一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法
阅读说明：本技术 一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法 (Preparation method of water-soluble astaxanthin fucoidin ester ) 是由 赵澎 高荔 王文静 申配丽 王东 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于虾青素水溶性改性技术领域,特别涉及一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法。该制备方法是将虾青素、二元有机酸、催化剂分子筛混合于水中形成乳化分散的反应浆料一,反应浆料一在惰性气体保护下发生反应得到中间体虾青素有机酸二酯,中间体虾青素有机酸二酯、岩藻多糖、催化剂分子筛混合于水中形成乳化分散的反应浆料二,反应浆料二在惰性气体保护下发生反应得到产物虾青素岩藻多糖酯。该制备方法得到的产物虾青素岩藻多糖酯在水中的溶解度大于15g/L,从根本上解决了虾青素的水溶性差的问题。(The invention belongs to the technical field of astaxanthin water-soluble modification, and particularly relates to a preparation method of water-soluble astaxanthin fucoidin ester. The preparation method comprises the steps of mixing astaxanthin, binary organic acid and a catalyst molecular sieve in water to form a first emulsified and dispersed reaction slurry, reacting the first reaction slurry under the protection of inert gas to obtain an intermediate astaxanthin organic acid diester, mixing the intermediate astaxanthin organic acid diester, fucoidin and the catalyst molecular sieve in water to form a second emulsified and dispersed reaction slurry, and reacting the second reaction slurry under the protection of inert gas to obtain a product astaxanthin fucoidin ester. The solubility of the product astaxanthin fucoidin ester obtained by the preparation method in water is more than 15g/L, thus fundamentally solving the problem of poor water solubility of astaxanthin.)
技术领域
本发明属于虾青素水溶性改性技术领域，特别涉及一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin，中文名3,3’-二甲基-4,4’-二酮基-β-胡萝卜素)，其分子式为C40H52O4，分子具有类胡萝卜素的多烯长链结构，有较强的活性氧自由基捕捉能力和抗氧化性，同时具有艳丽的红色。除药用外，在食品领域我国目前没有关于纯虾青素应用的法规，但早在2010 年将雨生红球藻粉列入新资源食品目录(卫生部2010-17号公告)，允许添加量折合虾青素 12毫克/天，2013年将磷虾油列入新资源食品目录，允许添加量3g/天，折合虾青素约1.5-3 毫克/天；瑞典拜尔力已在美国FDA取得GRAS认证(No.365)，推荐每日摄入量在4毫克，随着市场的完善和产业的发展，纯虾青素在食品营养强化和作为膳食营养补充剂的市场也将会日益壮大。
