阅读说明：本技术 一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法 (Method for improving plant nitrogen and phosphorus absorption and utilization by overexpression of OsPHR3 gene in Arabidopsis thaliana ) 是由 孙雅菲 薛永 宋科 秦秦 孙丽娟 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明适用于农作物培育技术领域,提供了一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法,通过从水稻幼苗叶片中提取总RNA,以oligodT为引物逆转录的cDNA为模板,克隆OsPHR3的编码区序列,然后将测序后确认完全正确的编码区序列连入含有CaMv35S启动子的pCAMBIA1305-GUS-Plus表达载体上,利用液氮冻融法将载体转入农杆菌感受态中,随后利用农杆菌侵染花序的方法实现拟南芥的遗传转化,将水稻基因OsPHR3转入拟南芥中,获得35S::OsPHR3拟南芥超表达植株。此发明可改良植株株形,并提高其对氮磷的吸收与利用,为改善植物对氮与磷营养元素的吸收利用提供技术支持,有良好的应用价值。(The invention is applicable to the technical field of crop cultivation, and provides a method for improving plant nitrogen and phosphorus absorption and utilization by overexpression of an OsPHR3 gene in Arabidopsis, which comprises the steps of extracting total RNA from rice seedling leaves, cloning a coding region sequence of OsPHR3 by using cDNA reverse transcribed by using oligodT as a primer as a template, connecting the completely correct coding region sequence after sequencing into a pCAMBIA1305-GUS-Plus expression vector containing a CaMv35S promoter, transferring the vector into an agrobacterium competence by using a liquid nitrogen freeze-thaw method, realizing genetic transformation of Arabidopsis by using a method of infecting a inflorescence by using agrobacterium, transferring the rice gene OsPHR3 into an OsPHR3 Arabidopsis super-expression plant of 35S. The invention can improve the plant shape of the plant, improve the absorption and utilization of nitrogen and phosphorus, provide technical support for improving the absorption and utilization of nitrogen and phosphorus nutrient elements of the plant, and has good application value.)

一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利 用的方法

技术领域

本发明属于农作物培育技术领域，尤其涉及一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法。

背景技术

培育氮磷高效的农作物才是保持农业可持续发展重要途径。水稻OsPHR3是磷饥饿响应最为重要的转录调控因子PHR1家族(OsPHR1-4)中的成员，本技术通过弄赶紧侵染拟南芥花序的转化体系，获得引入外源基因OsPHR3的拟南芥转基因材料，这一技术对研究作物高效摄取氮磷养分的机理与该基因在多种植物种的应用具有重要意义

在我国的农业生产活动中人们仍选择大量施加氮肥和磷肥以保证农作物正常生长。然而肥料的大量施用必会造成资源浪费和环境污染。培育氮磷高效的植物与农作物新品种成为保持农业可持续发展重要途径。拟南芥因其独特的生理生化特征，使得其突出于其他植物，成为研究植物基因功能及基因应用实践上的重要植物载体。然而在研究植物的氮磷养分高效时，往往只针对一种元素的高效利用，对氮磷协同高效利用的探索以及协同高效转基因植物的挖掘依然欠缺。

发明内容

本发明提供一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法，旨在改良植株株形，并提高其对氮磷的吸收与利用，为改善植物对氮与磷营养元素的吸收利用提供技术支持，有良好的应用价值。

本发明是这样实现的，一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法，包括以下步骤：

S1、从水稻幼苗叶片中提取总RNA；

S2、以oligo为引物逆转录的cDNA为模板，克隆OsPHR3的编码区序列，然后将测序后确认完全正确的编码区序列连入含有CaMv35S启动子的pCAMBIA1305-GUS-Plus表达载体上；

S3、利用液氮冻融法将载体转入农杆菌感受态中，进而以农杆菌侵染花序的方法实现拟南芥的遗传转化，获得OsPHR3拟南芥超表达植株。

优选的，所述水稻幼苗叶片的在温度为30℃的条件下培养。

优选的，步骤S1中，提取总RNA时，水稻幼苗叶片的苗龄为14天。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法，通过从水稻幼苗叶片中提取总RNA，以oligo为引物逆转录的cDNA为模板，克隆OsPHR3的编码区序列，然后将测序后确认完全正确的编码区序列连入含有CaMv35S启动子的pCAMBIA1305-GUS-Plus表达载体上，然后利用液氮冻融法将载体转入农杆菌感受态中，进而以农杆菌侵染花序的方法实现拟南芥的遗传转化，获得OsPHR3拟南芥超表达植株，本发明根癌农杆菌介导的花序浸染法，将水稻基因OsPHR3转入拟南芥中，获得拟南芥OsPHR3超表达株系，改良植株株形，并提高其对氮磷的吸收与利用，为改善植物对氮与磷营养元素的吸收利用提供技术支持，有良好的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1的OsPHR3超表达拟南芥分子鉴定示意图。

