具体实施方式

质粒p415购买自SnapGene。用于构建质粒的大肠杆菌DH5α购自北京擎科生物科技有限公司。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741、毕赤酵母Pichia pastorisGS115、大肠杆菌Escherichia coli DH5α和罗尔斯通氏菌Ralstonia eutropha H16购买自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。DNApolymerase、限制性内切酶与T4连接酶购买自NEB公司。质粒提取试剂盒购买自AXYGEN有限公司，PCR产物核酸纯化试剂盒购买自ThermoScientific公司。

大肠杆菌的培养基使用LB培养基，配方为：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，去离子水1L。

酿酒酵母的培养基使用SCD-LEU培养基，配方为：无氨基酵母氮源(Difco，Boom，The Netherlands)1.7g，硫酸铵5g，CMS-LEU(MP Biomedicals，Solon，Ohio)0.69g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，去离子水1L。

酿酒酵母的培养基使用SCD-LEU-ARG+canavanine培养基，配方为：无氨基酵母氮源(Difco，Boom，The Netherlands)1.7g，组氨酸0.02g，甲硫氨酸0.02g，尿嘧啶0.02g，苯丙氨酸0.05g，酪氨酸0.05g，硫酸铵5g，葡萄糖20g，刀豆氨酸60mg，琼脂粉20g，去离子水1L。

罗尔斯通氏菌使用MM培养基，配方为：9g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，80mg/L MgSO₄·7H₂O，1mg/L CaSO₄·2H₂O，0.56mg/L NiSO₄·7H₂O，0.4mg/L柠檬酸铁，200mg/L NaHCO₃，1mL/L微量元素，以10mg/mL果糖为碳源。

毕赤酵母使用的SED培养基的配方为：1.7g/LYNB，1.107g/L谷氨酸钠，20g/L葡萄糖为碳源。毕赤酵母使用的SEM培养基的配方为：1.7g/L YNB，1.107g/L谷氨酸钠，6％甲醇为碳源。

图1为本发明增加基因组突变率的碱基编辑系统的原理图。下述实施例或应用例中用到的引物序列如表1所示，本发明所用的基因序列如表2所示。

表1本发明所用的引物序列表

表2本发明所用的基因序列表

在下文和附图中，y415代表转化了质粒p415的酿酒酵母作为对照1；yAPOBEC代表转化了质粒p415-APOBEC的酿酒酵母，作为对照2；yRFA1代表转化了质粒p415-APOBEC-RFA1的酿酒酵母；yRFA2代表转化了质粒p415-APOBEC-RFA2的酿酒酵母；yRFA3代表转化了质粒p415-APOBEC-RFA3的酿酒酵母；yPRI1代表转化了质粒p415-APOBEC-PRI1的酿酒酵母；yHCS1代表转化了质粒p415-APOBEC-HCS1的酿酒酵母；yTOP1代表转化了质粒p415-APOBEC-TOP1的酿酒酵母。

实施例1：一类增加基因组突变率的碱基编辑系统及应用

1、基因组表达载体，其制备过程如下：

(a)扩增APOBEC序列(基因序列如SEQ ID No.1所示)：

PCR反应体系如下：50μL反应体系中含有Q5 DNA polymerase mix 25μL，上游引物与下游引物各2.5μL，模板1μL以及ddH₂O 19μL。PCR循环程序为预变性98℃2min；变性98℃10s，退火55℃10s，延伸72℃4min，循环31次；延伸72℃2min，保存4℃。特异性DNA单链结合蛋白扩增PCR循环程序为预变性98℃2min；变性98℃10s，退火55℃10s，延伸72℃2kb/min，循环30次；延伸72℃2min，保存4℃。PCR得到的片段经PCR产物纯化试剂盒纯化回收。

用于扩增的引物为APOBEC-For(本发明所用引物见表1)和APOBEC-Rev，模板为xCas9(3.7)-BE4(http：//www.addgene.org/search/catalog/plasmids/？q＝108381)，按上述反应扩增包含GAP启动子和APOBEC1(不含终止密码子)的APOBEC序列。

(b)以各菌株的基因组为模板，扩增相应的特异性DNA单链结合蛋白编码的基因序列：

PCR反应体系同上。在酿酒酵母中，用于RFA1(基因序列如SEQ ID No.2所示)扩增的引物为RFA1-For和RFA1-Rev；用于RFA2(基因序列如SEQ ID No.3所示)扩增的引物为RFA2-For和RFA2-Rev；用于RFA3(基因序列如SEQ ID No.4所示)扩增的引物为RFA3-For和RFA3-Rev；用于PRI1(基因序列如SEQ IDNo.5所示)扩增的引物为PRI1-For和PRI1-Rev；用于HCS1(基因序列如SEQ ID No.6所示)扩增的引物为HCS1-For和HCS1-Rev；用于TOP1(基因序列如SEQ ID No.7所示)扩增的引物为TOP1-For和TOP1-Rev；

用于扩增毕赤酵母RPA(基因序列如SEQ ID No.8所示)的引物为RPA-For和RPA-Rev。

用于扩增大肠杆菌ssb(基因序列如SEQ ID No.9所示)的引物为ssb-For和ssb-Rev。

用于扩增罗尔斯通氏菌h16_A0402(基因序列如SEQ ID No.10所示)的引物为h16_A0402-For和h16_A0402-Rev。

(c)制备各菌株相应适用的质粒骨架：

用于酿酒酵母碱基编辑的质粒骨架；以质粒p415为模板，用限制性内切酶Pst1和Sca1双酶切，并通过凝胶电泳分离、纯化骨架片段，即本系统在酿酒酵母中应用的质粒骨架；