目前，虾青素的主要来源包括自然和工业合成，自然来源的虾青素有着较好的生物活性，其主要来自南极磷虾的脂肪以及微生物发酵(法夫酵母或雨生红球藻)，虾青素本身是一种游离态的烯醇结构，因此非常不稳定，而酯化后的虾青素稳定性提高，但是无论游离还是酯化的虾青素，都不能溶解在水溶液中。故虾青素水溶性差的技术问题限制了其抗氧化活性(活性自由基捕捉，淬灭单线态氧，抗过氧化自由基)的发挥，也限制了其在生物体内的利用效率；同时在市场应用上，也因为其水溶性差而限制了其加工和多样化应用。综上所述，改善虾青素的水溶性是增强其体内生物活性和商业化可行性的重要问题。
乳化，微胶囊化和分子结构修饰都是有效改善虾青素可溶性的常见方法，专利文献 202010097080.2、201911297997.0等均公开了制备含有虾青素微胶囊或液体微胶囊(纳米乳液)的方法，与其他已有的油脂类微胶囊产品类似，虾青素微胶囊也会遇到载油率低，附聚效果差，溶解性难以控制和应用稳定性差等通性问题，虾青素的水溶性问题未得到解决。另外，微胶囊化和乳化都需要一定的工艺以及稳定条件，加热，电解质的加入等都可能使其破乳或聚集沉淀，影响其使用效果，因此通过分子结构的修饰使得虾青素变得易溶是比较可靠的方法。
专利文献1CN201910693039.9公开一种利用甲氧基聚乙二醇乙酸与虾青素酯化带入水溶性良好的聚乙二醇链改进虾青素溶解性的方法，其合成方法为常规强碱性催化剂催化，采用吡啶、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸等有毒且和酯互溶的催化剂和溶剂，这些有机溶剂在酯中的残留即使经过多步纯化也难以除尽；甲氧基聚乙二醇乙酸极易吸潮，这会造成其虾青素酯容易吸潮吸湿，且甲氧基聚乙二醇乙酸不是法定的食品添加剂，上述这些问题都给后续的食品应用安全带来潜在隐患。专利文献2CN202010733602.3 则直接利用微藻(雨生红球藻，法夫酵母等)发酵后的浓缩菌丝体通过破壁粉碎离心等处理，分离掉不溶解成分后，得到一种混合液，虾青素在此混合液中由较好的水溶性，此方法不涉及化学处理，但所得产物为组成复杂的混合物，残留有发酵时添加的无机盐，且随发酵条件不同而组成变化，在食品安全上难以定性和定量分析评估。
发明内容
为了解决现有技术中的虾青素水溶性差的技术问题，本发明提供了一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法，虾青素、二元有机酸、催化剂分子筛混合于水中形成乳化分散的反应浆料一，反应浆料一在惰性气体保护下发生反应得到中间体二有机酸虾青素二酯，中间体二有机酸虾青素二酯、岩藻多糖、催化剂分子筛混合于水中形成乳化分散的反应浆料二，反应浆料二在惰性气体保护下发生反应得到产物虾青素岩藻多糖酯。
本发明所述二元有机酸选自草酸、丁二酸、2,4-己二烯酸、反丁烯二酸、己二酸、柠檬酸或2羟基丁二酸的一种或几种。
本发明所述催化剂分子筛为强酸性分子筛；所述催化剂分子筛筛选自HZSM-5、ZSM5、被元素Mo/Si/Zn改性的改性HZSM-5分子筛、或被元素Mo/Si/Zn改性的改性ZSM5分子筛；改性分子筛其具有xM2 O:Al2O3:ySiO2:zH2O:dX的典型组成，其中,x为0.7-1.1，y为5-100，z 为0-40,d为0-0.1，M为H+，Na+，K+，NH+ 4中的一种或几种，X为Mo/Si/Zn中的一种或几种。
本发明所述虾青素可以为天然，也可以为合成游离虾青素；本发明所述岩藻多糖的相对分子量不大于50000道尔顿；所述岩藻多糖的聚合度不大于350，即不多于350个单糖单元。
作为优选，所述二元有机酸与所述虾青素的摩尔比为5-15:1；所述催化剂分子筛的质量为所述二元有机酸与所述虾青素总质量的2-6％。将所述二元有机酸、游离虾青素及分子筛共同混合于1-5倍体积的水中，并加入前述原料总体积5-20％的玻璃珠，冷却下砂磨1-5h，过滤掉玻璃珠，得到虾青素，二元有机酸，分子筛催化剂以及水形成的乳化分散的反应浆料一。
作为优选，所述反应浆料一在50-80℃下反应3-10h，反应过程通入惰性气体Ar保护；反应完成后加入反应物1-2倍体积的5％NaCl溶液破乳，离心分离掉固相分子筛后，分液留取油相，即得到中间体二有机酸虾青素二酯。
