阅读说明：本技术 一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法 (Method for screening stably transfected clone protein ) 是由 高谋 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法,涉及克隆蛋白筛选技术领域,该筛选稳定转染的克隆蛋白的方法,包括细胞培养、传代培养、配制筛选培养基、转染、统计转染率、更换培养基、加药选择、换药培养、减药培养、停药培养、标记细胞群、孔板培养、鉴定前准备、准备采摘和鉴定。本发明通过将原代细胞经过培养分离并进行传代培养,形成多个对照组和实验组,同时通过筛选培养基进行筛选和转染,达到一定转染率之后,通过筛选培养基进行筛选培养,达到转染细胞群体并分离出转染效果较好的细胞群体,最后成功得到转染克隆蛋白的目的,在生物学和医学上具有重要意义。(The invention discloses a method for screening stably transfected cloned protein, which relates to the technical field of cloned protein screening and comprises the steps of cell culture, subculture, preparation of screening culture medium, transfection, counting of transfection rate, culture medium replacement, medicine adding selection, medicine changing culture, medicine reducing culture, medicine stopping culture, marking of cell groups, pore plate culture, preparation before identification, preparation before picking and identification. According to the invention, primary cells are cultured, separated and subcultured to form a plurality of control groups and experimental groups, and meanwhile, a screening culture medium is used for screening and transfecting to achieve a certain transfection rate, and then the screening culture medium is used for screening and culturing to achieve the purposes of transfecting cell populations and separating cell populations with good transfection effects, and finally, the purpose of successfully obtaining transfected clone protein is achieved, so that the method has important significance in biology and medicine.)

一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法

技术领域

本发明涉及克隆蛋白筛选技术领域，具体为一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法。

背景技术

转染(transfection)是真核细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程，现有技术中，重组融合蛋白通过将编码的小鼠CR2(complementreceptor2，补体受体2)序列与编码小鼠Crry胞外区的序列连接起来，Crry序列使用了成熟蛋白的编码残基1-319，为了将CR2连接到Crry，使用了链接序列编码(GGGGS)2。转染后的克隆蛋白，需要经过一定流程的筛选鉴定才能获得，这种克隆蛋白不论在生物学上还是医学上，都具有极其重要的意义，因此，筛选出稳定转染克隆蛋白也意义重大，对此，提出了一种新的筛选稳定转染克隆蛋白的方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法，解决了筛选出稳定转染克隆蛋白在生物学和医学上具有重要意义的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法，包括以下步骤：

S1、细胞培养：采用氨基酸平衡盐水培养基进行原代细胞培养。

S2、传代培养：细胞汇合度达到一定指标时，进行分离传代培养。

S3、配制筛选培养基：取G418和HEPES混合并加蒸馏水溶解，过滤消毒后低温保存。

S4、转染：待细胞密度上升50％～70％，转染定量GFP、载体DNA和质粒到细胞中。

S5、统计转染率：转染后18小时后，每2小时进行一次转染检查，获得转化效率。

S6、更换培养基：去除氨基酸平衡盐水培养基，并用PBS清洗。

S7、加药选择：加入筛选培养基进行细胞选择。

S8、换药培养：根据培养基的颜色和细胞生长情况，定期更换筛选培养基。

S9、减药培养：当细胞死亡率增加时，降低筛选培养基的浓度继续进行筛选培养，且定期更换。

S10、停药培养：筛选2周天后，抗性克隆出现，此时停药继续培养。

S11、标记细胞群：挑选并标记直接看起来像灰色圆圈、在显微镜下几乎填补了视野的细胞群体。

S12、孔板培养：圈出被标记群体，刮除周围物质，采摘被挑选的细胞群体，放在添加介质的孔板上继续培养。

S13、鉴定前准备：反复添加PBS，进行介质求清洗。

S14、准备采摘：取一小块浸泡在胰蛋白酶中的定量滤纸，放在细胞群体的顶部，在显微镜下看到细胞生长到定量滤纸四周时，便可采摘。

S15、鉴定：对采摘和细胞群体进行转染克隆蛋白鉴定。

优选的，在步骤S1中，细胞培养前，培养皿需要通过75％的乙醇和蒸馏水反复清洗，且蒸馏水后使用。

优选的，在步骤S2中，细胞汇合度为80％～100％。

优选的，在步骤S2中，细胞传代培养的密度为1:2～1:20。

优选的，在步骤S3中，筛选培养基为现配现用，且在使用前临时保存时，筛选培养基的保存温度不高于-4℃。

优选的，在步骤S8中，更换筛选培养基的频率为2～5天/次。

优选的，在步骤S9中，更换后的培养基浓度不超过50％。

优选的，在步骤S12中，介质包含该细胞生长所需的所有抗生素。

(三)有益效果

本发明提供了一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法，具备以下有益效果：

本发明通过将原代细胞经过培养分离并进行传代培养，形成多个对照组和实验组，同时通过筛选培养基进行筛选和转染，达到一定转染率之后，通过筛选培养基进行筛选培养，达到转染细胞群体并分离出转染效果较好的细胞群体，最后成功得到转染克隆蛋白的目的，在生物学和医学上具有重要意义。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种筛选稳定转染的克隆蛋白的方法，包括以下步骤：

S1、细胞培养：采用氨基酸平衡盐水培养基进行原代细胞培养。

S2、传代培养：细胞汇合度达到一定指标时，进行分离传代培养。

S3、配制筛选培养基：取G418(Geneticin，遗传霉素，是一种氨基糖苷类抗生素)和HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围)混合并加蒸馏水溶解，HEPES的浓度为1M，过滤消毒后低温保存。

S4、转染：待细胞密度上升50％～70％，转染定量GFP(Green FluorescentProtein，绿色荧光蛋白)、载体DNA和质粒到细胞中。

S5、统计转染率：转染后18小时后，每2小时进行一次转染检查，获得转化效率。

S6、更换培养基：去除氨基酸平衡盐水培养基，并用PBS(phosphate buffersaline，磷酸缓冲盐溶液，一般作为溶剂进行)清洗。

S7、加药选择：加入筛选培养基进行细胞选择。

S8、换药培养：根据培养基的颜色和细胞生长情况，定期更换筛选培养基，更换不要太频繁，也不能隔的时间太长。

S9、减药培养：当细胞死亡率增加时，降低筛选培养基的浓度继续进行筛选培养，且定期更换。

S10、停药培养：筛选2周天后，抗性克隆出现，此时停药继续培养。

S11、标记细胞群：挑选并标记直接看起来像灰色圆圈、在显微镜下几乎填补了视野的细胞群体。

S12、孔板培养：圈出被标记群体，刮除周围物质，采摘被挑选的细胞群体，放在添加介质的孔板上继续培养。

S13、鉴定前准备：反复添加PBS，进行介质求清洗。

S14、准备采摘：取一小块浸泡在胰蛋白酶中的定量滤纸，放在细胞群体的顶部，在显微镜下看到细胞生长到定量滤纸四周时，便可采摘。

S15、鉴定：对采摘和细胞群体进行转染克隆蛋白鉴定。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S1中，细胞培养前，培养皿需要通过75％的乙醇和蒸馏水反复清洗，且蒸馏水后使用。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S2中，细胞汇合度为80％～100％。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S2中，细胞传代培养的密度为1:2～1:20。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S3中，筛选培养基为现配现用，且在使用前临时保存时，筛选培养基的保存温度不高于-4℃。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S8中，更换筛选培养基的频率为2～5天/次。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S9中，更换后的培养基浓度不超过50％。

作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S12中，介质包含该细胞生长所需的所有抗生素。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。