阅读说明：本技术 一种从丹参中制备丹酚酸b、隐丹参酮、丹参酮i和丹参酮iia的方法 (A method for preparing salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA from Saviae Miltiorrhizae radix ) 是由 唐万 徐剑 杨跃军 石万银 江丹 巫岳 向诗银 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从丹参中制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的方法,具体为获得丹参提取物后用一定量有机试剂溶解做前处理,然后上样进制备液相,在一个程序下可以同时将丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA四种单体成分分离收集。本发明具有操作便利、重现性好、周期短、同时制备4种单体成分等特点,制备的丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA产品具有纯度高的特点。(The invention discloses a method for preparing salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA from salvia miltiorrhiza, which is characterized by dissolving a certain amount of organic reagent for pretreatment after a salvia miltiorrhiza extract is obtained, then loading the solution into a preparation liquid phase, and separating and collecting four monomer components of salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA simultaneously under one program. The method has the characteristics of convenient operation, good reproducibility, short period, simultaneous preparation of 4 monomer components and the like, and the prepared products of the salvianolic acid B, the cryptotanshinone, the tanshinone I and the tanshinone IIA have the characteristic of high purity.)

一种从丹参中制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA 的方法

技术领域

本发明涉及生物医药提取技术领域，具体涉及一种制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的方法。

背景技术

丹参，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品。历代本草均有收录，为我国药典收藏的常用中草药。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。本品味苦，微寒。入心、肝经，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，症瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。

研究表明丹参中主要含丹酚酸类、丹参酮类、挥发油类及无机元素等化学成分，药理活性广泛，其中酚酸类及丹参酮类是丹参发挥药理作用的主要物质基础，在治疗心血管疾病、肝硬化、溃疡、肿廇、新生儿缺氧性脑病等具有显著疗效，对心脑血管系统疾病有很好的治疗作用，还具有抗菌抗炎、抗肿瘤、保护器官等药效。

丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA是丹参中的几个主要功能成分。据药理学研究表明，丹酚酸B对心、脑、肝、肾等器官均具有重要药理作用，并且在抗氧化、保护心脏、保护大脑、抗肿瘤等方面均有较好效果；隐丹参酮具有抗氧化、抗衰老功能，对治疗冠心病、心绞痛、心肌损害有一定疗效；隐丹参酮具有抑菌作用，1mg/ml对金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌均有抑制作用，对溶血性链球菌亦有一定抑制作用；研究证明丹参酮I具有一定的抗雄性激素的作用；丹参酮IIA具有能够改善冠状动脉血循环、血管内皮细胞修复、抗动脉粥样硬化(AS)形成、抗心肌肥厚和防治糖尿病的并发症等功效。

目前，获取这些功能成分主要是从丹参药材中提取分离的方式：一般采用超声提取、逆流提取、萃取等，或是通过一定方式将目标成分修饰改性后再进一步分离，后期进一步借助层析柱及中低压制备相结合的方式进行分离纯化，也有通过超临界流体萃取等方式分离纯化来获得纯度较高的单体化合物，但是这些方式一般具有周期较长，工艺复杂，效率较低、成本较高、分离成分单一等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种便捷、高效、工艺简单、易推广的用于从丹参中分离制备高纯度丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA单体的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：

一种从丹参中制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的方法，步骤如下：

(1)单药提取：取丹参药材粉碎，添加8～10倍量65％～75％乙醇溶液，在55℃～70℃下加热回流提取2-3次，每次50～70min，提取结束后粗滤，合并滤液得丹参提取液；

(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥；

(3)纯化制备：取干燥后的提取物加入100～200倍量60～70％乙醇超声溶解，过0.22μm微孔滤膜后上制备液相，色谱柱为：C18反相色谱柱；

(4)馏分收集：分别收集丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的馏分；

(5)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥，温度50～60℃。

进一步地，步骤(3)中具体色谱条件为：流动相为甲醇：0.1％～0.2％甲酸按照下表梯度洗脱，流速10～20mL/min，检测波长285～290nm和268～275nm双波，柱温25～35℃。

进一步地，步骤(3)中梯度洗脱的条件为：

时间(min)	乙腈(％)	0.1～0.2％甲酸(％)
			0	24～26	76～74
12	24～26	76～74
			15	60～65	40～35
30	60-65	40～35
			35	89～93	11～7
45	89-93	11-7

