阅读说明：本技术 一种丙二烯氧化物合成酶、编码基因CsAOS及其应用 (Allene oxide synthetase, coding gene CsAOS and application thereof ) 是由 赵剑 张高阳 崔单单 赵丹丹 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于茶叶加工技术领域,尤其涉及一种丙二烯氧化物合成酶、编码基因CsAOS及其应用。其中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一种来源于茶叶且与茶叶香气相关的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS,且丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在不同适制性红茶绿茶品种中的表达差异显著。本发明通过体外瞬时表达以及体外寡核苷酸反义抑制实验发现并证明了,CsAOS的表达能够显著影响茶叶中挥发性物质以及茉莉酸类物质的含量,为茶叶的加工处理以及培育优良茶树品种提供新的技术手段。(The invention belongs to the technical field of tea processing, and particularly relates to allene oxide synthetase, an encoding gene CsAOS and application thereof. Wherein the nucleotide sequence of the allene oxide synthetase gene CsAOS is shown in SEQ ID NO. 1; the amino acid sequence of the protein coded by the allene oxide synthase gene CsAOS is shown in SEQ ID NO. 2. The invention provides an allene oxide synthetase gene CsAOS which is derived from tea and related to tea aroma, and the allene oxide synthetase gene CsAOS has obvious expression difference in different adaptive black tea and green tea varieties. The invention discovers and proves that the content of volatile substances and jasmonic acid substances in tea can be obviously influenced by the expression of CsAOS through in vitro transient expression and in vitro oligonucleotide antisense inhibition experiments, and provides a new technical means for processing tea and cultivating excellent tea varieties.)

一种丙二烯氧化物合成酶、编码基因CsAOS及其应用

技术领域

本发明属于茶叶加工技术领域，尤其涉及一种丙二烯氧化物合成酶、编码基因CsAOS及其应用。

背景技术

红茶是一种全发酵茶，用适宜的茶树新芽叶为原料，经萎凋、揉捻(切)、发酵、干燥等一系列工艺过程精制而成，是国际茶叶市场上的主要销售茶类，颇受消费者的喜爱。茶叶的多酚类物质在红茶发酵过程中发生氧化还原等一系列反应，使茶叶颜色由绿变红，形成“红叶红汤”的基本特征和香型，从而使红茶具有独特的品味。

茶叶香气是指气味物质不同浓度和比例对嗅觉神经产生影响，使人觉察到的茶叶特有的气味。茶叶香气是对茶叶品质起重要作用的因素之一，影响茶叶香气的因素有很多，如茶树品种、栽培条件、自然环境、加工工艺、储藏方法等，已检测到茶叶中的挥发性成分高达几百种，以醛类、酮类、醇类、酯类等香气化合物为主。这些成分以不同比例的组合，构成了不同香型和类型的茶叶。茶叶中的香气成分物质虽然种类很多，但其含量却微乎其微，鲜叶中仅占0.001％-0.05％(占干物)，红茶中仅占0.01％-0.03％(占干物)。

目前的研究表明，红茶中的香气物质主要来源于3个方面，包括萜烯类化合物如香叶醇、类胡萝卜素降解产生的化合物，如紫罗兰酮等，以及茶叶细胞膜脂质过氧化产生的氧化脂质(Oxylipins)类化合物。多数植物的绿叶中单半乳糖二酰甘油(MGDG)，双半乳糖二酰甘油(DGDG)占绿叶膜脂的80％以上。这两种叶绿体膜脂在茶叶加工过程中，被激活的磷酸酯酶A1(PLA1)作用下分解产生α-亚麻酸(α-Linolenic acid，18:3)，后者经脂氧合酶(LOX)催化生成13S-氢过氧亚麻酸(13-HPOT)。13-HPOT可以在不同的生理状态或环境胁迫下产生不同的分解产物。一方面，13-HPOT由脂氢过氧化物裂解酶(HPL)催化分解为C6-C9挥发性物质，包括3-己烯醛和己醛等具有青草香气的挥发性物质；另一方面，13-HPOT先后在丙二烯氧化物合成酶(AOS)和丙二烯氧化环化酶(AOC)催化下转化为氧化植物二烯酸(OPDA),叶绿体中生成的OPDA被转运蛋白运输至过氧化物酶体中，经由氧化植物二烯酸还原酶(OPDAReductase)以及3次β-氧化最终生成茉莉酸(JA)。JA再被JAMT催化的甲基化反应产生甲基茉莉酸酯。(图1：茉莉酸类物质的合成途径)。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种丙二烯氧化物合成酶、编码基因CsAOS及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS，核苷酸序列见SEQ IDNO.1所示，或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