扩增用于毕赤酵母碱基编辑的质粒骨架；基于Gu等(Construction of a seriesof episomal plasmids and their application in the development of an efficientCRISPR/Cas9 system in Pichia pastoris，May2019，World Journal of Microbiologyand Biotechnology 35(6)，10.1007/s11274-019-2654-5)研究中构建的含有panARS复制子的黄色荧光表达载体，利用BglII和NotI将AOX1启动子和黄色荧光蛋白基因除去，插入从毕赤酵母基因组上PCR扩增得到的GAP启动子，所用引物为GAP-FOR和GAP-REV，即本系统在毕赤酵母中应用的质粒骨架；

设计引物pGEX-FOR和pGEX-REV，扩增用于大肠杆菌碱基编辑的质粒骨架；以实验室已有质粒pGEX-6P-1为模板，PCR扩增包含ori复制起始位点、氨苄青霉素抗性基因AmpR、半乳糖操纵子等元件的质粒骨架，即本系统在大肠杆菌中应用的质粒骨架；

扩增用于罗尔斯通氏菌碱基编辑的质粒骨架，以实验室已有质粒pBBR1-Para-rfp为模板，用XhoI和BamHI双酶切，并通过凝胶电泳分离、纯化骨架片段，即本系统在罗尔斯通氏菌中应用的质粒骨架；

(d)酶连质粒骨架和APOBEC，利用Gibson技术，同源重组连接上述片段，得到所述基因组碱基编辑表达载体。

纯化后的APOBEC1(步骤a得到)、特异性DNA单链结合蛋白(步骤b得到)和质粒骨架(步骤c得到)按0.03pmol：0.03pmol：0.03pmol的比例加入Gibson Assembly反应体系中，加入Gibson assembly mix 15μL，并加入ddH₂O使得最终反应体系为20μL；50℃温育60min。热击转化E.coli DH5α感受态细胞；均匀涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为基因组碱基编辑表达载体。用于酿酒酵母的表达载体如图2所示，用于毕赤酵母的表达载体如图3所示，用于大肠杆菌的表达载体如图4所示，用于罗尔斯通氏菌的表达载体如图5所示。

2、基因组碱基编辑系统功能验证

基因组碱基编辑过程如下：提取基因组碱基编辑系统表达质粒并转化酿酒酵母，培养、筛选，获得转化子；

a.将基因组碱基编辑系统和对照组的表达质粒从E.coli中提出，分别转化至酿酒酵母BY4741中，将转化后的酿酒酵母在SCD-LEU固体培养基上筛选；

b.每个固体培养基上挑取3个单菌落，分别接种至SCD-LEU液体培养基中培养，待菌液生长至稳定期，进行传代培养；

c.菌液连续培养2代并至菌液生长至稳定期后，每个样品测OD₆₆₀值，并将菌液稀释至每毫升10⁷个细胞，取1mL菌液，其中5μL菌液稀释至每毫升10⁵个细胞，涂布于5μL菌液至SCD-LEU固体培养基上，另外995μL菌液离心后重悬于100μL灭菌水中，涂布于SCD-LEU-ARG+canavanine固体培养基上，接菌后的培养基在30℃的培养箱中培养3-7天；

d.分别统计各个样品在SCD-LEU和SCD-LEU-ARG+canavanine培养基上生长的单菌落数量，计算基因突变率。

e.挑取SCD-LEU-ARG+canavanine培养基上的单菌落，对其CAN1基因进行测序，验证突变类型。

f.该实验重复三次后，进行数据的统计分析。

实验结果如图6所示，该碱基编辑系统显著提高了CAN1基因的突变率，与yAPOBEC相比，其中yRFA1和yHCS1提高了6倍，yRFA2和yTOP1提高了12倍，yRFA3和yPRI1分别提高了21倍和25倍。由此可以证明该系统能显著提高酿酒酵母基因组的突变率。

应用例1：基因组突变菌株对异丁醇的耐受性测试

一类增加基因组突变率的碱基编辑系统，加速酿酒酵母基因组定向进化，提高其对异丁醇的耐受性。

a.取上述2.c(实施例1第2.c节)各样品连续传2代并生长稳定的菌液，接种等量菌液至含有不同浓度异丁醇的SCD-LEU液体培养基中培养，培养基中异丁醇的浓度分别为：0％、1％、2％、3％、4％、5％；

b.每24h测菌液OD₆₆₀值，比较不同菌株在含不同浓度异丁醇的培养基中的生长情况；

实验结果表明，异丁醇在培养基中的浓度为0-2％时，不同菌株的生长速率没有差异，在浓度为3％时，如图7所示，y415的生长速率小于其他菌株；当异丁醇浓度为4％时，如图7所示，各菌株的生长速率产生了差距，其中生长最快的是yRFA2和yTOP1，其次是yRFA3和yPRI1，且两者生长较为稳定，而yRFA1、yHCS1和yAPOBEC生长速率较慢，y415生长受限最大；异丁醇浓度为5％时，如图7所示，菌株yTOP1、yRFA3、yPRI1以及yHCS1生长速率较高，其次是yRFA2，而yAPOBEC和yRFA1生长受限较大，y415完全无法生长。综上所述，菌株yTOP1、yRFA3和yPRI1对异丁醇的耐受性最好，而这三个菌株的突变率在各菌株中相对最高，推测在酿酒酵母中，高突变率有利于进化对异丁醇耐受性。

