阅读说明：本技术 紫花苜蓿基因MsCYP20-3B及应用 (Alfalfa gene MsCYP20-3B and application thereof ) 是由 马西青 葛玲巧 翁银银 曹晓会 毛培胜 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供紫花苜蓿基因MsCYP20-3B及应用。本发明提供的基因MsCYP20-3B能够有效改良紫花苜蓿开花时间。基因MsCYP20-3B及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。通过对该基因的应用进一步明确了其在调控苜蓿开花时间中的分子机理,对培育苜蓿早熟品种具有重要的指导意义,有利于改良紫花苜蓿的品质。(The invention provides an alfalfa gene MsCYP20-3B and application thereof. The gene MsCYP20-3B provided by the invention can effectively improve the flowering time of alfalfa. The gene MsCYP20-3B and the sequence of the protein coded by the gene MsCYP20-3B are respectively shown as SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2. The molecular mechanism of the gene in regulating and controlling the flowering time of the alfalfa is further determined by applying the gene, and the gene has important guiding significance for cultivating the early-maturing variety of the alfalfa, and is beneficial to improving the quality of the alfalfa.)

紫花苜蓿基因MsCYP20-3B及应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物遗传育种领域，具体地说，涉及紫花苜蓿基因MsCYP20-3B及应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，豆科，与其它豆科牧草相比，其营养价值居各种牧草之首，高产、稳产、易栽培，素有“牧草之王”的美誉。苜蓿早熟对于种子生产、牧草收获和营养品质等具有重要影响。开花时间对苜蓿的成熟和产量有重要影响，开花的早晚会影响它的种植适应性，获得理想开花时间的优异种质资源，是育种家工作的重要目标。

亲环素(cyclophilins，CYPs)属于亲免素家族，存在于所有生物体并广泛分布于各种细胞器以及细胞外的其他场所。具有肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPIase)的活性，催化脯氨酸N端肽键Xaa-Pro顺反异构化，是蛋白质折叠的限速步骤，在细胞生长、成熟、信号传导基因的时空表达、植物的胁迫应答及植物开花时间等方面发挥关键作用。

目前已经在拟南芥中研究了亲环素CYP基因在调控植物开花时间过程中的作用，但是在紫花苜蓿中研究开花时间相关的基因功能比较少，特别是光周期和温度途径的调控基因，开花时间的分子机制还不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供紫花苜蓿基因MsCYP20-3B及应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供紫花苜蓿基因MsCYP20-3B，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

可选地，紫花苜蓿基因MsCYP20-3B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其mRNA序列有756个碱基。MsCYP20-3B可编码具有251个氨基酸的蛋白质。

第二方面，本发明提供含有基因MsCYP20-3B的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供所述基因MsCYP20-3B、或含有基因MsCYP20-3B的生物材料在调控植物生长发育中的应用。在蒺藜苜蓿中过表达基因MsCYP20-3B，提高转基因植株的侧枝数目，同时提高内源脱落酸和茉莉酸的含量，促进植物生长。

第四方面，本发明提供所述基因MsCYP20-3B、或含有基因MsCYP20-3B的生物材料在调控植物光周期和促进植物开花中的应用。

在短日照和低温处理条件下，MsCYP20-3B基因表达下调，在部分低秋眠级别紫花苜蓿中MsCYP20-3B基因表达量显著上调，促进紫花苜蓿早花表型。

第五方面，本发明提供所述基因MsCYP20-3B、或含有基因MsCYP20-3B的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第六方面，本发明提供所述基因MsCYP20-3B、或含有基因MsCYP20-3B的生物材料在植物育种中的应用。

本发明中，所述植物包括双子叶植物和单子叶植物，优选苜蓿属植物，更优选紫花苜蓿、蒺藜苜蓿。

第七方面，本发明提供一种促进植物开花的方法，所述方法包括：

1)使植物包含所述基因MsCYP20-3B；或

2)使植物过表达所述基因MsCYP20-3B。

优选地，所述植物为紫花苜蓿、蒺藜苜蓿。

所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

进一步地，过表达基因MsCYP20-3B的方法选自以下1)～4)，或任选的组合：

1)通过向植物中导入具有所述基因MsCYP20-3B的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因MsCYP20-3B的拷贝数；