本发明还披露了一种丙二烯氧化物合成酶，氨基酸序列见SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示序列经过若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有相同蛋白功能的氨基酸序列；或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的，具有98％以上同源性的，且具有相同蛋白功能的氨基酸序列。

本发明还披露了上述的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在制备和/或作为脂氧合酶中的应用。

本发明还披露了上述的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在调整茶叶中挥发性物质含量中的应用。

进一步地，所述茶叶中挥发性物质为庚醛、己醛、2-己烯醛、2,4-己二烯醛、2,4-庚二烯醛、2-己烯-1-醇乙酸酯、2-乙基己醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、壬烯醛、壬醇、香叶醇、3-己烯基酯己酸、3-己烯酸-3-己烯酯或己酸-己基酯中的至少一种。

本发明还披露了上述的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在调整茶叶中茉莉酸类物质含量和/或水杨酸含量中的应用。

进一步地，所述茉莉酸类物质为茉莉酸、茉莉酸氨基酸和甲基茉莉酸酯中的至少一种。

本发明还披露了上述的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在调整茶叶中茉莉酸前提物质OPDA含量中的应用。

本发明还披露了上述的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在作为标志物筛选适合制作绿茶的茶树品种和/或适合制作红茶或黑茶的茶树品种中的应用。

本发明还披露了上述的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS在茶树育种中的应用。

本发明还披露了一种促进茶叶中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量的方法，包括对茶叶进行萎凋、揉捻和发酵处理步骤中的至少一种处理方式。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供了一种来源于茶叶的与茶叶香气相关的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS，且丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS编码的蛋白具有丙二烯氧化物合成酶的功能。

本发明通过检测红茶加工过程中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异发现，红茶的加工萎凋、揉捻和发酵都促进该基因的表达，说明该基因参与红茶的制作过程。

本发明通过体外瞬时表达以及体外寡核苷酸反义抑制实验发现并证明了，CsAOS的表达能够显著影响茶叶中挥发性物质以及茉莉酸类物质的含量，为茶叶的加工处理以及培育优良茶树品种提供新的技术手段。

附图说明

图1是茉莉酸类物质的合成途径；

图2是本发明实施例的舒茶早不同组织中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异；其中，L1:一叶；L2:二叶；L3:三叶；FL:花；FR:果；S:茎；R:根；B:芽；

图3是本发明实施例的红茶加工过程中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异；

图4是本发明实施例的CsAOS在不同适制性茶树品种中的表达；

图5是本发明实施例的体外寡核苷酸反义抑制实验中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量；

图6是本发明实施例的体外寡核苷酸反义抑制实验3d后茉莉酸类物质测定结果；

图7是本发明实施例的体外寡核苷酸反义抑制实验3d后挥发类物质测定结果；

图8是本发明实施例的体外瞬时表达丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量；

图9是本发明实施例的体外瞬时表达3d后茉莉酸类物质测定结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS及其编码蛋白和应用，具体如下各实施例所示。本发明涉及的丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明中涉及的材料：

1、茶树样品：舒茶早茶树种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农业产业园，叶片采摘条件为25℃～28℃。

红茶的制作过程主要为采摘、萎凋、揉捻、发酵、干燥。具体为：采摘舒茶早植株的一芽一叶(此时为鲜叶样本)；在室温摊放16h左右(完成后为萎凋样本)；将茶叶拢成球状先轻揉后重揉再轻揉(完成后为揉捻样本)；用纱布包住茶叶30℃发酵12h(完成后为发酵样本)，发酵期间要每隔2h散开一次然后继续发酵；110℃干燥15min左右(完成后为干燥样本)。

烟草样品：本氏烟草(Nicotiana benthamiana)生长于光照培养室，温度为22℃～25℃。

2、大肠杆菌：DH5α。

3、载体：pGEM-T Easy。

4、LB培养基：称取10g的NaCl，5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，加入950mL去超纯水搅拌溶解，加水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌15min，即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可。

5、氨苄青霉素母液(Amp+，50mg/ml)：称取0.5g氨苄青霉素Amp，溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。

