细胞核核膜上，从而改变核膜的通透性，使T7 RNAP转录的产物通过渗透扩散进入细胞质。

上述设计方案对于所适用的真核生物不进行特别限制，只要能实现T7RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质即可。优选地，适用于酵母、哺乳动物、昆虫。更优选地，适用于酿酒酵母(Sachromyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、仓鼠、人肾细胞、人Hela细胞、CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3、蚕、果蝇。最优选地，适用于酿酒酵母(Sachromyces cerevisiae)和人Hela细胞。

优选地，针对不同的真核生物可使用如下两种表达系统：

(一)对于酵母，构建基于HIV-1的Vpu的T7表达系统。

(二)对于哺乳动物，构建基于HIV-1的Vpu或Rev-RRE元件的T7表达系统。

为验证上述T7表达系统在真核生物中是否表达目标蛋白，本发明使用了潮霉素抗性蛋白(Hph)、Nanoluc萤光素酶(Nluc)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，将其构建于T7启动子启动的转录单元。

验证实验证明了上述两种设计方案的合理性，两种T7表达系统均实现了预期的效果。结果表明，Vpu蛋白起到了改变核膜通透性的作用，帮助T7RNAP转录的mRNA出核，完成了翻译过程；携带RRE的mRNA也与Rev蛋白结合，帮助T7 RNAP转录的mRNA出核，完成了翻译过程。

具体地，本发明的技术方案包括如下：

[1]、一种T7 RNA聚合酶和T7启动子的表达系统，其中，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev-RRE调控元件。

[2]、根据[1]所述的表达系统，其中，所述T7 RNA聚合酶由SEQ ID No：1所表示的序列编码。

[3]、根据[1]或[2]所述的表达系统，其中，所述T7 RNA聚合酶的基因还含有核定位序列。

[4]、一种使用T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其中，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev-RRE调控元件。

[5]、根据[4]所述的方法，其中，所述方法包括：

1)合成所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因序列，所述T7 RNA聚合酶由SEQID No：1所表示的序列编码，将所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因插入到整合型载体中；

2)将所述整合型载体线性化，回收线性化片段，转化到真核菌株中，通过抗性筛选得到基因组上整合了带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因的真核重组菌株；

3)构建具有携带核定位序列的vpu基因的载体，以含有目标蛋白基因的质粒为模板扩增包含有T7启动子的目标蛋白DNA片段，回收所述包含有T7启动子的目标蛋白片段，将其插入具有前述携带核定位序列的vpu基因的载体中，得到含有所述vpu基因和目标蛋白基因的载体；和

4)将3)得到的所述载体转化到2)中的真核重组菌株中，构建基于HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白的T7 RNA聚合酶的表达系统。

[6]、根据[4]所述的方法，其中，所述方法包括：

1)构建表达T7 RNA聚合酶和Rev的载体，所述T7 RNA聚合酶由SEQ ID No：1所表示的序列编码；

2)将含有T7启动子、T7终止子、IRES、RRE和目标蛋白基因的DNA片段转移至所述载体，构建能够表达T7 RNA聚合酶、Rev和目标蛋白的载体；

3)用2)中构建的载体进行转染，完成慢病毒包装；和

4)用所述慢病毒感染目标真核细胞，通过抗性筛选得到目标转化子，通过验证目标蛋白确定所述表达系统。

[7]、根据[4]所述的方法，其中，所述方法包括：

1)构建表达T7 RNA聚合酶和Vpu的载体，所述T7 RNA聚合酶由SEQ ID No：1所表示的序列编码；

2)将含有T7启动子、T7终止子、IRES和目标蛋白基因的DNA片段转移至所述载体，构建能够表达T7 RNA聚合酶、Vpu、目标蛋白的载体；

3)用2)中构建的载体进行转染，完成慢病毒包装；和

4)用所述慢病毒感染目标真核细胞，通过抗性筛选得到目标转化子，通过验证目标蛋白确定所述表达系统。

[8]、根据[6]所述的方法，其中，在所述步骤1)中，选取哺乳动物的启动子作为表达T7 RNA聚合酶和Rev的启动子，构建含有2A或者IRES的真核多顺反子结构，得到同时表达T7 RNA聚合酶和Rev的载体。