应用例2：基因组连续进化菌株对异丁醇的耐受性测试

a.根据应用例1的测试结果和推论，选取突变率最高且在含5％异丁醇的培养基中生长速率较高的yRFA3菌液，接种至在含更高浓度异丁醇的培养基中进行传代培养，接种量为1％。

b.连续传代接种至含更高浓度异丁醇的培养基中，直至菌株无法生长，连续进化后，yRFA3菌株耐受异丁醇的最高浓度为9％。

c.保存对异丁醇耐受性最高菌液，即基因组连续进化后的酿酒酵母yRFA3，在固体培养基上分离单菌株，同时在固体培养基上分离上述2.a转化后未经传代培养的yRNA3单菌株，即基因组连续进化前后的酿酒酵母菌株，各挑选3个单菌落接种至含异丁醇的液体培养基中，异丁醇浓度浓度设置为0％、3％、6％、8％、9％，每24h测菌液OD₆₆₀值，比较基因组连续进化前后的酿酒酵母对异丁醇的耐受性和耐受稳定性。同时接种y415和yAPOBEC各3个单菌落作为对照。

实验结果表明，对照组y415和yAPOBEC在更高浓度异丁醇的培养基中无法存活；在异丁醇浓度为8-9％时，如图8所示，未进化的yRFA3菌株无法存活；实验组，即连续进化后的yRFA3’菌株能耐受并快速生长。

应用例3：基因组突变菌株对乙酸盐的耐受性测试

一类增加基因组突变率的碱基编辑系统，加速酿酒酵母基因组定向进化，提高其对乙酸盐的耐受性。

a.取上述2.c(实施例1第2.c节)各样品连续传2代并生长稳定的菌液，接种等量菌液至含有不同浓度乙酸盐的SCD-LEU液体培养基中培养，培养基中乙酸盐的浓度分别为：2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L；

b.每24h测菌液OD₆₆₀值，比较不同菌株在含不同浓度乙酸盐的培养基中的生长情况。

实验结果表明，在低浓度乙酸盐的培养基中，各菌株的生长速率没有明显差别；培养基中的乙酸盐浓度为6-8g/L时，如图9所示，yHCS1、yRFA2、yRFA3、yRFA1的菌液浓度最高，yPRI1、yAPOBEC和yTOP1生长速率较低，而y415的生长开始受到限制；培养基中乙酸盐浓度达到10g/L时，如图9所示，yRFA3、yRFA2、yRyFA1和yHCS1的生长速率最高，yPRI1、yTOP1和yAPOBEC的生长受到抑制，y415完全被抑制；当乙酸盐的浓度达到12g/L时，如图9所示，耐受性最好的是yHCS1、yRFA2和yRFA1，其次是yRFA3，其他菌株的生长受到显著抑制。综上所述，菌株yHCS1、yRFA2和yRFA1对乙酸盐的耐受性最好，而这三个菌株的突变率在各菌株中属于中等水平，推测在酿酒酵母中，中等突变率有利于进化对乙酸盐的耐受性。

应用例4：基因组突变后的菌株对β-胡萝卜素产量的影响

一类增加基因组突变率的碱基编辑系统，加速酿酒酵母基因组定向进化，提高菌株胞内β-胡萝卜素的产量。

a.将基因组碱基编辑系统和对照组的表达质粒从E.coli抽提后，分别转化至基因组中整合了β-胡萝卜素合成基因(CrtE、CrtYB以及CrtI三个外源基因)的酿酒酵母BY4741中，将转化后的菌株分别接种至SCD-LEU液体培养基中培养，待菌液生长至稳定期，进行传代培养。

c.菌液连续培养2代并至菌液生长至稳定期后，将菌液稀释至相同浓度，并涂布至SCD-LEU的固体培养基上，培养基置于30℃的培养箱中，培养48h。

d.在SCD-LEU固体培养基上筛选橙色较深的单菌落，转接菌落至SCD-LEU液体培养基中培养48h。

e.每个样品取1mL菌液，测其OD₆₆₀值，并萃取胞内的β-胡萝卜素。

f.用HPLC测β胡萝卜素标品，并制作标准曲线，流动相为50％乙腈+30％甲醇+20％异丙醇。

g.用HPLC测各样品在450nm的吸收波峰，根据标准曲线计算β-胡萝卜素的产量。

实验结果如图10所示，对照组y415和yRFA1菌株的β-胡萝卜素产量是104.71和108.94mg/L，yRFA2的平均产量是p415的1.63倍，yHCS1的平均产量是y415的1.87倍，yTOP1的平均产量是y415的2.42倍。综上所示，yTOP1、yHCS1和yRFA2显著提高了B-胡萝卜素的产量，推测在酿酒酵母中，基因组中等突变率有利于进化胡萝卜素的合成途径。

实验证明，利用本发明构建的基因组碱基编辑系统，对酿酒酵母的基因组进行改造，具有简单，高效等优点，能够快速、高效用于改造酿酒酵母，使其提高对有机试剂的耐受性，提高目标产物的产量。

