一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法
阅读说明：本技术 一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法 (In-vitro cell test evaluation method suitable for evaluating ultraviolet protection effect of sunscreen cosmetic ) 是由 李学洋 杨雪 杨磊 李晶 李方方 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法,包括⑴防晒化妆品样品处理；⑵细胞培养,细胞接种；⑶UVA照射测定；⑷酶标仪定量检测ROS。本方法利用长波紫外线辐射所引起的细胞氧化损伤为理论基础,以体外培养的细胞为材料,建立了一种有别于传统防晒化妆品评价方法的体外生物学评价体系。并在试验中创新应用的一种体外生物学检测装置,设计科学合理,具有操作快速简单,费用低廉,节约时间、避免操作污染、数据重复性相对较好等诸多优点,使用安全、检测准确,有效的对防晒化妆品的功效进行了科学、合理和正确的评价,为防晒类化妆品人体安全性及功效性评价提供技术保障。(The invention relates to an in vitro cell test evaluation method suitable for evaluating an ultraviolet protection effect of a sun-proof cosmetic, which comprises the steps of treating a sun-proof cosmetic sample; secondly, cell culture and cell inoculation are carried out; performing UVA irradiation determination; and fourthly, quantitatively detecting the ROS by an ELIASA. The method establishes an in vitro biological evaluation system different from the traditional sunscreen cosmetic evaluation method by taking the oxidative damage of cells caused by long-wave ultraviolet radiation as a theoretical basis and taking in vitro cultured cells as materials. The in vitro biological detection device innovatively applied in the test has the advantages of being scientific and reasonable in design, rapid and simple in operation, low in cost, time-saving, capable of avoiding operation pollution, relatively good in data repeatability and the like, safe to use, accurate in detection, capable of effectively and scientifically, reasonably and correctly evaluating the efficacy of the sunscreen cosmetics, and providing technical support for evaluation of the human safety and efficacy of the sunscreen cosmetics.)
技术领域
本发明属于化妆品检测领域，涉及防晒化妆品紫外线防护作用检测技术，尤其是一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法。
背景技术