3)通过将强启动子与所述基因MsCYP20-3B可操作地连接；

4)通过导入增强子。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种能够有效改良紫花苜蓿开花时间的基因MsCYP20-3B，通过对该基因的应用以明确其在调控苜蓿开花时间中的分子机理，对培育苜蓿早熟品种具有重要的指导意义。

提取紫花苜蓿苜蓿不同组织部位根、茎、叶、花蕾、花和果荚总RNA，反转录为cDNA，进行MsCYP基因家族荧光定量PCR分析，实验结果如图1所示，MsCYP20-3B基因在30个CYP基因家族中，表达量最高，且主要在茎、叶片、花蕾、花和果荚中表达，说明MsCYP20-3B调控苜蓿开花表型。

成花素基因FTa1(FLOWERING LOCUS T a1)(GenBank：XM_003624521.2)是调控植物开花的关键调控因子，我们进一步检测MtCYP20-3B基因在蒺藜苜蓿fta1突变体中表达情况。实验结果表明，MtCYP20-3B基因表达在蒺藜苜蓿fta1突变体中显著下调，Fta1基因缺失影响了MtCYP20-3B基因表达(图2)。

进一步用紫花苜蓿中牧1号材料进一步分析了MsCYP20-3B基因在不同光周期、温度和赤霉素处理条件下表达情况(图3)，实验结果表明，短日照和低温处理显著影响了MsCYP20-3B表达。在不同秋眠级别苜蓿中，MsCYP20-3B表达也受到调控，在部分低秋眠级别苜蓿中表达量显著上调(图4)，以上实验结果说明MsCYP20-3B参与调控苜蓿开花时间。

本发明还对蒺藜苜蓿mtcyp20-3b突变体进行了表型分析，与对照相比，突变体植株矮小，开花时间延迟(图5)，进一步说明CYP20-3B基因调控苜蓿开花时间。为今后深入研究MsCYP20-3B功能和获得早花紫花苜蓿材料奠定基础。

本发明通过转基因技术获得了在蒺藜苜蓿中含有MsCYP20-3B基因的过表达株系，实验结果表明，转基因材料侧枝数目显著增多，同时内源脱落酸和茉莉酸含量也增加，呈现早花表型(图6)。

附图说明

图1为本发明紫花苜蓿CYP基因家族表达谱。

图2为本发明MsCYP0-3B基因在fta1突变体中表达情况。其中，R108：蒺藜苜蓿野生型，作为对照；fta1：成花素基因突变体。*表示显著性差异，P＜0.05。

图3为本发明不同处理条件下MsCYP20-3B基因表达情况。其中，长日照是指于光照培养箱内，16h光照/8h黑暗进行培养，短日照是指于光照培养箱内，8h光照/16h黑暗进行培养，低温是指于光照培养箱内，16h光照/8h黑暗，4℃培养24h，赤霉素是指于光照培养箱内，16h光照/8h黑暗进行培养，生长至第7天的幼苗用100μM赤霉素喷施。

图4为本发明不同秋眠级别苜蓿中MsCYP20-3B基因表达情况。*表示显著性差异，P＜0.05。

图5为本发明mtcyp20-3b突变体晚花表型。R108：野生型对照，mtcyp20-3b、fta1为突变体。

图6为本发明MsCYP0-3B转基因蒺藜苜蓿表型。其中，A：MsCYP0-3B转基因蒺藜苜蓿；B：野生型株系(R108)侧枝表型；C：转基因株系侧枝表型；D：转基因株系MsCYP0-3B基因表达量分析；E：转基因株系内源激素含量测定。OEMsCYP20-3B-1，OEMsCYP20-3B-2，OEMsCYP20-3B-4分别表示MsCYP20-3B过表达转基因株系编号。*表示显著性差异，P＜0.05。

图7为pCAMBIA1300 super-flag载体结构图。

具体实施方式

本发明提供一种紫花苜蓿MsCYP20-3B基因的克隆及表达载体构建方法，通过遗传转化获得MsCYP20-3B苜蓿早花转基因株系，进一步研究紫花苜蓿MsCYP20-3B基因的功能。通过对该基因的应用，有利于改良紫花苜蓿的品质。