应用例5：该碱基编辑系统在不同工业微生物的测试和应用

一类增加基因组随机突变率的碱基编辑系统及应用。本发明构建的基因组碱基编辑系统具有普适性，可用于大部分工业菌株的连续进化，能够显著提高工业菌株的鲁棒性和生产性能。将该碱基编辑系统在毕赤酵母、大肠杆菌以及罗尔斯通氏菌中进行系统构建和功能验证。

a.在不同工业菌株中，一类增加基因组随机突变率的碱基编辑系统的构建，同实施例1。

b.一类增加基因组随机突变率的碱基编辑系统在毕赤酵母中的测试：将转化了基因组突变系统的毕赤酵母(MT)30μL菌液接入3mL的SED培养基中，连续培养2代，每次传代的接种量为1％。将毕赤酵母野生菌(WT)和进化菌株分别接种1％至含7％甲醇的SEM培养基中，每个菌株设置3个重复，30℃培养20h，测试菌液的OD₆₀₀值。

实验结果如图11所示，在甲醇浓度为7％时，毕赤酵母基因组突变菌株的细胞OD₆₀₀值是野生菌株的2.10倍。毕赤酵母野生菌的生长受到抑制，而基因组突变的菌株具有更高的甲醇耐受性。

c.一类增加基因组随机突变率的碱基编辑系统在罗尔斯通氏菌中的测试：将转化了基因组突变系统的罗尔斯通氏菌(MT)30μL菌液接入3mL的MM培养基中，连续培养2代，每次传代的接种量为1％。将野生型菌株(WT)和进化菌株分别接种1％至无机培养基MM中，以5g/L的甲酸钠为唯一碳源，每个菌株设置3个重复，30℃培养48h，测试菌液的OD₆₀₀值。

实验结果如图12所示，在甲酸钠浓度为5g/L时，罗尔斯通氏菌基因组突变菌株的细胞OD₆₀₀值是野生菌株的3.56倍。罗尔斯通氏菌野生菌的生长受到抑制，而基因组突变的菌株具有更高的甲酸钠耐受性。

d.一类增加基因组随机突变率的碱基编辑系统在大肠杆菌中的测试：将转化了基因组突变系统的大肠杆菌(MT)30μL菌液接入3mL的LB培养基中，连续培养2代，每次传代的接种量为1％。将大肠杆菌野生菌(WT)和进化菌株分别接种1％至含0.1％乙酸钠的LB培养基中，每个菌株设置3个重复，37℃培养48h，测试菌液的OD₆₀₀值。

实验结果如图13所示，在乙酸钠浓度为0.1％时，大肠杆菌基因组突变菌株的细胞OD₆₀₀值是野生菌株的2.72倍。大肠杆菌野生菌的生长受到抑制，而基因组突变的菌株具有更高的甲醇耐受性。

实验结果表明该增加基因组随机突变率的碱基编辑系统提高了毕赤酵母、大肠杆菌、罗尔斯通氏菌等菌株对有机试剂的耐受性，验证了该加基因组随机突变率的碱基编辑系统在大部分工业菌株中的适用性。

序列表

<110> 浙江大学杭州国际科创中心

<120> 一种增加基因组突变率的碱基编辑系统及碱基编辑方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<400> 1

atgagctcag agactggccc agtggctgtg gaccccacat tgagacggcg gatcgagccc 60

catgagtttg aggtattctt cgatccgaga gagctccgca aggagacctg cctgctttac 120

gaaattaatt gggggggccg gcactccatt tggcgacata catcacagaa cactaacaag 180

cacgtcgaag tcaacttcat cgagaagttc acgacagaaa gatatttctg tccgaacaca 240

aggtgcagca ttacctggtt tctcagctgg agcccatgcg gcgaatgtag tagggccatc 300

actgaattcc tgtcaaggta tccccacgtc actctgttta tttacatcgc aaggctgtac 360

caccacgctg acccccgcaa tcgacaaggc ctgcgggatt tgatctcttc aggtgtgact 420

atccaaatta tgactgagca ggagtcagga tactgctgga gaaactttgt gaattatagc 480

ccgagtaatg aagcccactg gcctaggtat ccccatctgt gggtacgact gtacgttctt 540

gaactgtact gcatcatact gggcctgcct ccttgtctca acattctgag aaggaagcag 600

ccacagctga cattctttac catcgctctt cagtcttgtc attaccagcg actgccccca 660

cacattctct gggccaccgg gttgaaa 687

<210> 2

<211> 1866

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

atgagcagtg ttcaactttc gaggggcgat tttcatagca tcttcaccaa taagcaaagg 60

tacgataatc ccaccggtgg cgtttatcaa gtttataaca ccaggaaatc tgatggggct 120

aacagcaaca gaaagaattt gatcatgatt tccgatggta tttaccatat gaaggctctg 180

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tttgctacaa aatttaacga aattttacaa gaaggcaaag tatactatgt atcaaaggca 780