作为优选，所述中间体二有机酸虾青素二酯和岩藻多糖共同混合于1-5倍体积的水中，并加入分子筛，并加入前述原料总体积5-20％的玻璃珠，冷却下砂磨1-5h，过滤掉玻璃珠，得到反应浆料二。
更为优选的，所述中间体二有机酸虾青素二酯的摩尔数与岩藻多糖聚合度之比为1:10-30，加入分子筛的质量以前述非水原料总质量计的2-6％。
作为优选，所述反应浆料二在50-80℃下反应2-12h，反应过程通入惰性气体Ar保护，反应结束后，离心分离掉固相分子筛，分液留取水相，去除溶剂后冷冻干燥得到产物虾青素岩藻多糖酯。
本发明所述的制备方法制备的产物虾青素岩藻多糖酯包括虾青素有机酸岩藻多糖二酯 a，以及在一条岩藻多糖链上形成的岩藻多糖虾青素有机酸内酯b；所述产物虾青素岩藻多糖酯在水中的溶解度大于15g/L，以质量分数计，虾青素含量占到a或b的3-10％。
其中，产物虾青素岩藻多糖酯包括的虾青素有机酸岩藻多糖二酯a，以及在一条岩藻多糖链上形成的岩藻多糖虾青素有机酸内酯b的结构如下所示：
本发明所述的制备方法制备的产物虾青素岩藻多糖酯添加到食品中进行应用。所有涉及的试剂均为食品安全法规中允许添加到食品中的，产物不存在有毒物质残留问题，具有很高的食品安全性。
本发明提供一种水溶性虾青素酯的制备方法，所述方法利用草酸等食品用有机二元酸链接岩藻多糖的羟基与游离虾青素的羟基，制备得到产物虾青素岩藻多糖酯，产物在水中的溶解度大于15g/L，从根本上解决了虾青素的水溶性差的问题。虾青素水溶性问题的解决可使其充分发挥抗氧化活性，还能补充增强虾青素的营养功能，也扩大了其在生物体内的利用效率；在市场应用上，有会因为其水溶性的解决拓宽其加工类型和多样化应用，比如可以方便的应用在饮料和液相产品中。与现有技术相比，还存在以下具体的有益效果：
1、与已公开的微胶囊技术相比，本发明化学合成的方式避免了虾青素微胶囊和乳化液的应用稳定性和聚集问题，产物中虾青素和岩藻多糖的相对含量均可通过现有食品检测方法标定，利于食品上的合规应用；
2、与其他已公开的化学合成方法改进虾青素水溶性相比，本发明的方法不使用有毒的有机溶剂和催化剂，所采用的原料均为食品或食品添加剂原料，产物中不存在有机溶剂和催化剂残留问题，全程绿色，产物符合食品安全法规，没有潜在的安全风险；
3、与其他已公开的化学合成方法相比，本发明的方法仅使用水为溶剂，产物提纯简易可行，分子筛回收可以重复利用，能够有效的降低生产成本，产品中虾青素含量3-10％，水溶液中虾青素含量可达15毫克/1克(现有法规要求添加量约1-5毫克/每100克食品饮料)，足够满足现有食品营养强化技术领域的应用要求。
附图说明
图1为本发明所提供的游离虾青素(Ast，乙醇中)和实施例3制备的虾青素草酸岩藻多糖二酯(Ast-Ox-Fuc,水中)的紫外可见光谱图；
图2为本发明所提供的岩藻多糖(Fuc)和实施例3制备的虾青素草酸岩藻多糖二酯(Ast-Ox-Fuc)的FT-IR图；
图3为本发明提供的虾青素(Ast)和实施例3制备的岩藻多糖(Fuc)和虾青素草酸岩藻多糖二酯(Ast-Ox-Fuc)的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种水溶性虾青素岩藻多糖酯的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域技术人员能够更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
S1 56克己二烯酸(山梨酸)、60克游离虾青素(摩尔比5：1)与2.32克分子筛HZSM-5(以前述原料总质量计，2％)共同混合于1倍体积的约80mL水中，加入8mL的玻璃珠(总体积5％)，冷却下砂磨1h，过滤掉玻璃珠，得到虾青素，山梨酸，分子筛催化剂以及水形成均匀的反应浆料；
S2 S1制备的反应浆料在通入Ar气体保护下，50℃下反应10h，完成后再加入90mL(1倍体积)的5％NaCl溶液破乳，离心，分液留取油相，即得到中间体二己二烯酸虾青素二酯49克，产率约为70％；