[9]、根据[7]所述的方法，其中，在所述步骤1)中，选取哺乳动物的启动子作为表达T7 RNA聚合酶和Vpu的启动子，构建含有2A或者IRES的真核多顺反子结构，得到同时表达T7 RNA聚合酶和Vpu蛋白的载体。

[10]、根据[4]～[9]任一项所述的方法，其中，使用潮霉素抗性蛋白、Nanoluc萤光素酶或增强型绿色荧光蛋白验证所述表达系统表达的目标蛋白。

[11]、根据[4]～[10]任一项所述的方法，其中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列、Nucleoplasmin核定位序列、EGL-13核定位序列、c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列。

[12]、根据[1]～[11]任一项所述的方法，其中，所述真核生物为酵母、哺乳动物或昆虫。

发明的效果

本发明通过构建基于HIV-1的Vpu和/或Rev-RRE元件的T7表达系统，显著改善了T7RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA从细胞核跨膜向细胞质的运输，促进其翻译合成蛋白质，实现了基于T7表达系统的重组蛋白在真核细胞内的持续稳定高效地表达。

附图说明

图1为pS-T7RNAP质粒构建的示意图。

图2为酿酒酵母基因工程菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP)的构建结果的PCR验证图。其中，泳道1是对照菌BY4741基因组PCR结果的电泳图；泳道2是BY4741(HO::NLS-T7RNAP)基因组PCR结果的电泳图。

图3为pS-hph质粒构建的示意图。

图4为pS-vpu质粒构建的示意图。

图5为pS-vpu/hph质粒构建的示意图。

图6为潮霉素对不同酿酒酵母重组菌株的生长速度影响的效果图。其中，control代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株；yhph代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-hph)菌株；yVpu-hph代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)菌株。

图7为潮霉素对不同酿酒酵母重组菌株的菌落生长影响的效果图。其中，control代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株；yhph代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-hph)菌株；yVpu-hph代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)菌株，潮霉素浓度分别为0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml。

图8为Vpu对T7表达系统在酿酒酵母中表达Nluc影响的效果图。其中，control代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株；yNluc代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Nluc)菌株；yVpu-Nluc代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/Nluc)菌株。

图9为Vpu对T7表达系统在酿酒酵母中表达EGFP影响的效果图。其中，control代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株；yEGFP代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-EGFP)菌株；yVpu-EGFP代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/EGFP)菌株。

图10为pMSCVpuro-T7RNAP和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev质粒构建的示意图。

图11为pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc-RRE和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-Nluc-RRE质粒构建的示意图。

图12为Rev-RRE对T7表达系统在人Hela细胞株中表达Nluc影响的效果图。其中，W是野生型人Hela细胞株；W-T7RP是引入pMSCVpuro-T7RNAP-Rev的人Hela细胞株；W-Rev-T7RP是引入pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-Nluc-RRE的人Hela细胞株。

图13为pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu质粒构建的示意图。

图14为pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc和pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu-Nluc质粒构建的示意图。

图15为Vpu对T7表达系统在人Hela细胞株中表达Nluc影响的效果图。其中，W是野生型人Hela细胞株；W-T7RP是引入pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc的人Hela细胞株；W-Vpu-T7RP是引入pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu-Nluc的人Hela细胞株。

图16为pS-Rev/EGFP/RRE质粒构建的示意图。

图17为pMSCVpuro-T7RNAP-EGFP和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-EGFP-RRE质粒构建的示意图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步解释本发明，需要说明的是，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不限于此。

<实验材料>

载体：pMRI 31(GenBank:KJ502281.1)；pESC-URA(GenBank:AF063585.2)；pMSCVpuro，购自上海酶研生物科技有限公司；Pumvc，购自上海酶研生物科技有限公司；pMD2.G，购自Addgene(Catalog:12259)公司。

菌株：酿酒酵母菌株BY4741，购自Invitrogen公司。

细胞株：293T细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院；Hela细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院。

培养基：YPD培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；SD-URA培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；DEME培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；Opti-MEM减血清培养基购自北京索莱宝科技有限公司。