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aatttcatca aactagatgc tattcagaac caggaagtaa attccaacgt agacgtcctc 960

ggtattatcc aaactataaa cccacatttt gagctaactt caagggctgg gaagaaattc 1020

gatcgtcgtg acatcacaat tgttgacgac tctgggtttt ctatctctgt tggcctatgg 1080

aatcagcaag cccttgattt caaccttcct gaaggttctg ttgctgccat taaaggtgtt 1140

cgtgtgacgg attttggtgg caaatctttg tctatgggat tttctagtac cctgattccg 1200

aatccagaaa ttcctgaggc atatgcctta aagggttggt atgattccaa gggccgcaac 1260

gcaaacttca tcactttaaa gcaagaaccc ggtatgggtg gtcaatcggc tgctagctta 1320

acaaaattca ttgctcagcg tattactatt gctagagctc aagctgaaaa tctaggaaga 1380

agcgagaaag gtgacttttt tagtgttaaa gctgctataa gtttcttaaa agttgataat 1440

tttgcatatc ctgcctgttc taatgagaat tgtaataaga aagttctgga acagcctgat 1500

ggtacttgga gatgtgagaa gtgcgacacc aataatgcaa ggccaaattg gagatacatc 1560

ttgacaatat caattattga cgaaaccaat caactatggc tcactttatt tgacgaccaa 1620

gctaaacaat tattgggtgt tgatgctaat acattaatgt ctttgaagga agaagacccc 1680

aacgaattca caaaaattac tcaaagtatc caaatgaacg aatatgactt taggattaga 1740

gcgcgtgagg atacatacaa tgatcaaagc agaattagat ataccgttgc taacctacac 1800

agcttgaatt acagggctga agccgactat cttgccgatg agttatccaa ggctttgtta 1860

gcttaa 1866

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

atggcaagta tgtattagtg ctaggaattg gaggatttgc tcttttctgc atcatttttt 60

ttatttttat tggcgaatgt taaaattact aacaatggat gggattccaa tacagcctat 120

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gaacttcatc acgtttgttt tgtaggtgtg gtgagaaaca ttacagacca tactgcaaat 360

atttttttaa ctattgagga tggaactggt caaatagaag tgagaaaatg gagcgaagat 420

gcaaatgact tggctgccgg taacgatgac tcttctggta aaggttatgg ttcgcaagtc 480

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acgcatcact tggaagtcat caaatgtcat tccatagcca gtggaatgat gaaacaacct 660