图2为本发明实施例1的OsPHR3超表达载体及载体构建示意图。

图3为本发明实验例1的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系叶片表型示意图。

图4为本发明实验例1的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系叶片长度示意图。

图5为本发明实验例1的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系根系形态示意图。

图6为本发明实验例1的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系长角果长度示意图。

图7为本发明实验例2的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系不同部位磷浓度示意图。

图8为本发明实验例3的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系不同NO^3-处理条件下不同部位NO^3-浓度示意图。

图9为本发明实验例3的拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系不同磷条件下总氮含量示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供一种技术方案：一种利用OsPHR3基因在拟南芥中超表达提高植物氮磷吸收利用的方法，包括以下步骤：

S1、在30℃的条件下培养的水稻幼苗叶片，并在苗龄为14天时提取总RNA。

S2、以oligo(dT)为引物逆转录的cDNA为模板，克隆OsPHR3的编码区序列，然后将测序后确认完全正确的编码区序列连入含有CaMv35S启动子的pCAMBIA1305-GUS-Plus表达载体上，如图1所示。

S3、利用液氮冻融法将载体转入农杆菌感受态中，进而以农杆菌侵染花序的方法实现拟南芥的遗传转化。收获的第一代种子并以50mg/L终浓度的卡那霉素进行抗性筛选，并利用GUS染色筛选阳性植株，进一步通过PCR扩增目的片段验证，对筛选得到的第一代阳性植株进行单株繁种，收获的第二、三代种子同样进行抗生素筛选及PCR验证，最终获得了三个阳性35S::OsPHR3拟南芥超表达植株，分别命名为OsPHR3#4、OsPHR3#42和OsPHR3#43，用于后续试验。

半定量RT-PCR的结果证实，在过表达株系中，OsPHR3基因的转录表达水平与野生型显著提高。所用引物如下：

扩增编码区序列引物为：

F:5'-GGTACCATGAGCACACAGAGTGTCATT-3'

R:5'-GTCGACTTATTCGTCATGCACCATTTC-3'

半定量引物为：

OsPHR3-F:GGTACCATGAGCACACAGAGTGTCATT

OsPHR3-R:GTCGACTTATTCGTCATGCACCATTTC

Tubulin-F:CCAACAACGTGAAATCGACAG

Tubulin-R:TCTTGGTATTGCTGGTACTCT

结果如图2显示，OsPHR3在超表达株系中的转录水平表达量显著上调。图2中，A为pCAMBIA1305-GUS-Plus载体，B为一轮酶切验证结果，C为二轮酶切验证结果。

实验例1

本实验例用于研究OsPHR3的超表达促进拟南芥的生长发育的情况，取实施例1中获得的取拟南芥Col-0型野生型，OsPHR3#4、OsPHR3#42和OsPHR3#43数粒饱满健康的种子，用10％NaClO溶液消毒约30min后，用去离子水清洗5-6遍，用无菌移液枪将Col-0野生型和OsPHR3超表达株系种子各三粒水平摆在装有MS固体培养基的10×10cm的方形平板中。将平板竖直放置在光照培养箱培养10天，培养箱的培养条件为：温度：22℃；光照周期：光照16h/黑暗8h。观察拟南芥各株系根系表型，测定其根长及侧根数。待拟南芥幼苗在蛭石营养土中生长五周后，观察表型，测定其和生物量。

拟南芥各株系在蛭石营养土中生长五周后，剪去植株茎秆部分，留下底座叶片进行观察。结果发现，OsPHR3转化株叶片大小略大于野生型，如图3A所示。为了进一步更精确的验证拟南芥不同株系地上部分生长发育的区别，将不同株系拟南芥底座叶片小心剪下均匀分布在含1％Agar的培养皿中并放置立体显微镜下观察。结果可发现，相比拟南芥野生型的平均叶片数，OsPHR3超表达株系均叶片数则显著偏大，如图3A所示。随后测定拟南芥不同株系地上部分生物量大小，结果发现：相比拟南芥野生型，OsPHR3超表达株系生物量则增加18％，如图3B所示。对比拟南芥各株系最大叶宽，可发现OsPHR3超表达株系的叶宽相较野生型增大14％，如图3C所示，总叶片宽度OsPHR3超表达株系较野生型增大17％，如图3C所示。图3中，A为完整植株及叶片表型，标尺＝2cm和1cm，B为生物量，C为叶片宽度，D为总叶片宽度。数值显示的是平均值±SE(n＝20)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

将不同株系拟南芥最大8片叶片小心剪下首尾相连均匀摆放在含1％Agar的培养皿中并放置立体显微镜下观察最大叶长，如图4A所示。结果可以发现，OsPHR3超表达株系单叶长高于野生型达16％，如图4B所示；OsPHR3超表达株系总叶长较野生型高18％，如图4C所示。图4中，A为叶片长度表型，标尺＝1cm，B为叶片长度，C为全部叶片长度。数值显示的是平均值±SE(n＝20)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