试剂：胎牛血清(FBS)，购自北京全式金生物技术有限公司；10×PBS缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；Luciferase Assay System试剂盒，购自普洛麦格北京生物技术有限公司；无缝克隆试剂盒(Infusion)，购自中美泰和生物技术(北京)有限公司；Fugene 9，购自北京索莱宝科技有限公司；山梨醇，购自北京索莱宝科技有限公司；潮霉素B，购自北京索莱宝科技有限公司；嘌呤霉素，购自北京索莱宝科技有限公司。

<质粒和载体的构建以及蛋白的表达方法>

需要说明的是，本申请中涉及的常规的质粒和载体的构建、蛋白的表达方法以及慢病毒包装等方法，可参照本领域公知的分子生物学及遗传学方法，例如，可参照“本领域的常规生物学方法”、“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in MolecularBiology，Wiley出版)”、“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。

<实施例1>基于HIV-1 Vpu蛋白的T7表达系统在酿酒酵母中的构建和表达

1.pS-T7RNAP质粒的构建

设计合成带有核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)的T7 RNAP(GenBank:KY484013.1)，其中T7 RNAP的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，带有核定位信号(NLS)的核苷酸序列为如SEQ ID No：2所示。

SEQ ID No：2：ATGCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTC

将NLS-T7RNAP基因片段插入到pMRI 31载体gal1,10诱导型启动子(GenBank:K02115.1)的下游，构建质粒命名为pS-T7RNAP，所用的T_CYC1核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，构建过程如图1。

2.基因工程菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP)的构建

将质粒pS-T7RNAP使用sfiⅠ核酸内切酶线性化。回收线性化质粒片段，电转入酿酒酵母菌株BY4741，通过遗传霉素G418抗性筛选得到整合了T7RNAP基因的酿酒酵母重组菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP)。为了确保是阳性转化子，提取该酿酒酵母重组菌株和空白菌株的基因组并用特定引物HO3验证T7 RNAP基因是否正确插入到酿酒酵母基因组HO区域上，验证结果如图2。

HO3的核苷酸序列如下：

HOF3:CGTGCCTGCGATGAGATAC(SEQ ID No：4)

HOR3:GGCGTATTTCTACTCCAGCA(SEQ ID No：5)

对照组扩增出来的大小为2947bp的片段，表明没有插入片段，而实验组扩出了7672bp的片段，说明所述T7 RNAP基因成功插入到了酿酒酵母BY4741染色体上。

3.质粒pS-vpu/hph的构建

根据提供的基因序列合成P_T7-IRES-hph片段，P_T7序列为SEQ ID No：6所示的序列，hph的序列为SEQ ID No：7所示的序列，T_T7序列为SEQ ID No：8所示的序列，将此片段通过无缝克隆的方法插入到载体pESC-URA中，完成质粒pS-hph的构建，构建流程如图3。同时，将携带核定位序列(NLS)的vpu基因(如SEQ ID No：9所示)插入载体pESC-URA中gal双向启动子的下游，构建质粒pS-vpu，构建流程如图4。

以质粒pS-hph为模板扩增P_T7-IRES-hph DNA片段，所使用的引物如下：

F:TCAAGGAGAAAAAACCAAAAAACCCCTCAAGGCCC(SEQ ID No：10)

R:TTAATGCAGCTGGATTAATACGACTCACTATAGGT(SEQ ID No：11)

最后将回收的P_T7-IRES-hph片段同样采用无缝克隆的方法插入质粒载体pS-vpu，构建质粒pS-vpu/hph，载体构建过程如图5。

4.基因工程菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)的构建

将最终目标质粒pS-vpu/hph转入酿酒酵母菌BY4741(HO::NLS-T7RNAP)，得到酿酒酵母重组菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)。具体操作参照以下酿酒酵母感受态的制备及转化步骤。

酿酒酵母感受态的制备过程如下所示：

(1)从平板上挑单一酵母菌落于5mL的YPD液体培养基中，30℃下培养12h。再从中吸取500μL培养液至50mL的YPD液体培养基，继续30℃培养18-24h至OD₆₀₀＝2左右即可。