ttggagagtg catccaacaa caatgggcaa tcattatttg tcaaggatga taacgataca 720

tcttccggct ccagtccgtt acaaagaatt ctagaatttt gtaagaagca atgtgagggc 780

aaagacgcta attcattcgc tgttcccatt ccattgatct cgcaatcctt gaatttggat 840

gaaactaccg tcagaaactg ctgtacgacc ttgactgacc agggttttat ctacccaact 900

tttgatgaca ataacttctt tgccctatga 930

<210> 4

<211> 369

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

atggccagcg aaacaccaag agttgacccc acagaaatct ccaacgtcaa tgctcctgtg 60

tttaggataa tagcgcaaat caaatcacaa cccactgaat ctcagttgat tttacaatcg 120

ccaaccatat catcgaaaaa cggcagcgag gttgaaatga ttacgttgaa caatattcgt 180

gtatctatga ataaaacatt tgagatcgac tcgtggtatg agtttgtttg caggaacaat 240

gatgacggcg agctaggatt tttgattcta gacgctgtac tatgcaaatt caaggagaac 300

gaagatttaa gcttaaacgg tgtggttgct ttacagagac tatgtaagaa atacccagaa 360

atatactag 369

<210> 5

<211> 1230

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 5

atgaccaatt cagtaaagac taatgggcca agctcctcag acatggagta ctactataag 60

tcgctctatc cattcaaaca cattttcaac tggctgaatc attcgcccaa accttctagg 120

gatatgatta acagagaatt cgctatggcg ttcaggtcag gtgcttacaa aaggtataat 180

tcttttaact ctgtgcaaga tttcaaagca caaatagaaa aagccaaccc agacagattt 240

gaaatcggtg ccatatataa caaaccgcca agagaacgtg atactctatt aaaaagcgaa 300

ttgaaagctt tagagaagga gttggtgttt gatattgata tggatgatta cgatgccttc 360

agaacgtgtt gctccggagc ccaagtttgc tctaagtgct ggaaatttat atctttggca 420

atgaaaatta cgaacacggc cctaagagag gattttggtt ataaggactt catctgggta 480

ttttcaggta gacgtggtgc tcattgttgg gtaagcgaca aacgggcacg ggctttgacg 540

gatgtacaac gaagaaacgt tttagattat gtcaacgtga ttagagacag aaatactgac 600

aagcgattgg ctttgaagag gccttatcac cctcatcttg ctcgttcttt ggagcaattg 660

aaacctttct ttgtcagcat tatgctcgaa gagcaaaatc cttgggaaga tgaccaacat 720

gctatccaaa ctttattgcc tgcattatat gataaacaat tgattgattc attaaagaag 780

tattggctgg acaatccaag gaggtcaagc aaagagaagt ggaatgatat agatcagata 840

gctacatcgc tcttcaaagg ccccaagcaa gactctcaca taattaagtt acgtgaatgt 900

aaggaagatc tcgtattgat gactctttat ccgaagctgg atgtggaagt tacaaagcaa 960

acaattcatt tgttaaaggc ccctttttgt attcatcctg ctacggggaa tgtctgtgtg 1020

cctattgatg aatcctttgc acctgaaaaa gcacctaagc taattgatct tcaaacagaa 1080

atggagaaaa ataatgatgt ttcattaaca gctttacaac cttttatcaa tcagttccaa 1140

gcatatgtga gttctctttt gaaaaatgaa ctgggttcag tgaaaagaga acgtgaagat 1200

gatgatgaac cggcttcttt agatttctga 1230

<210> 6

<211> 2052

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 6

atgaacaaag aattggcttc taagttttta tcaagcatca agcatgaacg tgaacaagac 60

attcaaacaa cttctaggct attaacaacg ctatctatcc aacaattggt gcaaaatggc 120

ttggcaataa acaacataca tctagaaaac ataagatccg gtctcattgg caaattatat 180

atggaactgg gacctaactt ggcggttaac gacaaaattc aaaggggtga tattaaggtt 240

ggtgatattg ttttggtacg ccctgcaaaa accaaagtaa ataccaagac taagcccaaa 300

gtcaaaaagg tgtctgaaga ctccaatggc gagcaagcgg aatgctcagg cgttgtctac 360

aaaatgagtg atactcaaat caccatagct ctagaagaat ctcaagatgt tattgctacc 420

acattttatt cttatagcaa actttacatt ttaaagacta ccaatgtcgt cacgtataat 480

agaatggaat ccacaatgag aaaactgtct gaaattagtt cacccataca agacaaaatt 540

atacaatact tggtaaacga acgccccttc atccccaata caaacagctt tcaaaacatt 600

aaatcttttt taaacccgaa tctgaatgac tcccagaaaa ctgccattaa ttttgccatt 660

aacaatgact tgaccattat acatggtcct cctggtacgg gtaaaacatt cacattaatt 720

gaattgatcc agcaattgct aattaaaaat cctgaggaga gaatcttaat ttgtgggcct 780

tccaatattt ctgtggatac gattctggag aggctaacgc ctcttgtgcc gaataattta 840

ttattaagaa tcggtcatcc tgctaggcta ttagactcta ataaaagaca ctctcttgat 900

atacttagta aaaagaatac tattgtgaag gacatttccc aggagattga caaattaatt 960

caggagaata aaaaactaaa aaactataag caacgtaaag aaaactggaa cgaaattaaa 1020

ctgctgcgca aagatttaaa gaaaagagag ttcaaaacca ttaaggactt aataatacaa 1080

tcgagaatag tcgtcaccac tttacacggt tcatcatcga gagaactatg ctccctttat 1140

agagatgatc caaatttcca gcttttcgat accttgatca tcgatgaagt ctcacaggcc 1200