提取紫花苜蓿总RNA，并反转录成cDNA。设计特异性引物，PCR扩增获得全长为756bp的基因，将PCR产物进行切胶回收，回收产物与pEASy-Blunt Zero克隆载体进行连接，转化结束后提取质粒将提取的质粒进行PCR和酶切验证，经过PCR切验证获得了大约756bp的目的条带，送至公司测序用限制性内切酶HindIII和SalⅠ双酶切质粒，将目的基因和pCAMBIA1300 super-flag载体(北京华越洋生物科技有限公司，VECT0510，图7)分别酶切进行回收、纯化后，将目的基因连接到植物表达载体上，转化结束后提取质粒将提取的质粒进行PCR和酶切验证，经过质粒验证获得了大约756bp的DNA条带，经过酶切验证获得了10kb的pCAMBIA1300 super-flag载体，表明载体构建成功。利用重组载体对蒺藜苜蓿叶片进行浸染，为后续基因载体转化蒺藜苜蓿，获得早熟转基因植株奠定了基础。

具体方案如下：

1、以紫花苜蓿叶为材料，提取总RNA，反转录成cDNA，设计引物进行PCR，上游引物带有HindIII酶切位点，下游引物带有SalⅠ酶切位点：

上游引物：5’-AAGCTTATGGCATCTTTGTTCTCAACACAG-3’

下游引物：5’-GTCGACCACCATCTAGAGGAAGTTCTCCAG-3’

2、PCR扩增目的片段，将PCR产物进行切胶回收，回收产物进行电泳检测后与pEASy-Blunt Zero克隆载体进行连接，然后转化大肠杆菌，挑单克隆、摇菌并提取质粒，将提取的质粒进行PCR和酶切验证，经过质粒验证获得了大约756bp的DNA条带，经过酶切验证分别获得了3956bp和大约756bp的目的条带，送至公司测序证明其序列也没有错误且酶切位点与设计相符。初步证明已经成功克隆出紫花苜蓿MsCYP20-3B基因。

3、用限制性内切酶HindIII和SalⅠ双酶切质粒，将目的基因和pCAMBIA1300super-flag载体分别酶切进行回收、纯化后将目的基因连接到植物表达载体上，转化大肠杆菌挑单克隆、摇菌并提取质粒，将提取的质粒进行PCR和酶切验证，经过质粒验证获得了大约756bp的DNA条带，经过酶切验证分别获得了10kb的pCAMBIA1300 super-flag载体和大约756bp的目的条带，送至公司测序证明其序列中酶切位点无误，说明载体构建成功。

Flag标签蛋白编码8个氨基酸的亲水性多肽。Flag标签蛋白通常不会与目的蛋白相互作用，不会影响目的蛋白的功能、性质，可对融合蛋白进行下游研究。其融合表达目的蛋白后可直接通过flag进行亲和层析，可纯化有活性的融合蛋白，且纯化效率高。可被抗flag的抗体识别，方便通过Western Blot等方法对其进行检测、鉴定。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1紫花苜蓿MsCYP20-3B基因的克隆

1.1实验材料:紫花苜蓿，大肠杆菌感受态菌株DH5α；EHA105农杆菌菌株；克隆载体pEASy-Blunt Zero和植物表达载体pCAMBIA1300 super-flag，植物总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒，限制性内切酶HindIII酶、SalⅠ酶、T₄DNA连接酶、质粒提取试剂盒，凝胶回收试剂盒等。

1.2实验方法：

1.2.1紫花苜蓿总RNA提取(RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒，离心柱型)操作步骤如下：

(1)50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450ul RL(使用前先加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。

(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm(约13400×g)离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225ul)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12，000rpm(约13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(4)向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12，000rpm(约13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(5)DNase I工作液的配制：取10ul DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70ul RDD溶液，轻柔混匀。

(6)向吸附柱CR3中央加入80ul的DNase I工作液，室温放置15min。

(7)向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12000rpm(约13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入500ul漂洗液RW(使用前先加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm(约13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)重复步骤(8)。

(10)12000rpm(约13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100ul RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm(约13400×g)离心2min，得到RNA溶液。

RNA样品在-80℃中保存。

1.2.2 cDNA的合成

①基因组DNA的去除：

取1ug的总RNA加入5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl、gDNA Eraser 1.0μl，用RNaseFree ddH₂O补充至10μl，42℃温育2min(或室温5min)，放置冰上。

