阅读说明：本技术 一种采用绿藻pmi作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法 (Method for adopting green alga PMI as tomato genetic transformation screening marker gene ) 是由 林渊源 黄俊潮 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法。该方法包括绿藻PMI的克隆,植物双元表达载体的构建,番茄的转化及转基因番茄的鉴定等步骤。该基因能替代目前广泛使用的抗生素基因、抗除草剂基因及大肠杆菌来源PMI等异源基因作为标记基因应用于番茄的遗传转化,获得更具食品安全性、生物安全性和生态安全性的转基因番茄。(The invention provides a method for selecting a marker gene by using green alga PMI as tomato genetic transformation. The method comprises the steps of cloning green alga PMI, constructing a plant binary expression vector, transforming tomato, identifying transgenic tomato and the like. The gene can replace the currently widely used antibiotic gene, herbicide resistance gene, escherichia coli source PMI and other heterologous genes as marker genes to be applied to genetic transformation of tomatoes, and the transgenic tomatoes with higher food safety, biological safety and ecological safety are obtained.)

一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法

技术领域

本发明涉及遗传工程领域，特别是涉及安全筛选标记基因在转基因植物中的筛选和应用。

背景技术

番茄，原产于中美洲和南美洲，为茄科一年生或多年生草本植物，又名西红柿、洋柿子。番茄富含番茄红素和β-胡萝卜素及其它多种营养成分，十分有益于身体健康，是世界上种植最广泛的蔬果之一。自第一个转基因番茄品种“Flavr-Savr”于1994年在美国批准上市以来，转基因番茄在美国、欧盟、日本、拉丁美洲等多个国家和地区已获批种植上市。转基因番茄研究蓬勃发展，各种耐储存，高营养，抗病，耐盐，耐寒，耐旱转基因番茄品种相继研制成功，优良的品种是番茄产业发展的基础，越来越多的具有优良性状的转基因番茄将进入商业化种植，转基因番茄产业商机无限。

随着转基因生物技术蓬勃发展，商业化的转基因番茄不断出现，人们对转基因食品安全性问题也越来越关注。转基因植物含有的病原菌来源的抗性标记基因倍受人们诟病并成为制约转基因生物发展的重要因素。转基因筛选普遍使用抗生素和除草剂为筛选标记，其存在的风险主要有：抗性标记是否会诱发微生物和植物的广谱抗性，产生现有抗生素和除草剂不能杀灭的“超级细菌”和“超级杂草”；抗性标记的应用是否会影响生态平衡以及其他潜在负面影响。目前人们主要从两个方向来解决转基因植物中选择标记的安全性问题：一是标记回避或剔除，此过程较复杂，且难度大，不能普遍采用。二是发展生物安全的选择标记。近年来，科学家也提出尽量利用植物本身基因及调控原件用作转基因作物的选择标记，发展这类绿色选择标记，可以消除人们对转基因植物安全隐患的担忧，具有很好的发展前景。比如大肠杆菌来源的6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸，PMI基因可作为潜在的选择标记基因。

番茄转基因产业发展迅猛，人们对标记基因的安全性显然具有更高的要求，但目前还没有一种优良的安全的遗传转化筛选系统，发展一种绿藻来源的安全标记基因应用于番茄转基因工程成为迫切需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供以绿藻基因作为番茄遗传转化安全筛选标记的方法和应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法，其标记基因为绿藻起源，筛选剂为安全无毒的甘露糖，该方法包括以下步骤：

PMI的克隆

通过PCR技术克隆来自于Chlorococcumsp.的PMI磷酸甘露糖异构酶基因，获得安全标记基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

表达载体的构建

将标记基因酶切后连接引入双元载体PBI121以代替其原有的卡那抗性基因NPTⅡ，新载体无NPTⅡ标记而带有安全筛选标记PMI,命名为PMI-pBI121，采用电击转化法导入农杆菌LBA4404；

番茄的遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，培养2天后，转入含不同浓度的甘露糖的筛选培养基筛选培养，出芽后转入生根培养基生根得到转基因植株；

转基因番茄的鉴定

PCR鉴定是否为转基因植株；氯酚红实验验证是否为转基因植株。

根据所述的一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法，其中所述的绿藻为Chlorococcumsp。

根据所述的一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法，其中所述的表达载体的构建删除了抗生素标记基因。

根据所述的一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法，其中所述的表达载体是PMI-PBI121。

根据所述的一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法，其甘露糖的筛选浓度为6g/L。

本发明同时提供了所述的一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法在转基因番茄的建立中的应用。

根据所述的应用，其采用下述方法建立转基因番茄：

PMI的克隆：通过PCR技术克隆来自于Chlorococcumsp.的PMI磷酸甘露糖异构酶基因，获得安全标记基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