atggaaccac aatgctggat cccactaatt gcacatcaaa atcagttcca caaactagtc 1260

cttgctggtg acaataaaca attgccaccc acaatcaaaa cagaagacga caaaaatgtc 1320

attcacaatt tggaaaccac actatttgac agaataatca aaatattccc gaaaagggat 1380

atggtaaaat ttcttaacgt tcaatacagg atgaatcaaa aaattatgga atttccatcg 1440

cactcaatgt ataatgggaa actattggcc gatgcaacgg tcgcgaacag acttttgata 1500

gacctaccga ccgtcgatgc tacgccatct gaggatgatg acgatacaaa aattccttta 1560

atttggtatg atacgcaagg tgatgaattt caagagactg cagatgaagc tactatcctt 1620

ggatctaagt ataatgaggg cgaaattgcc attgtaaaag aacacattga gaatttaagg 1680

tcattcaacg tcccggagaa ctctataggt gttatttctc catacaatgc acaagtttct 1740

catctgaaaa aattgatcca tgatgaatta aaattaactg atattgaaat atcaactgta 1800

gatgggttcc agggccgtga aaaagatgtt atcatattga gtttagttcg tagcaatgaa 1860

aaatttgaag ttggtttcct taaggaagaa cgaagactga acgtcgccat gacaagaccc 1920

agaaggcaac tagttgttgt tggcaatata gaagttctgc aaaggtgcgg taacaagtac 1980

ctaaaaagtt ggtcagaatg gtgtgaagag aacgctgacg taaggtaccc caacattgac 2040

gattatttgt aa 2052

<210> 7

<211> 2310

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 7

atgactattg ctgatgcttc caaagttaat catgagttgt cttctgatga cgatgacgat 60

gtgccattat ctcaaacttt aaaaaaaaga aaggtggcgt ccatgaactc tgcctctctt 120

caagacgaag cggaacctta tgatagtgat gaggcaatct ctaagatttc caagaaaaag 180

actaagaaaa taaagaccga accagtgcaa tcgtcgtcat taccatcgcc tccagcaaag 240

aaaagcgcga catcaaagcc taaaaaaatc aagaaagaag atggtgatgt aaaggtaaaa 300

acaactaaaa aggaagaaca ggagaacgaa aaaaagaaac gagaagaaga agaagaggag 360

gacaagaaag cgaaggagga ggaggaagaa tataaatggt gggaaaaaga aaacgaagat 420

gacaccataa aatgggtcac actgaagcat aacggtgtta tattccctcc accataccag 480

cccttaccat ctcacatcaa attatattac gatgggaagc cagtagattt acctccgcaa 540

gctgaagaag tagccgggtt ctttgctgcc ctattagaga gtgatcatgc caaaaatcct 600

gttttccaaa agaacttctt caatgatttc ttgcaagtac tgaaagaaag tggtggtccc 660

ctcaatggaa ttgagataaa ggaattttct cgttgcgatt tcaccaaaat gtttgattac 720

ttccagttac aaaaagaaca gaaaaagcaa ctgacttccc aagaaaagaa acagattcgt 780

ttggaaagag aaaaattcga ggaagattat aaattctgtg aattagatgg cagaagggaa 840

caagtaggga atttcaaggt tgaacctcct gatctattta gaggtcgtgg cgctcaccca 900

aaaacaggca aattgaagag aagagtgaat cctgaggata tcgttttaaa tctaagtaaa 960

gacgcacccg ttccgccagc cccagaaggg cacaagtggg gtgaaatcag acacgacaat 1020

accgttcaat ggttagccat gtggagagag aatattttca actcattcaa atacgtcaga 1080

ttggcagcga actcttcatt gaagggtcaa agtgactaca agaagtttga aaaggcgaga 1140

caattgaaat cctatatcga tgccatcaga agggattaca cgagaaattt gaaaagcaaa 1200

gttatgctag agcgccaaaa ggccgtagcc atttatttga tcgatgtatt cgctttaaga 1260

gccggtggtg aaaaatccga agatgaagcc gatactgtgg gttgttgttc attgcgatat 1320

gagcatgtta ctttgaaacc tccgaatact gttatctttg atttcttagg taaggattct 1380

attagatttt atcaagaggt agaagttgac aaacaagttt tcaaaaattt gacaattttt 1440

aaaaggccgc ccaaacagcc aggacatcaa ctgtttgatc gtctagatcc atctatactg 1500

aacaaatatc tacaaaacta catgccggga ttgactgcta aagttttccg tacatataat 1560

gcttccaaaa caatgcaaga tcaactggat ctaattccaa ataaaggatc tgtcgcagag 1620

aaaatattga agtacaacgc agcaaataga actgtagcca tcctatgtaa ccatcaaagg 1680

actgtcacga aggggcatgc acaaacagtg gaaaaggcca ataatagaat acaagagttg 1740

gaatggcaaa agattcgttg caagagggcc attttacaat tggataagga tcttttaaag 1800

aaagagccaa aatatttcga agaaatcgac gatttgacga aagaagatga agccaccatt 1860

cacaagagaa ttattgatag agaaattgaa aaatatcagc gaaaatttgt tagggagaac 1920

gataagagga aatttgaaaa ggaagaatta ttgccggaaa gtcaattgaa ggaatggttg 1980

gagaaagtcg acgaaaagaa acaagaattc gaaaaggaat tgaaaaccgg tgaagtggaa 2040

ctgaaatcaa gttggaattc agtcgaaaaa ataaaagcac aagtagagaa attagaacag 2100

cgtatccaaa ctagttccat tcagttgaaa gataaagagg aaaactccca ggtttcactg 2160

ggcacttcca aaatcaatta tatagaccct agactttctg tggtattttg caaaaagtat 2220

gatgttccga ttgaaaagat ttttacaaaa accctaagag aaaaattcaa atgggccata 2280

gaatcggtag atgaaaattg gaggttttaa 2310

<210> 8

<211> 1866

<212> DNA

<213> 毕赤酵母(Pichia.pastoris)

