阅读说明：本技术 一种与胡萝卜类胡萝卜素合成相关的DcLCYB1基因序列及其应用 (DcLCYB1 gene sequence related to synthesis of carrot carotenoid and application thereof ) 是由 熊爱生 王雅慧 徐志胜 于 2018-08-09 设计创作，主要内容包括：番茄红素β-环化酶(Lycopeneβ-cyclase,LCYB)是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶。本发明从胡萝卜品种‘山西黄胡萝卜’中克隆得到一个DcLCYB1基因,该基因含有一个1527bp的开放阅读框(ORF),编码508个氨基酸,属于亲水性蛋白。二级结构预测显示,胡萝卜DcLCYB1蛋白由38.98％的α-螺旋、4.13％的β-折叠、16.14％的延伸主链和40.75％的随机卷曲组成。荧光定量结果显示,DcLCYB1基因在黄色和紫色品种胡萝卜的叶片中表达水平较高；而红色胡萝卜品种中仅在叶柄中少量表达。本发明利用RT-PCR技术从胡萝卜中克隆得到DcLCYB1基因,该基因能够调控胡萝卜中类胡萝卜素的积累,从而影响胡萝卜的营养品质。(The invention clones a DcLCYB1 gene from a carrot variety 'Shanxi yellow carrot', the gene comprises an Open Reading Frame (ORF) of 1527bp, codes 508 amino acids and belongs to hydrophilic protein.)

一种与胡萝卜类胡萝卜素合成相关的DcLCYB1基因序列及其 应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及胡萝卜的一个类胡萝卜素合成相关基因及其应用。具体为从胡萝卜品种‘山西黄胡萝卜’中克隆得到一个类胡萝卜素合成相关基因DcLCYB1，该基因可以用于胡萝卜类胡萝卜素合成研究及应用。

背景技术

胡萝卜(Daucus carota L.)属于伞形科(Apiaceae)胡萝卜属二年生草本植物，是一种重要的根菜类蔬菜作物(刘李峰，上海蔬菜，2006，2：4-6)。胡萝卜起源于亚洲西南部，具有2000多年的栽培历史。我国胡萝卜栽培面积广泛，占全世界总面积的37％，是世界第一大胡萝卜生产国(***粮食及农业组织，2016)。胡萝卜肉质根中含有多种营养物质，如类胡萝卜素、维生素、矿物质以及特殊的果胶质等(阮婉贞，中国食物与营养，2007，6：51-53)。类胡萝卜素是一类重要的天然萜类色素。作为维生素A的前体，类胡萝卜素在植物生长发育过程中起着至关重要的作用，同时还具有抗氧化、抗癌、延缓衰老等功效(朱运钦等，分子植物育种，2016，2：471-474)。

番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase，LCYB)是类胡萝卜素合成途径中的一个重要调节酶。在番茄红素β-环化酶(LCYB)的催化作用下，番茄红素两端被环化生成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素(朱长甫等，植物生理与分子生物学学报，2004，30(6)：609-618)。通过调控LCYB基因的表达可以改变作物中类胡萝卜素的种类及含量，继而提高作物的品质和商品价值。番茄红素β-环化酶LCYB基因最早在拟南芥中发现，目前在番茄(Solanum lycopersicumL.)、辣椒(Capsicum annum L.)、欧李(Cerasus humilis(Bge)Sok.)、金盏花(Calendulaofficinalis L.)等植物均已克隆得到了番茄红素β-环化酶LCYB基因(张建成等，园艺学报，2017，44(11)：2075-2088)，但在我国地方品种胡萝卜中研究仍很缺乏。

发明内容

本发明提供了一种胡萝卜类胡萝卜素合成相关基因DcLCYB1的制备方法和用途。所获得的DcLCYB1基因有利于进一步了解胡萝卜类胡萝卜素合成机制，同时也能用于胡萝卜营养品质的改良。