(2)菌液转至灭菌的50ml离心管，5000rpm离心5min后去上清，然后用30ml的预冷灭菌水重悬菌体，然后5000rpm离心5min去上清。

(3)用20ml预冷灭菌的1M山梨醇重悬菌体，去上清。最后再使用200μl-500μl的1M山梨醇重悬细胞转移至1.5ml离心管，即得到酿酒酵母感受态细胞。每次做酵母转化时都需制备新鲜的感受态以保证高转化率。

酿酒酵母电转转化步骤如下：

(1)取3～5μL的线性质粒或质粒(浓度≥300ng/μl)和40μL的酿酒酵母感受态细胞于预冷过的1.5mL离心管混合均匀，并转移至2mm的电转杯中，冰上预冷5min。

(2)用纸擦净电转杯上的水滴，采用电转仪在1500V的电击强度下电击。

(3)在电转杯中加入1mL的YPD培养基，轻轻悬浮转移至灭菌的1.5mL离心管，30℃下静置复苏2h。待复苏后，用灭菌水清洗3遍，涂适量的细胞于相应的平板上。30℃下培养2-3天直至出现单菌落。

5.所构建的T7表达系统在酿酒酵母中表达重组蛋白效果的检测

控制T7RNAP基因表达的是Gal启动子，该启动子需要在以半乳糖为碳源的诱导条件下所表达，所以酿酒酵母重组菌株可首先在SD-URA中培养24h后再用SG-URA诱导培养48h，否则T7RNA聚合酶不会参与T7表达系统发挥自身的功能。

潮霉素抗性蛋白(Hph)报告基因在酿酒酵母重组菌株中的表达检测

<菌株生长速率>

参照实施例1中4的方法将载体pESC-URA和pS-hph分别转入酿酒酵母重组菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP)，得到对照菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)和菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-hph)。将这两个对照菌和实验组菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)分别在SD-URA液体培养基中培养24h后，稀释调整OD₆₀₀，使三种菌株的OD₆₀₀值一致，按1％的转接量接菌至SG-URA液体培养基，并添加潮霉素终浓度为400μg/ml，每隔12h测菌液OD₆₀₀，通过菌株的生长情况来反应表达抗性蛋白的量，结果如图6。

从图6中可以看出，对照菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)(以control表示)在400μg/ml潮霉素浓度中基本不生长，携带vpu基因的菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)(以yVpu-hph表示)比不携带vpu基因的菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-hph)(以yhph表示)生长要快，说明携带vpu基因的菌株能表达更多的抗性蛋白，因而菌株生长快。该实验结果说明含有Vpu蛋白的T7表达系统利用Vpu蛋白提高细胞核核膜的通透性，使更多的T7 RNAP转录的mRNA运输到细胞质，完成翻译过程，合成较多抗性蛋白。

<菌落大小和生长状态>

将酿酒酵母菌BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)、重组菌BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-hph)和重组菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)、在SD-URA液体培养基中培养24h后，稀释调节三种菌株的菌体浓度，使其OD₆₀₀值保持一致，稀释后点菌在含不同浓度潮霉素的SG-URA固体平板，潮霉素浓度依次为0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml(参见图7，最上端数字代表潮霉素的浓度)。3天后观察菌落的大小和生长状态，结果如图7所示。

从图7中可以看出，潮霉素浓度为0μg/ml时，菌株都能正常生长；随着潮霉素浓度的增加，不携带抗性基因的BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)(以control表示)生长受到抑制，直至不能生长。携带vpu基因的BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-vpu/hph)(以yVpu-hph表示)比不携带vpu基因的BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-hph)(以yhph表示)的菌落数要多，说明Vpu蛋白的引入能提高细胞核核膜的通透性，使更多的T7 RNAP转录的mRNA穿过细胞核核膜进入细胞质，合成潮霉素抗性蛋白质。

NanoLuc^TM萤光素酶(Nluc)报告基因在重组酿酒酵母菌株中的表达检测

参照实施例1中3和4的方法构建质粒和酿酒酵母重组菌株，得到酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA),BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Nluc)、BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/Nluc)。Nluc的核苷酸序列如SEQ ID No：12所示。