②反转录反应：

反应液配制在冰上进行。

取1ug总RNA加入4.0ul的5×PrimeScript Buffer 2(用于Real Time PCR)、1.0μl的PrimeScript RT Enzyme Mix I、1.0μl的RT Primer Mix、10.0μl的①的反应液，最后用RNase Free ddH₂O补充至20μl，37℃温育15min，85℃温育5sec轻轻混匀并短暂离心，将离心管放于冰上终止反应，-20℃保存。

1.2.3 MsCYP20-3B基因的克隆

设计引物进行PCR，上游引物带有HindIII酶切位点，下游引物带有SalⅠ酶切位点：

上游引物：5’-AAGCTTATGGCATCTTTGTTCTCAACACAG-3’

下游引物：5’-GTCGAC CACCATCTAGAGGAAGTTCTCCAG-3’

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，50ul扩增体系：2×Fly Super Mix25ul；正、反引物各1ul；cDNA 1ul；ddH₂O 21ul。扩增程序：94℃预变性3分钟后，采用94℃20秒，55℃20秒，72℃1分钟的反应条件进行35个循环扩增，并于72℃延伸10分钟后置于4℃冰箱中备用。回收PCR产物进行电泳检测，连接pEASy-Blunt Zero载体并转化Trans1-T1大肠杆菌，提质粒，经质粒PCR和酶切验证后送至北京天一辉远生物科技有限公司测序。

普通琼脂糖凝胶DNA回收，操作步骤如下：

1、柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12，000rpm(约13，400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

3、向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。

4、将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12，000rpm(约13，400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

5、向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(约13，400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

6、重复操作步骤5。

7、将吸附柱CA2放回收集管中，12，000rpm(约13，400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

8、将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12，000rpm(约13，400×g)离心2min收集DNA溶液。

基因克隆操作：

克隆反应体系：

PCR扩增产物 0.5-4ul

pEASy-Blunt Zero Cloning Vector 1ul

轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。

大肠杆菌转化：

(1)加连接产物于50ul Trans1-TI感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。

(2)42℃水浴热激30秒，立即置于冰上2分钟。

(3)加250ul平衡至室温的SOC或LB培养基，200rpm、37℃培养1小时。

(4)取200ul菌液涂板，培养过夜(为得到较多克隆，1，500×g离心l分钟，弃掉部分上清，保留I00-150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)。

质粒提取：

操作步骤如下：

1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12，000rpm(约13，400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

2、取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12，000rpm(约13，400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4、向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充***解。

5、向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12，000rpm(约13，400×g)离心10min。

6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12，000rpm(约13，400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7、可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12，000rpm(约13，400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8、向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(约13，400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9、重复操作步骤8。

10、将吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm(约13，400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

11、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12，000rpm(约13，400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

该基因全长为756bp，见SEQ ID NO:1，该基因编码的蛋白的氨基酸序列，见SEQ IDNO:2。将该基因命名为MsCYP20-3B。

实施例2植物表达载体的构建

利用下述正向引物和反向引物，以克隆在pEASy-Blunt Zero载体上的pEASy-MsCYP20-3B质粒为模板，扩增出特异的产物，设计引物(正向引物：ACTGGCCGTCGTTTTAC；反向引物：CAGGAAACAGCTATGAC)采用高保真酶扩增，扩增反应的条件为94℃3min，(94℃20s，55℃20s，72℃1min)共35个循环，72℃10min，4℃保存。将产物纯化回收后，用HindIII和SalⅠ双酶切，100ul酶切体系中质粒30ul，HindIII和SalⅠ各1ul，CutSmart Buffer 10ul，ddH₂O58ul，37℃反应3h，电泳回收目的条带(北京全式金生物技术有限公司，

Zero Cloning Kit)。将紫花苜蓿MsCYP20-3B基因用T4 DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA1300 super-flag上，16℃过夜连接，转化大肠杆菌宿主Trans1-T1中，并通过PCR鉴定挑选出转化阳性的克隆，进一步通过测序鉴定，测序引物采用载体自身引物SUPER-flagF：ACACGCCAAGCCTCGCTAGT和SUPER-flag R：CATGCTTAACGTAATTCAACAG。经测序鉴定***片段无误后，转化农杆菌EHA105感受态细胞。筛选阳性克隆，提质粒进行限制性酶切验证后，证明成功转化入农杆菌中。该表达载体可直接用于蒺藜苜蓿、紫花苜蓿、拟南芥、烟草等植物的转化。