对比拟南芥Col-0野生型和OsPHR3转化株系的根系表型可以发现，OsPHR3超表达后其根长较野生型显著增加，如图5A和5B所示，转化株的侧根数也略高，如图5C所示。说明OsPHR3在拟南芥中的超表达显著促进植株根系的发育：植株主根伸长，侧根数增多且明显。图5中，A为根系表型，标尺＝1cm；B为主根根系长度；C为侧根数量；数值显示的是平均值±SE(n＝20)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

选取拟南芥野生型和OsPHR3三株超表达株系未成熟的成型长角果各100颗，测定其长度并统计，每株选取其中长度适中的十颗，首尾相连排列，如图6A所示。结果发现，转化株OsPHR3超表达株系的长角果长度显著高于野生型，说明OsPHR3基因在拟南芥中超表达可能影促进拟南芥长角果的生长，继而说明OsPHR3的超表达可促进其他植物的籽粒产量，如图6B所示。图6中，A为长角果表型，标尺＝1cm；B为长角果长度；数值显示的是平均值±SE(n＝100)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

实验例2

本实验例旨在研究OsPHR3的超表达促进拟南芥对磷素的吸收与积累的情况。

取实施例1获得的野生型及OsPHR3超表达株系的拟南芥种子在培养基上长出四片以上完整的幼叶，根长超过5cm后，将拟南芥移植入霍格兰氏营养液中，放置在人工气候室继续培养，培养条件为：温度22℃，相对湿度60％，光照14h/黑暗10h，每隔三天换一次营养液。待拟南芥生长3周后，转移至正常供磷和缺磷营养液中处理2周，采集拟南芥地上部分和地下部分植株样品，称重，编号。利用钼蓝比色法测定总磷及可溶性磷含量。

结果显示，在正常供磷条件下，与野生型相比，OsPHR3超表达株系的总磷及可溶性磷浓度在根部及地上部均无明显变化，如图7A和7B所示。然而在缺磷条件下，与野生型相比，OsPHR3超表达株系的根部及地上部总磷及可溶性磷浓度均出现了显著增加，如图7A和7B所示。该结果证明水稻OsPHR3在拟南芥中的超表达可能促进植株对磷素的吸收与积累。图7中，A为全磷浓度；B为可溶性磷浓度；数值显示的是平均值±SE(n＝20)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

实验例3

本实验例旨在研究OsPHR3的超表达促进拟南芥对氮素的吸收与利用的情况。

将实施例1获得的野生型及OsPHR3超表达株系的拟南芥种子在培养基上长出四片以上完整的幼叶，根长超过5cm后，将拟南芥移植入霍格兰氏营养液中，放置在人工气候室继续培养，培养条件为：温度22℃，相对湿度60％，光照14h/黑暗10h，每隔三天换一次营养液。待拟南芥生长3周后，转移至正常供氮和缺氮营养液中处理2周，采集拟南芥地上部分和地下部分植株样品，称重，编号。利用流动分析仪检测不同株系全氮和硝态氮含量。

结果显示，在高硝和中硝条件下，OsPHR3转化株根部的NO₃ ^-浓度分别高出野生型32％和16％，如图8A和B所示。该结果表明，在高硝和中硝条件下，水稻OsPHR3可能提高植物对NO₃ ^-吸收利。另外，在低硝条件下，野生型和OsPHR3转化株的地上和地下部分NO^3-浓度没有显著区别，如图8C所示。该结果证明，在低硝条件下，OsPHR3在拟南芥中超表达可能不影响植株对NO₃-的吸收利用。图8中，A为高硝(5mMNO₃ ^-)；B为中硝(1mMNO₃ ^-)；C为低硝(0.2mMNO₃ ^-)；数值显示的是平均值±SE(n＝5)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

为了验证OsPHR3超表达后如何在磷主导环境中调控植株氮的内稳态平衡，以及研究植株体内氮、磷素的吸收利用是否有协同作用，测定了拟南芥野生型和OsPHR3超表达株系在正常供磷(200μM)和缺磷(0μM)条件下生长10天后植株总氮含量，如图9所示。结果显示，OsPHR3超表达株系在正常供磷和缺磷条件下地上部的总氮浓度与野生型无明显差异，而根部总氮含量却显著高于野生型，其中在正常供磷条件下OsPHR3超表达株系根部总氮浓度增加了野生型的16％，如图9A所示；而在缺磷条件下也高出23％，如图9B所示。该结果说明，水稻OsPHR3的超表达可能促进植株对氮素的吸收积累，并且在OsPHR3的调控下，植株体内氮素的积累可能不受环境中磷素的影响。图9中，A为正常供磷(200μMPi)；B为缺磷(0μMPi)；数值显示的是平均值±SE(n＝20)，不同的字母表示在P<0.05水平下具有显著差异。

综上所述，本发明根癌农杆菌介导的花序浸染法，将水稻基因OsPHR3转入拟南芥中，获得拟南芥OsPHR3超表达株系，改良植株株形，并提高其对氮磷的吸收与利用，为改善植物对氮与磷营养元素的吸收利用提供技术支持，有良好的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。