阅读说明：本技术 一种提高人凝血因子ix表达水平的方法 (Method for improving expression level of human blood coagulation factor IX ) 是由 姜舒 熊斌 张芸 于 2019-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高人凝血因子IX表达水平的方法,包括优化人凝血因子IX基因；替换Kozak序列；利用优化后的人FIX基因和Kozak序列构建腺相关病毒(AAV)表达质粒并包装重组AAV；本发明使用优化后的基因编码序列和Kozak序列,显著地提高了人凝血因子FIX基因的表达水平。该优化的人FIX基因和Kozak序列可用于高效生产治疗B型血友病的FIX蛋白,降低FIX蛋白的生产成本；也可用于AAV介导的基因替代疗法治疗B型血友病,提高FIX基因在人体内的表达水平,从而减少给药剂量,提高治疗效果。(The invention discloses a method for improving the expression level of human blood coagulation factor IX, which comprises optimizing human blood coagulation factor IX genes; replacement of Kozak sequence; constructing an adeno-associated virus (AAV) expression plasmid by using the optimized human FIX gene and a Kozak sequence, and packaging the recombinant AAV; the invention uses the optimized gene coding sequence and the Kozak sequence to obviously improve the expression level of the human blood coagulation factor FIX gene. The optimized human FIX gene and Kozak sequence can be used for efficiently producing FIX protein for treating hemophilia B, and the production cost of the FIX protein is reduced; can also be used for AAV-mediated gene replacement therapy for treating hemophilia B, and can increase expression level of FIX gene in human body, thereby reducing administration dosage and improving therapeutic effect.)

一种提高人凝血因子IX表达水平的方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种通过优化编码基因的 Kozak序列和密码子提高重组人凝血因子FIX表达水平的方法

技术背景

B型血友病是一种X染色体连锁的遗传性血液疾病。患者X染色体上编码凝血因子IX的FIX基因发生突变，而导致不能正常合成凝血因子IX。在临床上表现为凝血时间延长，严重时自发出血，有致畸致残的风险，甚至危及生命。目前主要依靠补充有活性的凝血因子IX 进行替代治疗，需要终身给药，尚无治愈方法。

人凝血因子IX的编码基因位于X染色体上，全长33.5kb，包含 8个外显子和7个内含子；mRNA全长2802bp；凝血因子IX由461 个氨基酸组成，其中包括N端一段28个氨基酸的信号肽，介导FIX 蛋白分泌到血液；FIX蛋白在人体血液中的半衰期约为24h。

正常人血浆中FIX蛋白的浓度约为5mg/L。当人血浆中FIX蛋白的浓度为正常浓度的5-40％时，表现出轻度血友病症状，在大手术时可能会导致严重出血；当人血浆中FIX蛋白的浓度为正常浓度的1-5％时，表现出中度血友病症状，在小手术或遭遇外伤时可能会导致严重出血；当人血浆中FIX蛋白的浓度低于正常浓度的1％时，表现出重度血友病症状，会出现自发出血。长期的自发出血可能导致关节畸变或者残疾，颅内出血甚至会危及生命。

B型血友病在男性中的患病率约为1/25000，尚无治愈方法，目前治疗该病的方法主要有两种：1)输血补充患者血浆中的FIX。该方法给输血者带来了血液传染病的风险，并且长期输血会导致铁元素在体内的积累。2)注射重组人源FIX蛋白，该方法的给药周期为1-3 次/周，治疗成本较高，给患者带来了较大的经济负担。

为弥补现有技术的不足，本发明的目的在于开发一种提高重组人源FIX蛋白体外表达水平的方法，利用体外重组人源蛋白治疗B型血友病，既可避免长期输血带来的血液传染病风险，又可降低重组人源 FIX蛋白的生产成本，也可用于B型血友病的基因治疗，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：对人FIX基因进行密码子优化，将人FIX基因原有的Kozak序列替换成一段更加高效的 Kozak序列，并利用以上AAV表达载体包装重组AAV。