表达载体的构建：将标记基因酶切后连接引入双元载体PBI121以代替其原有的卡那抗性基因NPTⅡ，新载体无NPTⅡ标记而带有安全筛选标记PMI,命名为PMI-pBI121，采用电击转化法导入农杆菌LBA4404；

番茄的遗传转化：采用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，培养2天后，转入含不同浓度的甘露糖的筛选培养基筛选培养，出芽后转入生根培养基生根得到转基因植株；

转基因番茄的鉴定：用PCR鉴定是否为转基因植株；氯酚红实验验证是否为转基因植株。

本发明另外还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的安全标记基因，其是通过PCR技术克隆来自于Chlorococcumsp.的PMI磷酸甘露糖异构酶基因所得到。

与现有技术相比，本发明的优益性在于：

其一，建立了一种以绿藻起源的、生态环境友好型的番茄遗传转化安全筛选标记系统：从绿藻中扩增PMI基因构建到植物双元表达载体后转化番茄，通过可食用的甘露糖为筛选剂获得转化植株，建立新的番茄转化系统。与来源于其他微生物的筛选标记基因相比，PMI起源于可食用的绿藻，筛选剂安全无毒，因此更具有食品安全性及生态安全性。

其二，转化载体去除了抗生素标记基因，且保留了多克隆位点，便于外源基因的克隆，是一种可用于遗传工程的纯天然植物基因表达载体。

其三，因为番茄作为模式植物，那么其高效广谱的植物筛选方法可应用于其他植物的筛选转化，具有广阔的前景。

总之，本发明从植物祖先单细胞绿藻Chlorococcumsp.中克隆PMI基因作为植物基因转移技术新一代的选择性标记基因，建立了以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选的新型筛选方法，能替代目前广泛使用的抗生素或抗除草剂基因及大肠杆菌来源的PMI基因作为标记基因存在的弊端，更具食品、生物、生态安全性，有利于解除公众对标记基因安全性的顾虑，促进转基因番茄产业的发展。

附图说明

图1是中间载体PTZ57-P-T示意图；

图2是植物双元载体pBI121示意图；

图3是将PMI克隆到图1后的载体PTZ57-P-PMI-T示意图；

图4是将PMI克隆到图2后的载体PMI-pBI121示意图；

图5是番茄子叶在不同甘露糖浓度MS诱愈培养基上生长6周后效果示意图：a-d培养基中分别含0，3，6，9g/L甘露糖；

图6是转PMI-pBI121番茄转基因苗培育示意图：a为子叶在6g/L甘露糖诱芽MS培养基生长图；b为1-2cm芽；c为已生根阳性芽；d为转基因番茄入土成苗；

图7是PCR检测转PMI-pBI121番茄转基因苗示意图：WT为野生番茄，1-10为转化番茄；

图8是氯酚红检测转PMI-pBI121番茄转基因叶片PMI活性示意图。

具体实施方式

以下结合附图，用实施例进一步说明本发明的内容，但并不因此而限定本发明的内容。

除非有特殊说明，本发明中的引物合成和DNA序列测定由上海捷瑞生物工程有限公司完成；本发明所用的限制性内切酶、连接酶、高纯质粒小量制备试剂盒、DNA片段回收试剂盒均购自于NEB，按说明书方法操作。

实施例1

植物表达载体的构建。

多克隆位点中已***NOS Promoter和NOS Terminator的中间载体PTZ57-P-T(图1)及pBI121(图2)由本实验保存。

1PMI基因的克隆

根据本实验室对绿藻Chlorococcum sp.的转录组测序后的数据，利用软件genetool设计全长引物：PMI F 5'GCGTCGACATGCTATCACTGGTGTGCCCAGCA3'PMI R 5'TTCGAGCTCCTACAGCTGGCGCGAACACCTTG 3'，以绿藻Chlorococcumsp.的cDNA为模板，利用高保真酶扩增全长基因，回收DNA片段并测序鉴定后备用。

2转化载体的构建

PMI回收片段和中间载体PTZ57-P-T分别由SalⅠ和SacⅠ双酶切后回收，连接转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR检测后提取阳性质粒PTZ57-P-PMI-T(图3)。PTZ57-P-PMI-T和pBI121分别由NheⅠ和ClaⅠ双酶切后回收，连接转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR检测后提取阳性质粒PMI-pBI121(图4)。PMI-pBI121测序鉴定后转化农杆菌菌株LBA4404，留备番茄侵染。电转化仪采用Bio-RadGene Pulser X cell^TM，电转条件为：2.5KV，电容25μF，电阻400Ω。