将上述三株菌株分别进行如下操作：在SD-URA液体培养基中培养24h后，按1％的接菌量转接到SG-URA液体培养基中培养至一定浓度后，离心收集菌体，用过滤除菌的PBS洗涤3次，重悬于无菌的PBS。

检测方法：将Nano-Glo^TM底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并与酵母细胞以1:10混合，转移200μl样品到白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的Luminescence模式测定生物发光强度，200μl样品转移到96孔透明板用于测定OD₆₀₀。为了比较不同菌之间的差异，实验中的平均生物发光强度用生物发光强度除以OD₆₀₀。样品在测定之前要稀释到合适的浓度(OD₆₀₀＝0.3～0.8)，结果如图8所示。

图8中可以看出，不含萤光素酶基因的对照菌株(以control表示)基本没有检测到生物发光信号，携带vpu基因的菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP，pS-Vpu/Nluc)(以yVpu-Nluc表示)生物发光强度是不携带vpu基因的菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Nluc)(以yNluc表示)的2.0倍。该结果表明Vpu蛋白提高了细胞核核膜的通透性，从而促进T7 RNAP转录的mRNA跨膜运输到细胞质中，因此比未携带Vpu蛋白的T7表达系统合成更多的蛋白质，实现了高效表达重组蛋白的目的。

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因在重组酿酒酵母菌株中的表达检测

参照实施例1中3和4的方法构建质粒和酿酒酵母重组菌株，得到酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)、BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-EGFP)和BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/EGFP)。EGFP的核苷酸序列如SEQ ID No：13所示。

对上述三株菌株分别进行如下操作：在SD-URA液体培养基中培养24h后，按1％的接菌量转接到SG-URA液体培养基中培养至一定浓度后，离心收集菌体，用无菌水洗涤3次，重悬于无菌水，通过多功能酶标仪检测荧光基因表达，结果如表1和图9所示。

表1不同酿酒酵母重组菌株的平均荧光强度

表1中，control代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株；yEGFP代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-EGFP)菌株；yVpu-EGFP代表BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/EGFP)菌株。

从图9中也可以看出，BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/EGFP)菌株的荧光强度显著高于BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株和BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-EGFP)，说明Vpu蛋白提高了细胞核核膜的通透性，从而促进T7 RNAP转录的mRNA跨膜运输到细胞质中，因此比未携带Vpu蛋白的T7表达系统合成更多的蛋白质，实现了高效表达重组蛋白的目的。

<实施例2>基于HIV-1Rev-RRE调控元件的T7表达系统在哺乳动物细胞中的构建和表达

1.慢病毒表达载体pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-Nluc-RRE的构建

选取人源磷酸甘油酸激酶1(PGK1)基因(如SEQ ID No：14所示)的启动子作为表达T7 RNAP和Rev的启动子，T7 RNAP和Rev(如SEQ ID No：15所示)蛋白的共表达通过2A(如SEQID No：16所示)或者IRES(如SEQ ID No：17所示)连接来实现，最终构建得到pMSCVpuro-T7RNAP和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev质粒。以2A连接为例，构建流程如图10所示。

分别合成PGK1、NLS-T7RNAP、SV40 poly(A)(如SEQ ID No：18所示)、2A-Rev-SV40poly(A)片段，采用融合PCR技术将片段融合得到大片段PGK1-T7RNAP-SV40 poly(A)和PGK1-T7RNAP-2A-Rev-SV40 poly(A)，最后将DNA片段PGK1-T7RNAP-SV40 poly(A)和PGK1-T7RNAP-2A-Rev-SV40 poly(A)转移至慢病毒表达载体pMSCVpuro上，完成质粒pMSCVpuro-T7RNAP和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev的构建。

合成P_T7-IRES-Nluc-RRE片段，RRE的序列为SEQ ID No：19所示的序列。最后将DNA片段P_T7-IRES-Nluc-RRE转移至载体pMSCVpuro-T7RNAP和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev上，完成质粒pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc-RRE和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-Nluc-RRE构建，具体构建流程如图11所示。