进一步，所述优化后的Kozak序列为GCCGCCACCATGC，其中加粗的ATG为FIX基因的起始密码子。

进一步，所述人FIX基因去除了除第一个内含子Intron I以外的其它内含子，保留了所有8个外显子。

进一步，所述优化后的FIX基因序列如下Seq1所示。

Seq1：FIX基因序列

ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCCGAGAGCCCCGGCCTGATCACCAT CTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGAGCGCCGAGTGCACCGGTTTGTTTCCTTTTTT ATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTT CACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTT TTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTG TTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTT TAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAA ATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTGGGAAACAA AAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGAC AATTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAAGGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATAT ATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCT GTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCT CAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTA GGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATT GCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGA GGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCAC AGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTG ACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGG CCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGA CCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAAC CATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCA ATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAAC TTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACT GGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTA TACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTG GCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTT CATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTGTTC CTGGACCACGAGAACGCCAACAAGATCCTGAACCGCCCCAAGCGCTACAACAG CGGCAAGCTGGAGGAGTTCGTGCAGGGCAACCTGGAGCGCGAGTGCATGGAGGAGAAGTGCAGCTTCGAGGAGGCCCGCGAGGTGTTCGAGAACACCGAGCG CACCACCGAGTTCTGGAAGCAGTACGTGGACGGCGACCAGTGCGAGAGCAAC CCCTGCCTGAACGGCGGCAGCTGCAAGGACGACATCAACAGCTACGAGTGCT GGTGCCCCTTCGGCTTCGAGGGCAAGAACTGCGAGCTGGACGTGACCTGCAA CATCAAGAACGGCCGCTGCGAGCAGTTCTGCAAGAACAGCGCCGACAACAAG GTGGTGTGCAGCTGCACCGAGGGCTACCGCCTGGCCGAGAACCAGAAGAGCT GCGAGCCCGCCGTGCCCTTCCCCTGCGGCCGCGTGAGCGTGAGCCAGACCAG CAAGCTGACCCGCGCCGAGGCCGTGTTCCCCGACGTGGACTACGTGAACAGCA CCGAGGCCGAGACCATCCTGGACAACATCACCCAGAGCACCCAGAGCTTCAAC GACTTCACCCGCGTGGTGGGCGGCGAGGACGCCAAGCCCGGCCAGTTCCCCT GGCAGGTGGTGCTGAACGGCAAGGTGGACGCCTTCTGCGGCGGCAGCATCGT GAACGAGAAGTGGATCGTGACCGCCGCCCACTGCGTGGAGACCGGCGTGAAG ATCACCGTGGTGGCCGGCGAGCACAACATCGAGGAGACCGAGCACACCGAGC AGAAGCGCAACGTGATCCGCATCATCCCCCACCACAACTACAACGCCGCCATCA ACAAGTACAACCACGACATCGCCCTGCTGGAGCTGGACGAGCCCCTGGTGCTG AACAGCTACGTGACCCCCATCTGCATCGCCGACAAGGAGTACACCAACATCTTC CTGAAGTTCGGCAGCGGCTACGTGAGCGGCTGGGGCCGCGTGTTCCACAAGG GCCGCAGCGCCCTGGTGCTGCAGTACCTGCGCGTGCCCCTGGTGGACCGCGCC ACCTGCCTGCTGAGCACCAAGTTCACCATCTACAACAACATGTTCTGCGCCGGC TTCCACGAGGGCGGCCGCGACAGCTGCCAGGGCGACAGCGGCGGCCCCCAC GTGACCGAGGTGGAGGGCACCAGCTTCCTGACCGGCATCATCAGCTGGGGCG AGGAGTGCGCCATGAAGGGCAAGTACGGCATCTACACCAAGGTGAGCCGCTA CGTGAACTGGATCAAGGAGAAGACCAAGCTGACCTAA