紫外辐射对人体皮肤产生皮肤灼伤、皮肤老化，甚至导致皮肤癌等有害作用。而生活中紫外线可分为三个频带，包括短波紫外线(UVC)，中波紫外线(UVB)和长波紫外线(UVA)，在其中长波紫外线UVA的波长最长，其穿透力最强，可直接穿透皮肤从而直达皮肤真皮层，因此也是导致皮肤光老化的重要原因之一。有报道紫外线UVA照射可导致细胞中活性氧ROS大量增加，并随着皮肤长时间暴露紫外中，ROS的量随之剧增，导致直接攻击细胞膜使其受体磷酸化从而导致细胞氧化损伤，同时可通过刺激调节细胞信号控制弹性蛋白，基质金属蛋白酶等基因表达，加速胶原蛋白分解，加速皮肤损伤。
作为抵御紫外线的重要手段，防晒化妆品被广泛应用。目前对防晒化妆品的防晒能力检测主要依靠仪器法紫外光谱法和SPF仪法，防晒系数值(SPF和PFA值)来表示。随着近年来化妆品市场的不断飞速发展和体外细胞培养技术的逐渐成熟，急需建立利用细胞培养技术在防晒化妆品功效评价中的应用。
另外，目前对于防晒化妆品防晒效果的评价,国际上一般采用人体法和仪器法紫外光谱法和仪法。人体法是在人体皮肤上直接涂抹防晒化妆品,其观察终点红斑和晒黑虽能体现人体皮肤的生理学反应,但存在成本高、因受试者的个体差异很大而数据重复的高度不确定性等缺点,最重要的是受试者有人体健康风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法，以长波紫外线辐射UVA所引起的细胞氧化损伤为理论基础,利用体外培养的细胞为材料，通过对UVA照射细胞后引起氧化损伤的生物指标ROS为检测指标，建立一种新型应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测方法，同时提供一种应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测装置，为体外细胞试验提供高效可靠的试验装置。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种适合评估防晒化妆品紫外线防护作用的体外细胞试验评价方法，包括以下步骤：
⑴防晒化妆品样品处理
称待测防晒样品，无水乙醇混匀，取混合液与PBS液混匀配制成4mg/ml溶液，用PBS液稀释成不同浓度；
⑵细胞培养，细胞接种
①液氮中取出冻存管进行融化，离心，弃上清，培养瓶中进行培养，然后24小时后换液并观察细胞的生长状况，间隔换液，当细胞密度达到1×106cell/ml时方可进行传代；
②冻存液冻存管中冻存，取对数生长期细胞进行铺板，需要平行铺两块24孔板，UVA照射板和避光处理的非照射板做对照；
③取对数生长期的细胞，0.25％的胰酶以及0.02％的EDTA消化液进行消化，形成单细胞悬液，利用DMEM完全培养基调节细胞浓度至4×105cell/ml并接种于培养皿，置培养箱中培养；
⑶UVA照射测定
接种细胞培养24小时，PBS洗液洗两次，每孔细胞加PBS液0.5mL，3.0mW/cm2的光强度照射细胞44分钟；
⑷酶标仪定量检测ROS
使用荧光酶标仪进行定量检测：将24孔板放进荧光酶标仪，激发波长490nm，散发波长530nm，当相对荧光单位(RFU)增高时则表示ROS含量高；
⑸统计学方法进行数据统计。
而且，步骤⑴中用PBS液稀释成不同浓度，分别为100ug/ml，150ug/ml，300ug/ml。
而且，步骤⑵中间隔2天换液一次，培养箱中培养条件为37℃，5％CO2。
而且，步骤⑶中UVA照射机械功为8J/cm2。
一种新型应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测装置，该装置包括可调节转向支架、可调节UVA照射机构及可拆卸移动无菌操作台，所述的可调节UVA照射机构及可拆卸移动无菌操作台分别设置在所述可调节转向支架的两侧。
而且，所述的可调节转向支架包括底板、支撑杆，所述的支撑杆设置在底板上，在所述支撑杆上同轴套装有若干单元转套，在单元转套上依次设置有冻存管放置架、培养瓶放置架及可调节24孔板支架。
而且，所述的24孔板支架包括伸缩杆，该伸缩杆一端设置在对应的单元转套上，另一端安装可调节支架，在可调节支架上开始有槽道，在该槽道内设置有用于限位放置24孔板的滑动限位柱。
而且，所述的可调节UVA照射机构通过第一插板件拼接插装在可调节转向支架的一侧，在第一插板架上设置有电控箱，在该电控箱上设置有螺纹伸缩杆，在该螺纹伸缩杆的上部设置有可调节伸缩UVA照射灯。
而且，所述的可拆卸移动无菌操作台通过第二插板件拼接插装在可调节转向支架的另一侧。
而且，所述的可拆卸移动无菌操作台本体为无菌操作有机玻璃罩。