2.293T细胞包装慢病毒，感染人Hela细胞

将上述所构建载体pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc-RRE和pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-Nluc-RRE转染293T细胞，完成慢病毒包装。通过嘌呤霉素筛选成功转化的转化子。具体操作参照以下293T细胞包装慢病毒及慢病毒感染目的细胞的步骤。

293T细胞包装慢病毒过程如下所示：

(1)当细胞生长至九成满时，弃去细胞培养基，用无菌PBS轻柔润洗一次，加入1ml0.25％胰酶消化。在显微镜下观察到细胞被消化变圆后，弃去胰酶，加入10％FBS的DMEM培养基重悬293T细胞，计数5×10⁵个细胞分至6孔细胞培养板的每个孔。

(2)24h后，转染293T细胞：

A：用470μl Opti-MEM稀释30ul Fugene 9，并充分轻轻地混匀，室温下静置5min。

B：准备目标质粒和包装载体质粒：

两个包装载体质粒pUMVC：1μg；pMD2.G：0.5μg

目标质粒：1μg。

C：将上述准备的质粒混合液滴加到Opti-MEM与Fugene 9的混合液中，室温静置20min；在接种有细胞、含100μl培养基的6孔板的每个孔中加入2–10μl上述混合物。吹吸或使用振荡器振荡10～30s进行混匀，将细胞放回培养箱继续培养。

D：6～8h后对293T细胞换液，注意加液时，不要吹起细胞(沿着皿壁，轻轻地加新培养液)，置37℃细胞培养箱中继续培养48h。

(3)目的细胞的铺板：

目的细胞需要提前一天铺板至六孔细胞培养板中(细胞接种个数是2×10⁵～3×10⁵个)，以保证感染时的密度为30～40％；同时准备一个不感染病毒的对照组。第二天弃上清液，加入含有病毒的培养基进行感染。

(4)慢病毒液的收集：

转染48h后(此时长满293T细胞)，收集上清液于15ml离心管中，3000rpm离心20min，将上清液用0.45μm滤头过滤。再向六孔板加适量培养液，24h之后，可以再次收集上清液，按照每次用量分装，保存于-80℃冰箱中。

慢病毒感染目的细胞(人Hela细胞)的步骤如下：

(1)配置3ml培养基1640(10％FBS)，然后加入3ml病毒上清液(剩余的病毒上清液放-80℃冰箱中保存)，24h之后补加4ml 1640培养液，保证细胞处于良好状态；

(2)细胞培养板置于细胞培养箱中再培养24h；

(3)48h后，弃上清，更换新鲜培养基6～8ml，并加入相应浓度的嘌呤霉素筛选，杀死未转入DNA的细胞；

(4)72h后，选择阴性对照组全部死亡且转染DNA组有适量存活的细胞进行单克隆培养，将孔内细胞用有限稀释法分单个细胞到细胞培养用96孔板继续培养。

(5)培养10d左右，挑选细胞单克隆，进行检测。

3.所构建的T7表达系统在哺乳动物细胞中表达重组蛋白效果的检测。

Nluc报告基因在人Hela细胞株中的表达检测

野生人Hela细胞株作为对照，用胰蛋白酶消化野生Hela细胞和感染慢病毒的细胞至悬浮，用无菌PBS洗涤3次，并将细胞重悬于无菌PBS。

检测方法：将底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并按1:10的比例与细胞混合，转移200μl样品到白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的luciferase模式测定生物发光，结果如图12所示。

从图12中可以看出，野生人Hela细胞株(以W表示)基本没有检测到生物发光信号。携带Rev-RRE元件的人Hela细胞株(以W-Rev-T7RP表示)生物发光强度是不携带Rev-RRE元件的人Hela细胞株(以W-T7RP表示)生物发光强度的4.3倍，说明携带RRE元件的mRNA可以与Rev蛋白结合，促进T7 RNAP转录的mRNA出核，完成翻译过程，连续稳定地表达目标蛋白。