进一步地，步骤(2)中温度为50～60℃，真空度为0.05-0.08MPa。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

一、工艺便捷：大多数丹参有效成分制备方法主要是通过溶剂逆流提取后再经过树脂层析柱的方式进行吸附除杂，或者借助其他溶剂逐级提纯以达到分离纯化丹参中有效成分的目的；而本发明是将丹参提取后的浓缩液干燥后借助流动相溶解过膜后直接通过制备液相进行分离纯化，从而得到高纯度的丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA，这种方法工艺简单、流程清晰，大大降低了分离纯化的周期。

二、分离高效：相比其他的丹参单体制备方法，本制备方法只需将丹参提取物借助流动相溶解后过膜，在制备液相上进行检测分离，根据对照品吸收峰出峰信息，借助馏分收集器在一个检测分离程序下便可以将4种单体成分分离后依次收集，分离效率高，可以做到一次分离四种单体的效果，相比于其他方法中的反复过树脂、试剂提纯等方法，该方法大大提高了分离的效率。

三、产物纯度高：丹参提取物在经过前处理后，经过制备型液相色谱仪分离纯化，能够获得产品纯度在98％以上的单体成分，杂质少，产品纯度高。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种从丹参中制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的方法，步骤如下：

(1)药材提取：取100g丹参药材，粉碎后添加10倍量体积的65％乙醇溶液，每次1000mL，60℃下提取60min，共提取3次，提取结束后粗滤，收集并合并滤液。

(2)浓缩干燥：将上述提取液在55℃条件下减压浓缩干燥，得到丹参粗提物19g。

(3)制备纯化：取干燥后的丹参提取物适量加入100倍量70％乙醇溶液超声溶解，然后过0.22μm微孔滤膜后得到待制备样品，最后通过制备液相进行分离制备，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，流动相为甲醇：0.1％甲酸按照下表梯度洗脱，流速12mL/min，检测波长286nm和269nm双波长，柱温25℃。

时间(min)	乙腈(％)	0.1％甲酸(％)
			0	24	76
12	24	76
			15	65	35
30	65	35
			35	89	11
45	89	11

(4)馏分收集：分别收集丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA馏分；

(5)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥(温度55℃)，测定各馏分纯度分别为98.0％、99.1％、98.5％和98.9％(与(4)中馏分顺序对应，下同)。

实施例2

一种从丹参中制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的方法，步骤如下：

(1)药材提取：取100g丹参药材，粉碎后添加8倍量体积的70％乙醇溶液，每次1000mL，65℃下提取70min，共提取3次，提取结束后粗滤，收集并合并滤液。

(2)浓缩干燥：将上述提取液在60℃条件下减压浓缩干燥，得到丹参粗提物18g。

(3)制备纯化：取干燥后的丹参提取物适量加入150倍量65％乙醇溶液超声溶解，然后过0.22μm微孔滤膜后得到待制备样品，最后通过制备液相进行分离制备，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，流动相为甲醇：0.15％甲酸按照下表梯度洗脱，流速15mL/min，检测波长288nm和270nm双波长，柱温30℃。

时间(min)	乙腈(％)	0.1％甲酸(％)
			0	25	75
12	25	75
			15	60	40
30	60	40
			35	90	10
45	90	10

(4)馏分收集：分别收集丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA馏分；

(5)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥(温度55℃)，测定各馏分纯度分别为98.2％、99.0％、98.7％和99.2％。

实施例3

一种从丹参中制备丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的方法，步骤如下：

(1)药材提取：取100g丹参药材，粉碎后添加9倍量体积的75％乙醇溶液，每次1000mL，70℃下提取65min，共提取3次，提取结束后粗滤，收集并合并滤液。

(2)浓缩干燥：将上述提取液在50℃条件下减压浓缩干燥，得到丹参粗提物18.5g。

(3)制备纯化：取干燥后的丹参提取物适量加入200倍量60％乙醇溶液超声溶解，然后过0.22μm微孔滤膜后得到待制备样品，最后通过制备液相进行分离制备，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，流动相为甲醇：0.2％甲酸按照下表梯度洗脱，流速18mL/min，检测波长290nm和275nm双波长，柱温30℃。

(4)馏分收集：分别收集丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA馏分；

(5)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥(温度60℃)，测定各馏分纯度分别为98.5％、98.5％、99.3％和99.1％。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。