农杆菌EHA 105转化：

转化方法：

1、取-80℃保存的农杆的感受态细胞于冰水溶中融化。

2、无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100uL感受态细胞加1ug(体积不大于10uL)质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置5分钟。

3、将离心管置于液氮中速冻5分钟。

4、迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。

5、加入800uL无抗生素的2×YT或LB液体培养基，28-30℃振荡培养2-3小时。使菌体复苏，表达抗性。

6、5000rpm离心1分钟收菌，保留100uL左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72小时。

实施例3 MsCYP20-3B基因的遗传转化

1、采用农杆菌转化法对蒺藜苜蓿组培苗进行MsCYP20-3B基因的遗传转化，具体操作步骤如下：

(1)种子消毒

在超净台中，75％酒精震荡漂洗60s，50％浓硫酸浸泡5～10min，无菌水冲洗3～5次，5％次氯酸钠震荡消毒40～50min，无菌水冲洗3～5次。

(2)无菌苗培养

将消毒后的种子接种于1/2MS固体培养基上，每皿20粒，培养室暗处放置1～2d待种子萌发后，置于光下培养。

(3)菌液制备

将100ul土壤农杆菌菌液用添加利福平25mg/L，卡那霉素100mg/L的YEP液体培养基稀释至20ml，28℃、220rpm摇床上震荡，待菌液OD₆₀₀值达到0.8-1.0。菌液3000rpm离心10min，收集的菌液重悬，重悬液加入AS 150ul/L，OD₆₀₀达到0.5-0.6，28℃，80rpm摇床上缓震2h备用。

(4)外植体的准备：用无菌剪刀取培养4-6周的无菌苗完整、成熟叶片，用灭菌手术刀将叶片切割出伤口。

(5)侵染和共培养

将外植体叶切成小块放入50ml离心管中，向其中加入约10ml冰冷的3％蔗糖溶液(含300μM Gln、1μM EGTA和1mM CaCl₂)，冰浴20min，倒掉蔗糖溶液。再向其中倒入约20ml菌液(含300μM Gln、1μM EGTA、1mM CaCl₂和150μM AS)，真空泵中抽气至0.08MPa，约10min。28℃，80rmp侵染20min。倒去菌液，将侵染后的外植体转移到无菌滤纸上，稍微干燥。再将侵染后的外植体接种于共培养基上，暗培养2～3d至菌斑初现。

其中，Gln、EGTA、AS分别为谷氨酰胺、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸和乙酰丁香酮。

(6)筛选培养

将共培养后的外植体接种于选择培养基(潮霉素5mg/L)上，培养两周。潮霉素提高到10mg/L，培养两周。再将愈伤组织置于光周期为16h光照/8h黑暗下继续生长10天。成功诱导出愈伤组织。将绿色、粘性的愈伤组织接种于分化培养基上，两周继代一次。

(7)体细胞胚萌发、生根

将胚状体接种于生根培养基上生根培养，获得转基因植株。

(8)培养基成分

①YEP培养基：10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，固体加15g/L琼脂(pH7)。细菌培养时添加利福平50mg/L，卡那霉素100mg/L。