6、配置体外寡核苷酸反义抑制缓冲液：将核苷酸粉末离心(8000rpm,5min)，每管加入2ml 50mMol/L的蔗糖溶液，在涡旋器上震荡数分钟，观察粉末是否完全溶解，若未见颗粒物，即可停止震荡，获得体外寡核苷酸反义抑制缓冲液(以下简称为缓冲液)，再用移液枪移取250ul缓冲液分装于96孔板中，备用。

实施例1舒茶早不同组织、不同茶树品种以及红茶加工过程中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异

1、舒茶早不同组织中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异

分别采摘舒茶早植株的根、茎、花、果、芽、一叶、二叶、三叶，采用高通量测序的方法检测各个样本中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量。

2、红茶加工过程中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异

分别取红茶加工过程中采摘、萎凋、揉捻、发酵、干燥时期的样品，按实施例3中所述方法获得cDNA，进行荧光定量PCR检测，方法如下，同时采用高通量测序的方法进行验证。

正向引物：ACCTCCTTCTAAACCCACCAATC

反向引物：ACCAGGTGGCATGTTGGCTCTG

3、不同适制性茶树品种的CsAOS的表达差异

分别采摘不同适制性茶树品种的三叶，采用高通量测序的方法检测各个样本中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量。

测试结果与分析：

在图2中，可以看到舒茶早不同组织中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异，其在二叶和花中表达量较高，预示着其在这些组织中发挥相应的功能。

在图3中，可以看到红茶加工过程中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达差异，转录组数据和定量PCR的数据都预示着该基因的表达量从萎凋到发酵逐渐升高，说明红茶的加工萎凋、揉捻和发酵促进该基因的表达，同时说明该基因参与红茶的制作过程。

图4是本发明实施例的CsAOS在不同适制性茶树品种中的表达。结果可以看到CsAOS在大多数适合做红茶和黑茶的茶树品种中的表达量显著高于适合做绿茶的的茶树品种的表达量。因此，可以将CsAOS基因表达量作为判断茶树品种适制绿茶和红茶的一个参数。

实施例2体外寡核苷酸反义抑制实验

1、根据AOS预测序列设计合成寡核苷酸反义的引物，设计在网站http:// sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl上完成，引物序列如下：

asODN001041-1 CTGTTGAGTGGTATTTTTCG

asODN001041-2 GTTGGGAGTGGAGTTTGGCT

asODN001041-3 GGGGTCCAGATAGGAGAGGA

asODN001041-4 GTATTGTGATGGCACGGGCG

2、用80mM蔗糖溶液溶解，配制成抑制缓冲液，空白为蔗糖溶液；

3、用剪刀剪下大小基本一致，颜色鲜艳，色泽健康，无虫无病的一芽二叶，插入装有缓冲液的96孔板中，要确保一芽二叶尾部没入缓冲液中。

4、将96孔板放入光照培养箱中按光照16h/黑暗8h进行光照培养，培养箱温度为28℃。

5、取处理后3d引物处理样和空白样。

测试结果与分析：

在图5中，可以看到体外寡核苷酸反义抑制实验中丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量，和对照相比CsAOS显著被抑制，抑制率接近2/3。

在图6中，可以看到体外寡核苷酸反义抑制3d后茉莉酸类物质测定结果，可以看到抑制CsAOS的表达可以显著降低茉莉酸前提物质OPDA和茉莉酸类物质JA、JA-Ile等的含量。和对照相比，超过50％的JA被减少了；同时能够减少水杨酸SA的含量。

在图7中，可以看到体外寡核苷酸反义抑制实验进行3d后挥发物测定结果，结果表明体外抑制CsAOS后庚醛、己醛、2-己烯醛、2,4-己二烯醛、2,4-庚二烯醛、2-己烯-1-醇乙酸酯、2-乙基己醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、壬烯醛、壬醇、香叶醇、3-己烯基酯己酸、3-己烯酸-3-己烯酯、己酸-己基酯的含量增加了，尤其是己醛、2-己烯醛的含量，和对照相比其分别增加了18倍和8倍左右。

实施例3丙二烯氧化物合成酶CsAOS基因的克隆及体外瞬时表达

1、设计特异性引物，画线部分为限制性酶切位点，其引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.3:TGGATCCATGGCTTTTACTTCTCTAGC BamH1