本发明的创新性及产生的技术效果：

本发明使用优化后的Kozak序列和基因编码序列，显著地提高了人凝血因子FIX基因的表达水平。该Kozak序列和优化的人FIX基因可用于高效生产治疗B型血友病的FIX蛋白，降低FIX蛋白的生产成本；也可用于腺相关病毒(AAV)介导的基因治疗的方法治疗B型血友病，提高FIX基因在人体内的表达水平，从而减少给药剂量，提高治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例1的质粒示意图；

图2为本发明实施例1的FIX浓度；

图3为本发明实施例1的目标质粒示意图；

图4为本发明实施例1的ELISA方法检测FIX蛋白浓度示意图；

图5为本发明实施例1的ELISA方法检测培养基中FIX蛋白浓度示意图。

具体实施方式

：

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：

替换Kozak序列提高FIX的表达

1)合成FIX基因

DNA合成委托第三方公司进行，合成的序列包括：启动子、5’端非翻译区UTR、上述优化后的FIX基因、3’端非翻译区UTR、polyA 加尾信号序列，序列两端添加NotI酶切识别位点gcggccgc。经测序，序列完全正确。

2)FIX表达序列和AAV表达载体线性化

反应体系为：

DNA 1μg

10×Buffer 5μL

NotI限制性内切酶 1μL

ddH₂O补充至 50μL

反应条件为：

37℃，1-16h

3)片段回收：

将酶切后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1％。电泳参数为：电压120V，时间30min。在紫外光下切下目标片段。利用胶回收试剂盒回收。利用微型分光光度计检测所回收DNA浓度。

4)连接

连接反应体系为：

线性化AAV载体100ng

线性化FIX表达序列适量(线性化AAV载体mol量的3-10倍)

10×T4 DNA ligase Buffer 1.5μL

T4 DNA ligase 1μL

ddH₂O补充至 15μL

反应条件为：

16℃，4-16h

5)转化E.coli Stbl4化转感受态细胞

取一管冻存于-80℃的E.coli Stbl4化转感受态细胞(100μL)，放置于冰上融化，加入上述连接反应液10μL。轻弹管壁使其混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL LB培养基。200rpm 复苏30-60min，取适量菌液涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LB 平板上。37℃培养约16h。

6)质粒鉴定

挑取LB平板上的菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养中，利用PCR的方法进行初步鉴定，鉴定引物序列如下。

上游引物(seqF)：CCCAGCCAGTGGACTTAG

下游引物(seqR)：AGTGGGAGTGGCACCTTC

PCR反应体系为：

EasyTaq 2×Mix 10μL

seqF(10μM) 1μL

seqR(10μM) 1μL

菌液 1μL

ddH2O 7μL

总体积 20μL

PCR反应程序为：

95℃ 10min

94℃ 30s

58℃ 30s

72℃ 60s

第2步至第4步反应35个循环

72℃ 2min

PCR反应结束后，利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。电泳的电压为120V，时间为30min。电泳结束后，利用紫外凝胶成像仪观察电泳结果。

选取符合预期的菌落，进一步进行测序验证，最终获得目标质粒。

质粒示意图见图1；

7)Kozak序列替换

将新的Kozak序列包埋在引物中，引物序列如下：

10F：CAATCTGCTAGCCGCCACCATGGAGAGGGTGAACATGATCATGGCT

10R：CCCTCTCCATGGTGGCGGCTAGCAGATTGTGAAAGTGGTATTCA

11F：CAATCTGCTAGCCGCCACCATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCT

11R：CCCTCTGCATGGTGGCGGCTAGCAGATTGTGAAAGTGGTATTCA

以10F和10R为引物，以pAAV-F9为模板进行PCR，以11F和11R 为引物，以pAAV-F9为模板进行PCR。

PCR反应体系如下：

dd H₂O，31μL

5×Takara PrimeSTAR Bufer，10μL

2.5mM dNTP，4μL

DMSO,1.5μL

上游引物，1μL

下游引物，1μL

质粒，1μL

PrimeSTAR DNA polymerase，0.5μL

总体积，50μL

PCR反应程序如下：

98℃，10s

55℃，5s

72℃，7min

第一步至第三步反应30个循环

DNA片段回收与上述方法相同。所得片段采用Monad连接试剂盒进行无缝连接。质粒鉴定及转化方法与上述方法相同。所得质粒分别命名为pAAV-KZ10和pAAV-KZ11，与pAAV-F9相比，pAAV-KZ10和 pAAV-KZ1仅Kozak序列不同，其余序列均相同。