本发明的优点和积极效果是：
本发明评价方法利用长波紫外线辐射所引起的细胞氧化损伤为理论基础,以体外培养的细胞为材料，建立了一种有别于传统防晒化妆品评价方法的体外生物学评价体系。试验中我们发现，经UVA照射后，细胞中ROS生成量显著增加，结果证实了UVA照射可引起细胞的氧化损伤，从而引起人体肌肤衰老。而三种防晒化妆品显著抑制了ROS的增加且具有统计学意义，以上结果提示我们，ROS作为UVA对细胞损伤的指标之一，反应敏感，可作为生物标志用于定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用。
本发明在试验中创新应用的一种新型应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测装置，设计科学合理、操作快捷简便，通过将可调节转向支架、可调节UVA照射机构及可拆卸移动无菌操作台有机结合，将无菌操作、UVA高效结合并运用，并可调节的使用冻存管放置架、培养瓶放置架及可调节24孔板支架，具有操作快速简单,费用低廉,节约时间、避免操作污染、数据重复性相对较好等诸多优点，使用安全、检测准确，有效的对防晒化妆品的功效进行了科学、合理和正确的评价。
综上所述,本发明的应用一种新型应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测装置实现的体外细胞法用于定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用具有操作简便、快速、经济、周期短等优点，为防晒类化妆品人体安全性及功效性评价提供技术保障。
附图说明
图1为本发明试验三种浓度防晒样品在8J/cm2的UVA照射前后ROS浓度变化结果图；
图2为本发明中一种应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测装置结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
1材料与方法
1.1材料与试剂
人表皮角质形成细胞株Hacat细胞(Procell，货号CM-H113)；DMEM培养基(美国Thermo公司)；胰酶(美国GIBCO)-乙二胺四乙酸(EDTA)(美国sigma公司)；PBS缓冲液(美国sigma公司)；三种防晒化妆品来自天津海关工业品中心检测样品。
CO2细胞培养箱(日本三洋公司MCO-15AC)；
荧光倒置相差显微镜(奥林巴斯CKX41-F32FL/PH型)
-80℃超低温冰箱(日本三洋MDF-U4086S型)；
酶标仪(美国Thermo公司mk3型)；
皮肤光毒实验装置(天津合普8130B型)；
荧光定量PCR仪(美国ABI 7300)；
超速冷冻离心机(美国sigma型号sigma3K15)
24孔板(美国康宁)
1.2防晒化妆品样品处理
称待测防晒样品32mg，无水乙醇320ul混匀，取0.160ml与PBS液混匀配制成4mg/ml溶液，用PBS液稀释成不同弄浓度100ug/ml，150ug/ml，300ug/ml，三种防晒样品分为A组，B组，C组，并设空白组PBS液作对照。
1.3细胞培养，细胞接种
液氮中取出冻存管进行融化，离心，弃上清，培养瓶中进行培养，然后24小时后换液并观察细胞的生长状况，间隔2天换液一次。当细胞密度达到1×106cell/ml时方可进行传代。冻存液冻存管中冻存。取对数生长期细胞进行铺板，需要平行铺两块24孔板，(UVA照射板和避光处理的非照射板做对照)。
取对数生长期的细胞，0.25％的胰酶以及0.02％的EDTA消化液进行消化，形成单细胞悬液，利用DMEM完全培养基调节细胞浓度至4×105cell/ml并接种于培养皿，置培养箱中培养(37℃，5％CO2)
1.4UVA照射测定
接种细胞培养24小时，PBS洗液洗两次，每孔细胞加PBS液0.5mL，3.0mW/cm2的光强度照射细胞44分钟(8J/cm2)。
1.5酶标仪定量检测ROS
使用荧光酶标仪进行定量检测：将24孔板放进荧光酶标仪，激发波长490nm，散发波长530nm，当相对荧光单位(RFU)增高时则表示ROS含量高。
1.6统计学方法
数据以表示，釆用student t检验方法，P>0.05表示无统计学意义；P<0.05表示显著性差异，有统计学意义，P<0.01表示有极显著性差异，有统计学意义。
一种新型应用于防晒化妆品检测评价的体外生物学检测装置，如图2所示，包括可调节转向支架、可调节UVA照射机构及可拆卸移动无菌操作台，所述的可调节UVA照射机构及可拆卸移动无菌操作台分别设置在所述可调节转向支架的两侧。