S3 49克S2制备的中间体二己二烯酸虾青素二酯、105克岩藻多糖(聚合度300，二己二烯酸虾青素二酯摩尔数与岩藻多糖聚合物中糖单体数之比为1：30)、4.6克分子筛HZSM-5(以前述原料总质量计，2％)共同混合于200mL(1倍体积)的水中，加入20mL(总体积 5％)的玻璃珠，冷却下砂磨1h，过滤掉玻璃珠，浆液在50℃下反应12h，反应过程需要通入 Ar气体保护，反应结束后，离心，分液后留水相先减压去除大部分溶剂，再进行冷冻干燥得到产物虾青素己二烯酸岩藻多糖二酯120克，产率约为80％(以岩藻多糖计)，根据朗伯定律推算，产物中虾青素含量为3.8％。
实施例2
S1 59克琥珀酸、30克游离虾青素(摩尔比10：1)与3.6克分子筛ZSM-5(以前述原料总质量计，4％)共同混合于150mL(3倍体积)的水中，加入20mL(总体积10％)的玻璃珠，冷却下砂磨3h，过滤掉玻璃珠，得到虾青素，琥珀酸，分子筛催化剂以及水形成均匀的反应浆料；
S2 S1制备的反应浆料在70℃下反应6h，反应过程需要通入Ar气体保护，完成后再加入 300mL(1.5倍体积)的5％NaCl溶液破乳，离心，过滤掉玻璃珠，分液留取油相，即得到中间体二琥珀酸虾青素二酯21克，产率约为60％；
S3 21克S2制备的中间体二琥珀酸虾青素二酯、90克岩藻多糖(聚合度200，二琥珀酸虾青素二酯摩尔数与岩藻多糖聚合物中糖单体数之比为1：20)、4.4克ZSM-5分子筛(以前述原料总质量计，4％)共同混合于400mL(3倍体积)的水中，加入50mL(总体积10％) 的玻璃珠，冷却下砂磨3h，过滤掉玻璃珠，浆液在70℃下反应8h，反应过程需要通入Ar气体保护，反应结束后，离心，分液后水相先减压去除大部分溶剂，再进行冷冻干燥得到产物虾青素琥珀酸岩藻多糖二酯77克，产率为70％(以岩藻多糖计)，根据朗伯定律推算，产物中虾青素含量为6.6％。
实施例3
S1 54克草酸、24克游离虾青素(摩尔比15：1)、6.3克分子筛HZSM-5(以前述原料总质量计，6％)共同混合于200mL(5倍体积)的水中，加入40mL(总体积20％)的玻璃珠，冷却下砂磨5h，过滤掉玻璃珠，得到虾青素，草酸，分子筛催化剂以及水形成均匀的反应浆料；
S2 S1制备的反应浆料在80℃下反应3h，反应过程需要通入Ar气体保护，完成后再加入 500mL(2倍体积)的5％NaCl溶液破乳，离心，分液留取油相，即得到中间体虾青素草酸二酯21.5克，产率约为80％
S3 21.5克S2制备的中间体二草酸虾青素二酯、144克岩藻多糖(聚合度100，二草酸虾青素二酯与岩藻多糖单体之比为1：10)、10克分子筛HZSM-5(以前述原料总质量计，6％)共同混合于500mL(5倍体积)的水中，加入120mL(总体积20％)的玻璃珠，冷却下砂磨 5h，过滤掉玻璃珠，浆液在80℃下反应2h，反应过程需要Ar保护，反应结束后，离心，分液后水相先减压去除大部分溶剂，再进行冷冻干燥得到产物虾青素草酸岩藻多糖二酯116克, 产率约为80％(以岩藻多糖计)。其合成路线以及产物虾青素草酸岩藻多糖二酯(Ast-Ox-Fuc) 的主要结构如下：
实例3所制备的中间体二草酸虾青素二酯(Ast-Ox)，如下结构：
Ast-Ox为暗红色油状液体，微溶于碱性水溶液，不溶于中性和酸性水溶液，其表征如下：元素分析：计算值C44H52O10，C 71.33,H7.07,O21.59％,测试值：C 71.01,H 7.30,O21.69％, MALDI-TOF:理论值：740.36(100％分子离子峰)，741.36(47.6％同位素峰)，测试值：740.36 (100％),741.35(47％)。
实施例3制备的虾青素草酸岩藻多糖二酯(Ast-Ox-Fuc)，测试其紫外可见光谱如附图1，在乙醇溶液中，游离虾青素的主要特征可见吸收峰位于496nm。因为岩藻多糖的溶液无色，因此不会在可见光范围内有吸收峰存在，而实例3制备的Ast-Ox-Fuc的水溶液在510nm处也出现了这一虾青素的特征吸收峰，同时300-400nm附近也出现了岩藻多糖特有的宽泛吸收峰，这表明虾青素存在于岩藻多糖的聚合物基体上。经过测试Ast的摩尔消光系数ε496nm＝1.5×106 g.L-1.cm-1，Ast-Ox-Fuc的摩尔消光系数ε510nm＝1.6×105g.L-1.cm-1,根据朗伯定律推算， Ast-Ox-Fuc中的虾青素含量约为9.4％。