<实施例3>基于HIV-1 Vpu蛋白的T7表达系统在哺乳动物细胞中的构建和表达

1.慢病毒表达载体pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu-NLuc的构建

选取人源磷酸甘油酸激酶基因的启动子PGK1作为表达T7 RNAP和Vpu的启动子，T7RNAP和Vpu蛋白的表达通过2A或者IRES连接来实现，最终构建得到pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu。以2A连接为例，构建流程如图13所示。

分别合成片段PGK1、NLS-T7RNAP、2A-Vpu-NLS-SV40 poly(A)，采用融合PCR技术将三个片段融合得到大片段PGK1-T7RNAP-2A-Vpu-SV40poly(A)，最后通过无缝克隆方法将DNA片段PGK1-T7RNAP-2A-Vpu-SV40poly(A)转移至慢病毒表达载体pMSCVpuro上，完成质粒pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu的构建。

合成P_T7-IRES-Nluc片段，通过无缝克隆的方法将DNA片段P_T7-IRES-Nluc转移至载体pMSCVpuro-T7RNAP和pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu，完成质粒pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc和pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu-Nluc的构建，具体构建流程如图14所示。

2.293T细胞包装慢病毒，感染人Hela细胞

将上述所构建载体pMSCVpuro-T7RNAP-Nluc和pMSCVpuro-T7RNAP-Vpu-Nluc转染293T细胞，完成慢病毒包装。通过嘌呤霉素筛选成功转化的转化子，具体操作参照实施例2中293T细胞包装慢病毒及慢病毒感染目的细胞的步骤。

3.所构建的T7表达系统在哺乳动物细胞中表达重组蛋白效果的检测。

Nluc报告基因在人Hela细胞中的表达检测

野生人Hela细胞株作为对照，用胰酶消化野生人Hela细胞和感染慢病毒的细胞至悬浮，用无菌PBS洗涤3次，并将细胞重悬于无菌PBS。

检测方法：将底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并按1:10的比例与细胞混合，转移200μl样品到白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的Luminescene模式测定生物发光，结果如图15所示。

从图15可以看出，野生人Hela细胞株(以W表示)基本没有检测到生物发光信号。携带Vpu蛋白的人Hela细胞株(以W-Vpu-T7RP表示)生物发光强度是不携带Vpu蛋白的人Hela细胞株(以W-T7RP表示)生物发光强度的4.5倍，说明Vpu蛋白可以提高细胞核核膜通透性，帮助T7RNAP转录的mRNA出核，完成翻译过程，实现连续稳定高效地表达目标蛋白。

<实施例4>基于Rev-RRE的T7表达系统在酿酒酵母与人Hela细胞中表达蛋白的差异

参照实施例1构建适用于酿酒酵母的基于Rev-RRE的T7表达系统，首先将Rev基因片段(参见，序列表中的SEQ ID No：3)插入载体pESC-URAgal双向启动子的下游，构建质粒载体pS-Rev。合成P_T7-IRES-EGFP-RRE片段，用无缝克隆的方法将前述片段插入质载体pS-Rev，构建质粒pS-Rev/EGFP/RRE，载体构建过程如图16所示。参照实施例1中4的方法构建酿酒酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Rev/EGFP/RRE)。参照实施例2以EGFP为报告基因，构建适用于人Hela细胞的基于Rev-RRE的T7表达载体pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-EGFP-RRE，构建过程如图17所示。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因按照实施例1的方法进行测定，比较基于Rev-RRE调控元件的T7表达系统在酿酒酵母和人Hela细胞中表达重组蛋白的作用，结果如表2所示。

表2酿酒酵母与人Hela细胞的平均荧光强度

表2中，control 1代表酿酒酵母BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pESC-URA)菌株；control 2代表野生人Hela细胞株；yRev-RRE-EGFP代表酿酒酵母BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Rev/EGFP/RRE)菌株；W-T7RP-Rev-EGFP-RRE代表引入pMSCVpuro-T7RNAP-Rev-EGFP-RRE人Hela细胞株。

从表2可以看出，基于Rev-RRE调控元件的T7表达系统，在酿酒酵母中Control 1和yRev-RRE-EGFP间荧光强度差异不大，说明yRev-RRE-EGFP基本没有绿色荧光蛋白的表达。在人Hela细胞中，W-T7RP-Rev-EGFP-RRE的荧光强度是Control 2的21.3倍，说明基于Rev-RRE元件的T7表达系统在哺乳动物细胞的蛋白表达优于酿酒酵母。