②共培养基：改良N6培养基，3.0mg/L 2,4-D，0.05mg/L KT，0.6g/L MES，150μM AS(pH5.4)。

③选择培养基：改良N6培养基，2.0mg/L 2,4-D，0.05mg/L KT，0.6g/L

MES，200mg/L特美汀，5mg/L或10mg/L潮霉素(pH5.8)。

④分化培养基：改良N6培养基，0.4mg/L KT，0.6g/L MES，200mg/L特美汀，5mg/L潮霉素(pH5.8)。

⑤生根培养基：MS培养基(15g/L蔗糖)，100mg/L肌醇，100mg/L特美汀，1mg/L潮霉素(pH5.8)。

其中，2,4-D、KT、MES分别为2，4二氯苯氧乙酸，激动素和2-(N-***啉)乙磺酸。

本发明提供紫花苜蓿基因的克隆方法及表达载体，为后续MsCYP20-3B基因载体转化蒺藜苜蓿，获得转基因植株奠定了基础，对于新品种培育、生产推广具有重要作用。

实施例4在蒺藜苜蓿中过表达MsCYP20-3B基因

根据实施例3，在蒺藜苜蓿中获得了11株MsCYP20-3B基因过表达材料，其中，OEMsCYP20-3B-1、OEMsCYP20-3B-2、OEMsCYP20-3B-4，与对照R108相比，转基因株系分枝数显著增多(平均比对照多12.33个侧枝)，开花时间平均提前5天。同时，测定内源激素含量表明，脱落酸ABA和茉莉酸JA含量与对照相比，分别提高1.57倍和2.23倍，可能促进了蒺藜苜蓿侧枝的增多。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 紫花苜蓿基因MsCYP20-3B及应用

<130> KHP191115741.0

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)

<400> 1

atggcatctt tgttctcaac acagttggtg cagagtcaga accttctttc tggtttcaat 60

gctgtccagg ggaagtcaca tgcagtctgt agcagtacca gagcacacct tggatgcagt 120

aaattgtcat caggatatca ttacgcggct aggctttcgg tgtcacaaca atctaaagcg 180

aaatcaatca cttctcggag aataacatgt actagtagtg ctagtgctgc agatctgcaa 240

gccaaagtaa caagcaaggt tttctttgat gtagttattg gaggtgaatc tgctggaagg 300

attgttattg gcctatttgg agatgttgtt cccaaaacag ttgagaattt ccgagctttg 360

tgcacaggag agaaaggata tggttacaaa gattccacct tccatcgcat aatcaaagat 420

ttcatgattc agggagggga cttcacagaa ggaaatggaa ctggtggagt cagtatctat 480

ggtggtaaat ttgaagatga gaattttact ttgaagcatg ttggtcctgg agttttgagc 540

atggcaaatg ccggtcctaa tagtaacggc agtcaatttt ttatttgcac tgtaccgact 600

tcatggttgg acaatcgcca tgttgtattt ggacatgtca ttgatggaat ggatgttgtg 660

aggacacttg aatcacagga gacaagcagc tacaacaatg gtcccttgaa aacatgcaaa 720

attgttaact ctggagaact tcctctagat ggttga 756

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Phe Ser Thr Gln Leu Val Gln Ser Gln Asn Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gly Phe Asn Ala Val Gln Gly Lys Ser His Ala Val Cys Ser Ser

20 25 30

Thr Arg Ala His Leu Gly Cys Ser Lys Leu Ser Ser Gly Tyr His Tyr

35 40 45

Ala Ala Arg Leu Ser Val Ser Gln Gln Ser Lys Ala Lys Ser Ile Thr

50 55 60

Ser Arg Arg Ile Thr Cys Thr Ser Ser Ala Ser Ala Ala Asp Leu Gln

65 70 75 80

Ala Lys Val Thr Ser Lys Val Phe Phe Asp Val Val Ile Gly Gly Glu

85 90 95

Ser Ala Gly Arg Ile Val Ile Gly Leu Phe Gly Asp Val Val Pro Lys

100 105 110

Thr Val Glu Asn Phe Arg Ala Leu Cys Thr Gly Glu Lys Gly Tyr Gly

115 120 125

Tyr Lys Asp Ser Thr Phe His Arg Ile Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln

130 135 140

Gly Gly Asp Phe Thr Glu Gly Asn Gly Thr Gly Gly Val Ser Ile Tyr

145 150 155 160

Gly Gly Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Thr Leu Lys His Val Gly Pro

165 170 175

Gly Val Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Ser Asn Gly Ser Gln

180 185 190

Phe Phe Ile Cys Thr Val Pro Thr Ser Trp Leu Asp Asn Arg His Val

195 200 205

Val Phe Gly His Val Ile Asp Gly Met Asp Val Val Arg Thr Leu Glu

210 215 220

Ser Gln Glu Thr Ser Ser Tyr Asn Asn Gly Pro Leu Lys Thr Cys Lys

225 230 235 240

Ile Val Asn Ser Gly Glu Leu Pro Leu Asp Gly

245 250