各质粒的Kozak序列如下：

编号	序列
		F9	AAGGTTATGC
KZ10	GCCGCCACCATGG
		KZ11	GCCGCCACCATGC

8)细胞转染

将HepG2细胞接种于24孔板，细胞密度为10⁵个/孔，12-16h后，利用Lipo3000转染试剂进行转染。转染后4-6h更换新的培养基。转染后48h，收集培养液，1000g离心5min，所得上清液用于FIX蛋白的检测。

9)FIX浓度检测

采用ELISA试剂盒检测FIX的浓度。具体方法为：向包被有FIX 抗体的酶标板中加入100μL样品或标准品，加入50μL稀释后的标记有辣根过氧化物酶的二抗。37℃孵育1h。弃去液体，用洗液清洗5遍。加入100μL的反应底物，37℃避光反应15min，加入100 μL终止液。15min内利用酶标仪检测450nm波长下的吸光值，根据标准曲线计算样品中的FIX浓度。结果见图2。

实施例2：

质粒介导hFIX在HEK293细胞中高效表达

1)构建pCMV-F9-P2A-GFP质粒

将绿色荧光蛋白GFP克隆到上述AAV表达质粒pAAV-F9上的FIX 基因之后，同时去掉FIX基因的终止密码子TAG，在FIX基因和GFP 基因之间添加P2A序列 ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct。将上述AAV表达质粒的启动子替换成CMV启动子。所获得的质粒命名为pCMV-F9-P2A-GFP。质粒示意图见图3；

2)转染

将HEK293T细胞接种于24孔板，细胞密度为10⁵个/孔，12-16h 后，利用Lipo3000转染试剂进行转染。转染后4-6h更换新的培养基。转染后48h，细胞在荧光显微镜下可观察到荧光。收集培养液，1000 g离心5min，所得上清液用于FIX蛋白的检测。

3)ELISA方法检测FIX蛋白

检测方法如上所述，结果见图4。

实施例3：

重组腺相关病毒(AAV)介导FIX基因在HepG2中高效表达人凝血因子FIX

1)重组AAV病毒包装及纯化

采用三质粒包装系统，包括上述AAV表达质粒pAAV-F9、辅助质粒pHelper和包装质粒pRC2/8。

将HEK293T细胞接种于5个15cm的培养皿中，12-18h后，细胞汇合度达到85-90％，且细胞状态良好。转染前1-2h将培养基换成无血清DMEM培养基。

配制DNA-PEI复合物：将124μg pHelper质粒、76μg pRC2/8 质粒和65.1μg pAAV-F9质粒依次加入5mL DMEM培养基中，涡旋混匀；另将1ml浓度为1mg/mL的PEI加入到5mLDMEM培养基中，涡旋混匀；将PEI溶液加入质粒溶液中，涡旋混匀，室温静置20 min。将上述质粒-PEI混合物均匀滴入HEK293T细胞中，轻轻混匀。 4-6h后，将无FBS培养基换成含FBS的完全培养基。

转染后96h，分别收集培养基上清和细胞，细胞冻融后超声破碎。采用碘克沙醇密度梯度离心的方法纯化病毒，并利用100KD的超滤管浓缩。经qPCR测定滴度后，储存于-80℃。

2)AAV感染

将HepG2细胞接种于24孔板，细胞数量为4×10⁴个/孔，培养基体积为500μL/孔。接种后12-18h，将50μL含有上述AAV病毒的培养基加入培养孔，使感染复数(MOI)分别为为10⁵、10⁶、0.5×10⁷。 4-6h后补加500μL培养基。感染后72h，收集培养基，1000g离心 5min后取上清。

3)ELISA方法检测培养基中FIX蛋白浓度

检测方法如上所述，结果见图5。