产业上的可利用性

本申请开发了一种用于真核生物生产蛋白质的表达系统，通过HIV-1 Vpu膜蛋白和Rev-RRE调控元件帮助T7 RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA运输到细胞质，从而实现在真核细胞中持续稳定高效地表达重组蛋白。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360

accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480

cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540

gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600

tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660

attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720

tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780

ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840

attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960

aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020

atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080

ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140

gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200

atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260

gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320

aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380

aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440

ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560

gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620

tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680

ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740

attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920

tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980

tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160

aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220

aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280

attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520

gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

gcgttcgcgt aa 2652

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcccaaga agaagcggaa ggtc 24

<210> 3

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 60

ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa 120

cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca 180

ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcggcc 240

ggtacc 246

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgcctgcg atgagatac 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgtatttc tactccagca 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactatagg 19

<210> 7

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gccttgaggg gttttttg 48

<210> 9

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgcaaccta tacaaatagc aatagtagca ttagtagtag caataataat agcaatagtt 60

gtgtggtcca tagtaatcat agaatatagg aaaatattaa gacaaagaaa aatagacagg 120

ttaattgata gactaataga aagagcagaa gacagtggca atgagagtga aggaaaaata 180

tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat 240

ctg 243

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaaggagaa aaaaccaaaa aacccctcaa ggccc 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttaatgcagc tggattaata cgactcacta taggt 35

<210> 12

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60

gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120

actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180

atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240

gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300

atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360

gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420

gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480

accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516

<210> 13

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgtctaaag gtgaagaatt attcactggt gttgtcccaa ttttggttga attagatggt 60

gatgttaatg gtcacaaatt ttctgtctcc ggtgaaggtg aaggtgatgc tacttacggt 120

aaattgacct taaaatttat ttgtactact ggtaaattgc cagttccatg gccaacctta 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgt tttgctagat acccagatca tatgaaacaa 240

catgactttt tcaagtctgc catgccagaa ggttatgttc aagaaagaac tatttttttc 300

aaagatgacg gtaactacaa gaccagagct gaagtcaagt ttgaaggtga taccttagtt 360

aatagaatcg aattaaaagg tattgatttt aaagaagatg gtaacatttt aggtcacaaa 420

ttggaataca actataactc tcacaatgtt tacatcatgg ctgacaaaca aaagaatggt 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gttctgttca attagctgac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggtgat ggtccagtct tgttaccaga caaccattac 600

ttatccactc aatctgcctt atccaaagat ccaaacgaaa agagagacca catggtcttg 660

ttagaatttg ttactgctgc tggtattacc catggtatgg atgaattgta caaatctaga 720

actagtggat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc 780

gagtcatgta attag 795

<210> 14

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60

gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120

gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180

ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240

gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300

ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360

gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420

ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480

cctcatctcc gggcctttcg 500

<210> 15

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gaactcctca aggcagtcag actgatcaag 60

tttctctacc aaagcaaccc acctcccagc ccagagggga cccgacaggc ccgaaggaat 120

cgaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccgag cacttagtgg atggattctt 180

agcactcatc tgggtcgatc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccacc gcttgagaga 240

cttactcttg attgtaacga ggattgtgga aattctggga cgcagggggt gggaaatcat 300

caagtattgg tggagtctcc tacaatattg gagtcaggaa ctaaagaa 348

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aattttgacc tgctcaagtt ggccggagac gttgagtcca accctgggcc c 51

<210> 17

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtttattca agtggaagca gatttgtacg ctcaagcggt tgaataaact agttaacgtt 60

actggccgaa gtcgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 120

atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 180

attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 240

gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 300

cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 360

acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 420

gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 480

cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 540

ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 600

tgataatatg gccacaacgt cgatatg 627

<210> 18

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

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ta 122

<210> 19

<211> 234

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<400> 19

aggagctatg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggct cagcgtcaat 60

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gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gaccaacagc tcct 234