<400> 8

atgacagagt tcagtaaagg tagtttggtt gaaatcttcc agaagggcta taaaggtgga 60

ctaaaacctt tgacggttca agttttgaat ttgaaggcaa ttcccaacaa tacgggcaaa 120

aggcttcgac tcgccctttg tgatggtttg tataatgcca acgctgttat taggcctgaa 180

tcggtcgaaa aggccgaagc tcaaggaatc aagaagggaa gcattgtcca attgctcgag 240

tacaaagctt caatgataag tcctgtcaaa cacgtcttga tcatcgataa tcttcaagtt 300

ttgggatttc aagaggagaa aatcaaccca tccccaacta gtgtagacca atatttcagc 360

aaccactctg gagaaagcaa cgaagacttg ttgggcacct caatgaattc tccagcgcct 420

caagagcctg cgcagaaagc gcaatcacat caccaagaag atgcaaagcc aaaactgtca 480

gcacaggtta cgtccaaacc ccaacagacc aattcaagta ccgctaaatt tccaaatatc 540

catgcaattg atcaactaaa cccctatcag aataattgga ccattaaggc tcgggtttct 600

tataaatctg atatgagaaa atggtccaac cagaggggtg aaggtcagct cttcaatgtg 660

aatcttttag atgaaactaa tgaaatcaga gcaactgctt tcaacgatgt tgcagataaa 720

tattacgacc tcctacaaga gggcaaggtt tactacatca gcaaagcacg tattcagcca 780

gcaaaacctc aattttccaa ccttacccat acttacgaat tagctttgga tcgggacact 840

cagatcatcg aagcagagga tgcatctgat gtcccttctc ttcattttaa ttttgttaaa 900

ctcaacaagg tacaggatct tgacgcaaat gccattattg acgttattgg tgtcatcaaa 960

gtggtgaatc ctgctttcca aatcgtggcc aagtcaaccg gaagaccatt tgacaggaga 1020

gatattgaag ttgtagataa tactggattt gctataactg tagggttgtg gaataacact 1080

gctcttgagt ttgacattcc tgttggatca gtagttgcgt ttaaaggtgc taaagttcaa 1140

gattttggtg gcagaagtct ttcattgact caatcagcta ccataatcac taatccagac 1200

tctccagagg cttatcagtt gaaagcatgg tatgatcaac aaggtggctc caatcaggag 1260

tttaagtccc tgaaaaacga agtatcttcc aacagtggtt tgaatacgaa acaagacatt 1320

cagtcccgca aaaccatttt gcaagctcag tctgaagaac tcggtaagaa tgacaagccg 1380

gactatttct ccattaaagc ttacatcagt tatattagga cagaaaactt ttcgtatcca 1440

gcttgtgcat ccgagggttg caatagaaaa gtcatccaac agagtgacga tacttggagg 1500

tgtgaaaagt gtgatgtcaa ccaccccaaa ccgaaccatc gttatatatt gacattgtct 1560

gtggtagacc acacaggaca actatgggtc acattatttg acgaccaagc acaacagctc 1620

ttgggacaat cagctggtga attgatcgac ttgaaagaga atgacatgtc tgaaaataac 1680

catgcattcc agcaagtatt caacaggata caaatgaagg agttttcgtt cagagtaaag 1740

gcatctccgg attcttacaa gggtcaaacc cgtattcggt ataatgccgt gtctctggcc 1800

aaactggatt tcgctttgga agcagatgca ttggcagatt attttgaggg tgtcaaggtt 1860

aattaa 1866

<210> 9

<211> 537

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 9

atggccagca gaggcgtaaa caaggttatt ctcgttggta atctgggtca ggacccggaa 60

gtacgctaca tgccaaatgg tggcgcagtt gccaacatta cgctggctac ttccgaatcc 120

tggcgtgata aagcgaccgg cgagatgaaa gaacagactg aatggcaccg cgttgtgctg 180

ttcggcaaac tggcagaagt ggcgagcgaa tatctgcgta aaggttctca ggtttatatc 240

gaaggtcagc tgcgtacccg taaatggacc gatcaatccg gtcaggatcg ctacaccaca 300

gaagtcgtgg tgaacgttgg cggcaccatg cagatgctgg gtggtcgtca gggtggtggc 360

gctccggcag gtggcaatat cggtggtggt cagccgcagg gcggttgggg tcagcctcag 420

cagccgcagg gtggcaatca gttcagcggc ggcgcgcagt ctcgcccgca gcagtccgct 480

ccggcagcgc cgtctaacga gccgccgatg gactttgatg atgacattcc gttctga 537

<210> 10

<211> 537

<212> DNA

<213> 罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)

<400> 10

gcatcggtca acaaagtcat tctcgtcggc aacctcggcg cagacccgga aacccgctac 60

ctgcccagcg gcgacgccgt gaccaatatc cgcctggcga ccaccgatcg ctacaaggac 120

aagcagagcg gcgagatgaa ggaggccacc gaatggcacc gcgtctcgtt cttcggcaag 180

atcgccgaaa tcgccggcca gtacctgcgc aagggatcgt cggtctatat cgaaggccgc 240

atccgcaccc gcaagtggca ggaccagtcg ggccaggaca agtactccac tgaaatcgtt 300

gccgaccaga tgcagatgct gggctcgcgc cagggtggtg gcggcggtgg cggtgacgaa 360

ggcggctacg gtggcggcgc aggcggcggt ggtggctaca gccgcgaagc gtcgggcggc 420

ggctacggcg gtggccgcgg cggccagggc ggcggccaga gcggtggcgc tgcgcgccgg 480

ccgcagcagc ccgcctcgaa tggtttcgag gatatggacg acgatatccc gttctga 537

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgagctcag agactggccc a 21

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatccacca gaagaaccac cagaactttc gg 32

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttttgtaga aatgtcttgg t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atagttgttc aattgattga a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaatactgtt tcctgtgtga a 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gccaccgctg agcaataact a 21

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccatgagcag tgttcaactt tcg 53

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ataaatcata agaaattcgc ctcggtttct cgagttaagc taacaaagcc ttggataac 59

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 19

nnnnnggatc catggcaacc tatcaaccat ataacgaata ttc 43

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 20

nnnnnctcga gtcatagggc aaagaagtta ttgtc 35

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 21

nnnnnggatc catggccagc gaaacaccaa g 31

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 22

nnnnnctcga gctagtatat ttctgggtat ttcttacata g 41

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccatgaccaa ttcagtaaag act 53

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aatcataaat cataagaaat tcgcctcggt ttctcgagtc agaaatctaa agaagccgg 59

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccatgaacaa agaattggct tct 53

<210> 26

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cataaatcat aagaaattcg cctcggtttc tcgagttaca aataatcgtc aatgtt 56

<210> 27

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccatgactat tgctgatgct tcc 53

<210> 28

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cataaatcat aagaaattcg cctcggtttc tcgagttaaa acctccaatt ttcatc 56

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccatggccag cagaggcgta aac 53

<210> 30

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cataaatcat aagaaattcg cctcggtttc tcgagtcaga acggaatgtc atcatc 56

<210> 31

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccatgacaga gttcagtaaa ggt 53

<210> 32

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cataaatcat aagaaattcg cctcggtttc tcgagttaat taaccttgac accctc 56

<210> 33

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccgaaagttc tggtggttct tctggtggat ccgcatcggt caacaaagtc att 53

<210> 34

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cataaatcat aagaaattcg cctcggtttc tcgagtcaga acgggatatc gtcgtc 56