SEQ ID NO.4:CAAGCTTTCAAAAACTAGCTCTCTTGACG Hind3

2、按照植物总RNA提取试剂盒和第一链cDNA合成试剂盒说明书，提取茶树样品的总RNA，并反转录为cDNA。

3、以反转录的cDNA为模板，用上述特异性引物进行扩增，PCR体系：正向引物2微升，反向引物2微升，模板2微升，MIX25微升，ddH₂O19微升；PCR程序：第一步：94℃保持5min。扩增程序为98℃预变性10s，98℃变性10s，57℃退火温度30s，68℃延伸1min，35个循环，68℃继续延伸5min，获得的PCR产物置于4℃保存。

4、将PCR产物利用PCR纯化试剂盒纯化，并连接到pGEM-T Easy后转化DH5α，进行菌落PCR验证、跑胶验证和测序验证，方法如下。获得阳性菌落，获得含有CsAOS基因的T载体(CsAOS-pGEM)，即可获得包含丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS序列的DH5α大肠杆菌。

连接条件：4℃过夜连接。

转化体系：

得到的连接产物加入50μL DH5α中，轻轻混合均匀置于冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激45sec，立即置于冰中，冰浴3min；加入1mL新鲜的LB培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；将培养后的菌液离心，保留300μL上清，重悬混匀，涂板，37℃培养过夜。

5、设计特异性引物，其引物序列如下所示：

F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTTTACTTCTCTAGC

R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAAAAACTAGCTCTCTTGACG

6、用步骤4得到的CsAOS-pGEM作为模板，用步骤5的引物进行扩增，利用同源重组的方法(Gateway技术)，依次经过PCR验证、跑胶验证和测序验证，构建CsAOS-PB2GW7。该融合载体具有35S强启动子，将CsAOS-PB2GW7通过冷冻转化方法转入农杆菌GV3101中。

目的基因的瞬时表达

1.挑取实施例获得的重组菌CsAOS-PB2GW7 GV3101和对照GV3101接种于5mlLB液体培养基(100ug/ml庆大霉素,50ug/ml壮观霉素)中，28℃震荡培养。

2.将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中(加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮)。

3.检测过夜培养的菌液OD600的值。

4.5000g，15分钟集菌，用重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH5.6)，100uM乙酰丁香酮)重悬菌体，最终OD600为0.4。

5.室温放置2-3h后注射烟草。

6.将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7.注射后3天，去注射叶片进行挥发物和茉莉酸类物质分析。

测试结果与分析：

在图8中，可以看到体外瞬时表达丙二烯氧化物合成酶基因CsAOS的表达量，结果表明CsAOS在瞬时表达烟草中的表达量增加了9倍。

图9是本发明实施例的体外瞬时表达3d后茉莉酸类物质测定结果。结果表明瞬时表达后显著增加了茉莉酸类物质的含量，如JA和MeJA分别增加了约20％和29％。

本发明中涉及的检测方法

体外寡核苷酸反义抑制样品的挥发物测定：

1、挥发物的测定采用顶空固相微萃取萃取(headspace solid-phasemicroextraction，HS-SPME)结合气相质谱(GC-MS)(Agilent 7890A)的方法来测，用含有50/30um DVB/CAR/PDMS(Supelco)的萃取头萃取体外寡核苷酸反义抑制样品和空白样品的挥发物，60℃萃取1h，然后取出萃取头插入GC-MS进样口解吸附5min，同时启动仪器开始收集数据。

2、GC-MS检测条件

色谱条件：进样口温度为240℃，载气为高纯氮气，纯度大于99.99％，流速0.8ml/min,不分流进样；色谱柱型号为HP-5MS石英毛细管柱(60m×0.32mm×0.25um)；柱温起始为40℃，保持3min，以2℃/min升至90℃，保持5min，再以3℃/min升至160℃，最后以10℃/min升至250℃，保持5min。

质谱条件：离子源为EI源，离子源温度230℃，电子能量70eV，四极杆温度150℃,接口温度280℃，电子倍增器电压1680V，扫描范围m/z为35～350amu。

茉莉酸类物质的测定：

将样品在液氮中研磨成粉末，并在避光条件下提取，方法如下。

配制提取缓冲液配方，甲醇：ddH₂O:乙酸＝80:19:1(V:V:V)。称取约0.1g样品于2ml离心管中，加入750μl抽提液，颠倒混匀，置于冰上，此过程需在避光条件下进行。然后4℃，避光条件下旋转抽提16h以上。4℃，13000rpm离心10min，吸上清于一新离心管中，再次加入750μl抽提液，4℃，避光抽提16h以上，离心，合并两次上清液。0.22um滤膜过滤(有机系滤膜)，用氮气慢慢吹干，加200μl甲醇，颠倒几次后4℃溶解3～6h。(此过程在避光条件下进行)。溶解液在4℃，13000rpm离心15min后，轻轻吸取上清180μl于内插管中，放置于质谱专用样品瓶中等待上机检测。