附图说明

图1.胡萝卜DcLCYB1蛋白的保守域预测结果

图2.胡萝卜与其他物种LCYB蛋白的进化分析

图3.胡萝卜DcLCYB1蛋白氨基酸序列的疏水性(A)和亲水性(B)分析

图4.胡萝卜DcLCYB1蛋白的二级结构预测

图5.胡萝卜DcLCYB1基因在不同颜色胡萝卜中的表达分析

具体实施方式

1.胡萝卜总RNA的提取与cDNA的合成：胡萝卜材料为黄色胡萝卜品种‘山西黄胡萝卜’、红色胡萝卜品种‘陕西红胡萝卜’与紫色胡萝卜品种‘云南紫胡萝卜’，上述胡萝卜品种由南京农业大学伞形科蔬菜作物遗传与种质创新实验室保存，植株种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。使用植物总RNA提取试剂盒RNA simple Total RNAKit(北京天根生化科技有限公司)提取胡萝卜样品的总RNA。按照反转录试剂盒HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司)说明书将RNA样品反转录为cDNA。

2.胡萝卜DcLCYB1基因的克隆：根据本课题组的胡萝卜转录组数据库(Xu et al.，Database，2014，bau096)检索得到胡萝卜DcLCYB1基因，根据基因全长序列设计一对克隆引物：正向引物序列为5’-ATGAAAGTGATGGATACTCTACT-3’；反向引物序列为5’-CTATTCTCTATCTTTGATCAGAT-3’。以前述所得‘山西黄胡萝卜’cDNA为模板，采用20μL体系进行PCR扩增，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。采用1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收后连接到pMD19-T载体(大连TaKaRa生物科技有限公司)，转化于大肠杆菌DH5α中由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

3.序列分析：在NCBI相关网站(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)中完成核苷酸和氨基酸序列的搜索和保守域预测；不同物种间LCYB蛋白多重序列比对及胡萝卜LCYB 1蛋白疏水性/亲水性分析采用DNAMAN 6.0完成；利用MEGA 5.0软件(Tumara et al.，Mol BiolEvol，2011，28(10)：2731-2739)构建系统进化树；蛋白质二级结构预测借助SOPMA网站(http：//pbil.ibcp.fr/)完成。

4.实时荧光定量PCR反应：利用Primer Premier 6.0软件(Singh et al.，Biotechniques，1998，24(2)：318-319)设计DcLCYB1基因表达检测引物，正向引物序列为5’-TTGCTAGATTGCCTTGACACTAC-3’；反向引物序列为5’-GATGTTCTTCTACTTCTGCCACTAT-3’。利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)检测DcLCYB1基因在三种不同颜色品种胡萝卜叶片、叶柄及根中的表达量，扩增利用CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)及配套软件完成，扩增程序如下：95℃5min；95℃10s，60℃10s，72℃30s，共40个循环；随后通过由60℃至95℃逐步扩增获得熔解曲线。选用胡萝卜DcActin基因作为内参基因(Wang et al.J Hortic Sci Biotechnol，2016，91(3)：264-270)，利用相对定量法计算DcLCYB1基因在不同品种胡萝卜不同组织中的表达量(Pfaffl，Nucleic Acid Res，2001，29(9)：e45)。

5.试验结果：1).序列测定结果表明，DcLCYB1基因含有一个1527bp的开放阅读框(ORF)，编码509个氨基酸；保守域预测显示DcLCYB1蛋白含有1个高度保守的结构域(图1)。2).将DcLCYB1基因编码的氨基酸序列与其他物种LCYB蛋白进行序列比对，构建进化树。结果表明，胡萝卜DcLCYB1蛋白与茄科的枸杞、番茄及辣椒亲缘关系较近(图2)。3).对DcLCYB1蛋白进行疏水性/亲水性分析发现，DcLCYB1蛋白中亲水性氨基酸数量多于疏水性氨基酸，属于亲水性蛋白(图3)。4).DcLCYB1蛋白的二级结构预测结果表明，DcLCYB1蛋白的主要组成部分包括38.98％的α-螺旋、4.13％的β-折叠、16.14％的延伸主链和40.75％的随机卷曲(图4)。5).荧光定量表达分析结果发现，DcLCYB1基因在黄色品种‘山西黄胡萝卜’与紫色品种‘云南紫胡萝卜’叶片中表达水平较高，在叶柄与根中表达量较低；而在红色品种‘陕西红胡萝卜’中，DcLCYB1基因仅在叶柄中少量表达，叶片与根中几乎不表达。