实施例2

番茄转化筛选甘露糖浓度的确定。

番茄无菌子叶切成0.5×0.4cm大小，置于额外添加0，3，6，9g/L甘露糖的MS(Murashige and Skoog)诱愈培养基(含0.05mg/L IAA+2mg/L ZT)中培养，结果表明6g/L甘露糖能明显抑制子叶愈伤的发生而不损伤子叶本身(图5)，以此浓度作为番茄转化筛选的浓度。

实施例3

番茄的遗传转化。

1叶盘法转化番茄

采用农杆菌介导的叶盘法转化法将质粒PMI-pBI121转化番茄。番茄无菌子叶切成0.5×0.4cm大小，在MS基本培养基上预培养2天；预培养过的子叶用含质粒PMI-pBI121的农杆菌侵染10min后滤纸吸干转入MS共培养基(含0.05mg/L IAA+2mg/L ZT+100μM AS)，暗培养1天，光培养1天；用MS液体清洗两遍后转移至MS诱愈培养基中(含0.1mg/L IAA+2mg/L ZT+6g/L甘露糖+300mg/L特美汀)，每2周换一次培养基，长出愈伤后转入MS诱芽培养基(含0.05mg/L IAA+1mg/L ZT+6g/L甘露糖+300mg/L特美汀)；待芽长到1-2cm时切下转入MS生根培养基(含0.1mg/L IAA+6g/L甘露糖+100mg/L特美汀)；待根系发达后转入土壤定植(图6)。

2转化番茄的检测

剪取转化番茄叶片用CTAB法提取DNA后用PMI引物进行PCR检测(图7)，获得阳性植株。

对PCR鉴定阳性植株成苗叶片，本发明用氯酚红显色反应检测了植物体内PMI的酶活，结果表明转基因阳性苗叶片中PMI具有较高活性(图8)。

序列表

<110> 中国科学院昆明植物研究所

<120> 一种采用绿藻PMI作为番茄遗传转化筛选标记基因的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1258

<212> DNA

<213> 绿藻(Chlorococcum sp.)

<400> 1

atgctatcac tggtgtgccc agcacaaaac tacgcctggg gaaggccggc tgcggagagt 60

gaggtcgcca agcttgcatc cttgaacggc tccgtggtcg atgattccaa gcctttcgcc 120

gaactctgga tggggacaca tcccagcggc ccagcagtgg tatcagggca taacaccaca 180

ctgaaggaat ggatccaggc acacccagaa gctcttggtg atgctgtctt gaaacgattt 240

ggtacagacc taccctacct gtttaaggtg ttgtcagtca agacagcact gtcaatccag 300

tcacaccctg acaaggcact ggcagagagg ctgcatgcac agaatcccaa agactacaag 360

ggcgacaacc acaagccgga gatggctctt gctcttgacg gctttgaggc gctgtgtggg 420

tttgtgtcag cagatgagct caagcaggcg ctcaaagcaa accccgagct caagctttgc 480

gtaggggagc ttgtcgcaaa tgccttcttg gaggtgcctg ctgatggtgc aaagtctgct 540

ctgaaggctg cctttacagc gctgatgacc tgtgacaccg ccaaggtgtc ggctgccatc 600

aactccctgg tgcagcgcct gagccaggag gcagcagcag gcaggcagct cagtggcaag 660

gaacagctgc tgctcaggct caatgagcag tatcccaatg atgttggagt actgtcagca 720

tttttcttga atcaggttag gctgaacaat ggtgaagcca tctacctggc tgccaatgag 780

cctcatgcat atgtatctgg tgaactcgtg gagtgcatgg ccgccagtga caatgtcatc 840

agggcgggac tcacacctaa gttcagggat actgaagtgc tgtgtgacag cctcacatac 900

aacacgggag tgccagaagt cctcaagggc gaacgtatcc acgatcacgt caaagtgtac 960

cggccaccct tcgaagagtt cgagatccag cgcatggagg tgccagcggg ggagtctgta 1020

gcagcaccaa caaaccctgg gcctctgttg ttgcttgtgg accgaggtgc aggcactgca 1080

gaagcagcag cggcagctgg catgaaaggc gatggcctgc agcagcaagt agagctccat 1140

cgcggtagca tattgttcgt gccggctgcc actgggttgt cattcacggc ctctgctacg 1200

gacggcctga caatgtgggc agctgcttgc aatgccaagg tgttcgcgcc agctgtag 1258