用液质联用技术分析激素样品，液相色谱仪是岛津LC-20AD型，定量分析采用外标法。

检测方法如下：

液相色谱采用二元溶剂体系，流动相：A液为甲醇，B液为0.05％的甲酸水溶液，选择Eclipse plus C18(5μm,2.1*150mm)色谱柱，控制流速为300uL/min，柱温30℃，每次进样为10μL。采用梯度洗脱，甲醇起始的梯度为10％，保持2min，逐渐增加到10min时为90％保持5min。在15.1min时，甲醇降低到起始的梯度，并保持7min。

表1植物激素的液相洗脱条件

质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI)，离子源的电压为-4.5KV，离子源的温度为500℃，以N2为辅助加热气gas2(50psi)，雾化气gas1(60psi)和气帘气(30psi)，待测物均为负离子模式。标准的混合物在反相液相色谱中得到分离，串联三重四级杆质谱多反应检测(MRM)模式下定量分析，扫描的时间为50ms。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种丙二烯氧化物合成酶、编码基因CsAOS及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1572

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(CsAOS)

<400> 1

atggctttta cttctctagc tttgccttcc ctgcaactac aattcttgac acaacggcct 60

ccaaaagtat catcaaaacc atactcaatt caccacccaa tctatgcttc cgtatccgaa 120

agaccatctg cgccacctcc tccggcgacg ccgaaaatga aacctccttc taaacccacc 180

aatcttccca ttcagaaaat cccaggaaac tatggccctc ccttaattgg tcccatcaaa 240

gacagactcg actacttcta caaccaaggc acagtcgaat tcttcaagtc tcgaagcgaa 300

aaataccact caacagtttt cagagccaac atgccacctg gtcccttcat ttcctccaac 360

cccaacgtgg tcgttcttct ggacggcaag agcttcccag tcctcttcga cgtcacaaaa 420

gtcgaaaaga aagacctctt cacagggact ttcatgccct ccaccgaact caccggtggt 480

taccgagtcc tctcctatct ggacccctcg gagcctaagc atgccaagct caagcaactc 540

atgttctttc tactcaaatc agggcgagac aaagtgatac cagagttcca ctcgagcttc 600

acagacctct tcgagaccct tgaagccgaa ctggcaagca aaggcaaagc agcatttagc 660

gatgccaatg accaggcttc tttcaatttc ttagctcggt cactcttcgg gaccaaccca 720

gccgatacca aactcggact cgacggaccc aatttgatag ccatatggat atttttccaa 780

ctggctcctt tgataaccct tggcctccca aagttggtgg aagagctact catccacact 840

tttcctctcc ctccagtact catcaaaaaa gactaccaaa gattgtacga ttttttctac 900

aactcgtcaa catccatcct cgacgaagcc gagaaaattg gcctctcccg cgaagaggct 960

tgccacaatc tcttattcgc cacgtgcttc aattccttcg gcggaatgaa aatctttttc 1020

cccagcatga tcaaatggat cggccatgct ggagccaaac tccactccca actcgccgag 1080

gagatccgat cagccgtcag atccagcggc gggaaagtga cgatggccgg gatggaacag 1140

atgccgttga tgaagtccgt agtgtacgaa tcgctgagga tcgacccgcc cgtgccatca 1200

caatacggtc gagcgaaacg ggacatggtg atagagtctc atgacgcagc gtttgaggtg 1260

aaagaagggg aaatgttatt tgggtaccaa ccatttgcga ctaaagatcc gaagatattc 1320

gagaggccgg aggagtttgt ggcggaccgg ttcgtcggag aggagggaga gaagatgttg 1380

aggcacgttc tgtggtcgaa tggaccggag accgagagca cgacggtggg aaacaagcaa 1440

tgcgcgggga aggacttcgt ggtgatggtg tcgaggttgt tgctggtgga gttgtttcta 1500

cgttatgatt cgtttgagac ggaggttggt tcttcagtta ctataacgtc cgtcaagaga 1560

gctagttttt ga 1572

<210> 2

<211> 523

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(CsAOS)