所述的可调节转向支架包括底板9、支撑杆5，所述的支撑杆设置在底板上，在所述支撑杆上同轴套装有若干单元转套4，在单元转套上依次设置有冻存管放置架3、培养瓶放置架7及可调节24孔板支架。
所述的24孔板支架包括伸缩杆10，该伸缩杆一端设置在对应的单元转套上，另一端安装可调节支架，在可调节支架上开始有槽道11，在该槽道内设置有滑动限位柱12，用于限位放置24孔板。
所述的可调节UVA照射机构通过第一插板件14拼接插装在可调节转向支架的一侧，在第一插板架上设置有电控箱13，在该电控箱上设置有螺纹伸缩杆1，在该螺纹伸缩杆的上部设置有可调节伸缩UVA照射灯2。
所述的可拆卸移动无菌操作台通过第二插板件8拼接插装在可调节转向支架的另一侧，其本体为无菌操作有机玻璃罩6。
使用时，可拆卸移动无菌操作台通过第二插板件拼接插装在可调节转向支架的一侧，形成无菌操作空间，调节单元转套转动至无菌操作空间内，进行操作，操作完成后撤掉可拆卸移动无菌操作台，拼接可调节UVA照射机构通过第一插板件拼接插装在可调节转向支架的一另侧，同时调节单元转套转动至UVA照射灯下，并根据实际需要调节螺纹伸缩杆和可调节伸缩UVA照射灯，以完成UVA照射操作。
2结果与分析
表1细胞通过三种不同浓度防晒样品处理，在8J/cm2的UVA照射后ROS的含量(相对荧光单位RFU)
在图1中，照射前A，B,C组与对照组比较P>0.05，均无显著变化。UVA照射后对照组前后对比P＜0.05，B组前后比较P＜0.05，C组前后对比P＜0.05。照射后，ABC各组与对照组对比P＜0.01。
由表1及图1可见，UVA照射前，三种不同浓度处理的防晒样品与空白对照组比较，无统计学意义，并且同一样品的不同浓度之间的细胞ROS产生量无显著差异。而细胞经过8J/cm2的UVA照射后，对照组细胞中ROS显著增加，三种防晒样品处理后的细胞中ROS含量有相对小幅增加，P＜0.05，但较空白对照组具有显著抑制作用，P＜0.01。说明在光照下三种防晒化妆品显著抑制了细胞中ROS的生成，提示三种防晒化妆品对UVA引起的氧化损伤有明显的保护作用。
3讨论
防晒化妆品中含有的防晒剂,大体可分为紫外线吸收剂和紫外线散射剂。而紫外线吸收剂主要为有机物,内含有氨基苯甲酸酯类物质,它们在UVB与UVA段有光吸收,易于发生光毒性反应。且防晒化妆品多涂抹在曝光部位，直接接受紫外线照射,所以防晒化妆品功效性评价对于保障消费者健康是非常重要的。
目前,对于防晒化妆品防晒效果的评价,国际上一般采用人体法和仪器法紫外光谱法和仪法。人体法是在人体皮肤上直接涂抹防晒化妆品,其观察终点红斑和晒黑虽能体现人体皮肤的生理学反应,但存在成本高、因受试者的个体差异很大而数据重复的高度不确定性等缺点,最重要的是受试者有人体健康风险而体外仪器法虽具有操作快速简单,费用低廉,数据重复性相对较好等优点，但因非人体实验,无临床观察终点也遭到质疑。所以，为了推出安全、有效的防晒化妆品,就必须采取适当的方法对化妆品的防晒效果进行科学、合理和正确的评价。
高浓度的ROS具有十分活跃的化学生物特性，ROS可与皮肤组织中的细胞发生复杂的化学反应，从而产生多种生物学效应并造成细胞损伤，引起细胞正常功能衰减、皮肤光老化、皮肤癌等发生。在正常的细胞内存在较为完备的清除ROS的防御体系，包括酶促与非酶促体系。防御体系各成分之间相互起到协同作用。生理状态下细胞产生的少量活性氧可被胞内清除活性氧的防御体系清除,外界刺激因素诱导生成的大量ROS如不能被皮肤中的抗氧化系统及时清除,则会对组织造成损害。
本发明利用长波紫外线辐射所引起的细胞氧化损伤为理论基础,以体外培养的细胞为材料，建立了一种有别于传统防晒化妆品评价方法的体外生物学评价体系。试验中我们发现，经UVA照射后，细胞中ROS生成量显著增加，结果证实了UVA照射可引起细胞的氧化损伤，从而引起人体肌肤衰老。而三种防晒化妆品显著抑制了ROS的增加且具有统计学意义，以上结果提示我们，ROS作为UVA对细胞损伤的指标之一，反应敏感，可作为生物标志用于定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用。
综上所述,本研究的体外细胞法用于定性评价防晒化妆品的紫外线防护作用且具有操作简便、快速、经济、周期短等优点，为防晒类化妆品人体安全性及功效性评价提供技术保障。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。