从附图2可看出，与岩藻多糖相比，Ast-Ox-Fuc在1768和1280cm-1处显示了酯基的特征红外吸收峰，3400-3500cm-1处的多糖羟基吸收峰型和位置没有明显变化，这提示没有新的羧基集团的引入，利用化学分析中碱滴定的方法验证了其中没有能被碱中和的羧基的存在，这表明虾青素单酯中的羧基与岩藻多糖以酯键的形式进行了化学键合，1002和1100，以及 2969cm-1处的吸收峰提示了共轭多烯结构和烯烃C-H键的存在，这是虾青素的特征吸收。
附图3给出的HPLC谱图表明，游离虾青素的保留时间约在10.3min，而实例中所用岩藻多糖的出峰时间在32.3min，Ast-Ox-Fuc的谱图中除了可以观察到32min的未反应的岩藻多糖峰之外，在更长保留时间上37-40min的三个峰对应着二草酸虾青素二酯与岩藻多糖形成的如图1所示各种结构特征的酯，Ast-Ox-Fuc的色谱曲线上也没有出现游离虾青素或者二草酸虾青素二酯(10-15minmin)对应的峰。
另外，可经将实施例3中的分子筛替换成改性分子筛，其他条件不变，改性分子筛为改性HZSM-5分子筛，分子筛化学式为xM2 O:Al2O3:ySiO2:zH2O:dX-HZSM-5，其中,x为1，y为50，z为20,d为0.1，M为K+，X为Mo。产物的产率约为76％，根据朗伯定律推算， Ast-Ox-Fuc中的虾青素含量约为8.9％。
实施例4
4.1将实施例1-3制备的产物虾青素岩藻多糖酯与现有公开的虾青素酯产品相比，其性能优势见表1所示。
表1实施例1-3制备的产物与现有公开的其他虾青素产品性能
表1数据显示，实施实例1-3的中间体二有机酸虾青素二酯的溶解度较小，因为虾青素分子结构中有10个多烯键，有机酸引入的两个羧基并不能有效的改进其溶解度，而实施例1-3 的溶解度从15g/L到29g/L，说明中间体与易溶的大分子岩藻多糖链接从根本上解决了虾青素的水溶性差的问题；产物虾青素有机酸岩藻多糖二酯在水中的溶解度与岩藻多糖的聚合度成反比，利于根据实际应用要求进行调整；产物虾青素有机酸岩藻多糖二酯的水溶液粘度与岩藻多糖的聚合度成正比，当岩藻多糖的聚合度大于350时，产物的溶解度较小且粘度过大，不利于制备过程的分离。本发明公开方法制备的虾青素酯于现有专利公开产品相比，溶解度相当，考虑到食品工业营养强化的添加量，本专利公开的水溶虾青素酯溶解性完全满足需要；从生产过程来看，本发明所公开的方法，所涉及的化学试剂均在食品安全标准 (GB2760/14880)所允许范围内，然而对比例中虾青素发酵液提取干燥混合物中存在发酵培养基残余等问题，食品安全性需要进一步验证讨论，同时，对比例中甲氧基聚乙二醇乙酸虾青中的甲氧基聚乙二醇乙酸极易吸潮，这会造成其虾青素酯容易吸潮吸湿，且甲氧基聚乙二醇乙酸不是法定的食品添加剂，大量使用有毒有机溶剂和催化剂，故上述问题都给后续的食品应用安全带来潜在隐患。
4.2利用DPPH自由基清除实验(参考GB/T 39100-2020)和单线态氧捕捉实验(参考文献 DOI:10.1016/j.biomaterials.2008.09.061)测定实施实例1-3的产物虾青素岩藻多糖酯的抗氧化活性，结果如表2所示。
表2实施实例1-3的产物的抗氧化活性及其与现有化合物对比
IC50*
DPPH自由基
单线态氧
实施例1产物(水溶液)
95μg/ml
1.65mg/ml
实施例2产物(水溶液)
92μg/ml
1.60mg/ml
实施例3产物(水溶液)
80μg/ml
1.35mg/ml
游离虾青素(乙醇溶液)
75μg/ml
1.50mg/ml
茶多酚(水溶液)
100μg/ml
2.20mg/ml
岩藻多糖(水溶液)
5000μg/ml
-
2,6-二叔丁基对甲酚(BHT，水溶液)
1.75μg/ml
15.2μg/ml
*IC50是指清除率达到50％时相应化合物的浓度，所述浓度为以纯虾青素含量计
表2数据显示，实施实例1-3的岩藻多糖的虾青素酯均能制备成水溶液，水溶性的解决使实施例1-3的产物均具有与游离虾青素相当的自由基和单线态氧清除能力，其清除能力较常用的水溶性食品营养强化剂茶多酚稍强，但弱于纯化学合成的抗氧化剂BHT。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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