<400> 2

Met Ala Phe Thr Ser Leu Ala Leu Pro Ser Leu Gln Leu Gln Phe Leu

1 5 10 15

Thr Gln Arg Pro Pro Lys Val Ser Ser Lys Pro Tyr Ser Ile His His

20 25 30

Pro Ile Tyr Ala Ser Val Ser Glu Arg Pro Ser Ala Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Ala Thr Pro Lys Met Lys Pro Pro Ser Lys Pro Thr Asn Leu Pro Ile

50 55 60

Gln Lys Ile Pro Gly Asn Tyr Gly Pro Pro Leu Ile Gly Pro Ile Lys

65 70 75 80

Asp Arg Leu Asp Tyr Phe Tyr Asn Gln Gly Thr Val Glu Phe Phe Lys

85 90 95

Ser Arg Ser Glu Lys Tyr His Ser Thr Val Phe Arg Ala Asn Met Pro

100 105 110

Pro Gly Pro Phe Ile Ser Ser Asn Pro Asn Val Val Val Leu Leu Asp

115 120 125

Gly Lys Ser Phe Pro Val Leu Phe Asp Val Thr Lys Val Glu Lys Lys

130 135 140

Asp Leu Phe Thr Gly Thr Phe Met Pro Ser Thr Glu Leu Thr Gly Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Val Leu Ser Tyr Leu Asp Pro Ser Glu Pro Lys His Ala Lys

165 170 175

Leu Lys Gln Leu Met Phe Phe Leu Leu Lys Ser Gly Arg Asp Lys Val

180 185 190

Ile Pro Glu Phe His Ser Ser Phe Thr Asp Leu Phe Glu Thr Leu Glu

195 200 205

Ala Glu Leu Ala Ser Lys Gly Lys Ala Ala Phe Ser Asp Ala Asn Asp

210 215 220

Gln Ala Ser Phe Asn Phe Leu Ala Arg Ser Leu Phe Gly Thr Asn Pro

225 230 235 240

Ala Asp Thr Lys Leu Gly Leu Asp Gly Pro Asn Leu Ile Ala Ile Trp

245 250 255

Ile Phe Phe Gln Leu Ala Pro Leu Ile Thr Leu Gly Leu Pro Lys Leu

260 265 270

Val Glu Glu Leu Leu Ile His Thr Phe Pro Leu Pro Pro Val Leu Ile

275 280 285

Lys Lys Asp Tyr Gln Arg Leu Tyr Asp Phe Phe Tyr Asn Ser Ser Thr

290 295 300

Ser Ile Leu Asp Glu Ala Glu Lys Ile Gly Leu Ser Arg Glu Glu Ala

305 310 315 320

Cys His Asn Leu Leu Phe Ala Thr Cys Phe Asn Ser Phe Gly Gly Met

325 330 335

Lys Ile Phe Phe Pro Ser Met Ile Lys Trp Ile Gly His Ala Gly Ala

340 345 350

Lys Leu His Ser Gln Leu Ala Glu Glu Ile Arg Ser Ala Val Arg Ser

355 360 365

Ser Gly Gly Lys Val Thr Met Ala Gly Met Glu Gln Met Pro Leu Met

370 375 380

Lys Ser Val Val Tyr Glu Ser Leu Arg Ile Asp Pro Pro Val Pro Ser

385 390 395 400

Gln Tyr Gly Arg Ala Lys Arg Asp Met Val Ile Glu Ser His Asp Ala

405 410 415

Ala Phe Glu Val Lys Glu Gly Glu Met Leu Phe Gly Tyr Gln Pro Phe

420 425 430

Ala Thr Lys Asp Pro Lys Ile Phe Glu Arg Pro Glu Glu Phe Val Ala

435 440 445

Asp Arg Phe Val Gly Glu Glu Gly Glu Lys Met Leu Arg His Val Leu

450 455 460

Trp Ser Asn Gly Pro Glu Thr Glu Ser Thr Thr Val Gly Asn Lys Gln

465 470 475 480

Cys Ala Gly Lys Asp Phe Val Val Met Val Ser Arg Leu Leu Leu Val

485 490 495

Glu Leu Phe Leu Arg Tyr Asp Ser Phe Glu Thr Glu Val Gly Ser Ser

500 505 510

Val Thr Ile Thr Ser Val Lys Arg Ala Ser Phe

515 520

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(BamH1)

<400> 3

tggatccatg gcttttactt ctctagc 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Hind3)

<400> 4

caagctttca aaaactagct ctcttgacg 29