改性柞蚕丝蛋白以及基于该柞蚕丝蛋白的3d打印墨水
阅读说明：本技术 改性柞蚕丝蛋白以及基于该柞蚕丝蛋白的3d打印墨水 (Modified tussah silk protein and 3D printing ink based on modified tussah silk protein ) 是由 苟马玲 黄玉兰 杨雄 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及3D生物打印材料,具体涉及改性柞蚕丝蛋白以及基于该柞蚕丝蛋白的3D打印墨水,属于生物材料和生物医学工程技术领域。本发明提供了一种新型的具有优越力学性能和生物相容性的可光聚合改性柞蚕丝蛋白,该改性柞蚕丝蛋白为甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白,采用甲基丙烯酸酐与柞蚕丝蛋白反应得到。本发明采用柞蚕丝蛋白为基体,甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白,得到了一种新型的可用于光固化3D打印的生物材料,该材料具有优异的力学性能、生物相容性以及3D打印特性,其制备和打印方法简单,成本较低,适用于各种细胞,且打印后的支架力学性能和细胞相容性较好,可以让细胞具有较好的存活率和增殖率。(The invention relates to a 3D biological printing material, in particular to modified tussah fibroin and 3D printing ink based on the tussah fibroin, and belongs to the technical field of biological materials and biomedical engineering. The invention provides a novel photopolymerisable modified tussah silk protein with excellent mechanical property and biocompatibility, wherein the modified tussah silk protein is methacrylic anhydride grafted tussah silk protein and is obtained by reacting methacrylic anhydride with tussah silk protein. According to the invention, tussah fibroin is used as a substrate, methacrylic anhydride is grafted on the tussah fibroin to obtain a novel biological material capable of being used for photocuring 3D printing, the material has excellent mechanical property, biocompatibility and 3D printing characteristic, the preparation and printing methods are simple, the cost is lower, the material is suitable for various cells, the mechanical property and the cell compatibility of the printed scaffold are better, and the cells can have better survival rate and proliferation rate.)
技术领域
本发明涉及3D生物打印材料，具体涉及改性柞蚕丝蛋白以及基于该柞蚕丝蛋白的3D打印墨水，属于生物材料和生物医学工程技术领域。
背景技术
3D生物打印技术是体外构建复杂的组织和器官等组织工程和再生医学的重要技术支撑之一。基于数字光处理(digital light processing，DLP)的3D生物打印技术通过紫外光投影技术引发光敏液体逐层光固化，与喷墨、挤压和激光辅助打印等其他3D打印技术相比，具有快速成型、打印精度高和细胞存活率高等优势而被广泛应用。
3D生物打印技术的核心在于生物打印墨水，传统的3D打印材料主要存在生物相容性的问题，而丝素蛋白由于具有较好生物相容性被应用于3D打印领域，比如申请号为201610832278.4的中国发明专利公开了一种基于三维打印的蚕丝蛋白/明胶支架材料及其制备方法，该支架为蚕丝蛋白溶液中加入明胶，形成蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶，后将该复合水凝胶从三维打印机的针头挤出制得支架材料。申请号为201711362521.1的中国发明专利公开了一种纸团状石墨烯改性的光固化蚕丝蛋白三维打印材料及其制备方法，该材料包括纸团状石墨烯、蚕丝蛋白水凝胶、光引发剂和助剂。申请号为201710793524.4的中国发明专利公开了一种基于蚕丝微球生物墨水的三维打印伤口包覆材料及其制备方法，采用含包覆阿司匹林的蚕丝蛋白微球、蚕丝蛋白水溶液、紫外光引发剂和聚乙烯醇酯制备蚕丝微球生物墨水。文献《用于数字光处理3D打印的可精确打印且生物相容的丝素生物墨水》(Kim SH,Yeon Y K,Lee J M,et al.Precisely printable and biocompatible silk fibroinbioink for digital light processing3D printing[J].Nature Communications,2018,9(1):1620)也报道了将甲基丙烯酸缩水甘油酯与家蚕丝蛋白游离氨基反应接枝上双键用于DLP 3D打印(BSF-GMA)。
可见，现有的生物墨水大都采用家蚕丝蛋白(Bombyx mori silk fibroin，BSF)，由于家蚕丝蛋白缺乏可用于细胞粘附的精氨酸-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)序列，在一定程度上限制其应用。
柞蚕丝(Antheraea pernyi(A.p.)silk fibroin，ASF)是野生柞蚕所吐之丝，具有耐酸碱、强度高等特性，脱胶后得到的柞蚕丝蛋白主要是由丙氨酸的重复链段组成，相较于家蚕丝蛋白疏水性更强，分子链段更加规整；除此以外，柞蚕丝蛋白中含有与整合素受体结合的RGD三肽序列，细胞粘附作用更明显，这表明将柞蚕丝蛋白用于DLP 3D打印具有较好的应用潜力。
发明内容
针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种新型的可用于3D打印的改性柞蚕丝蛋白。
本发明改性柞蚕丝蛋白，为甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白，采用甲基丙烯酸酐与柞蚕丝蛋白反应得到，其中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为0.1～14％mL/g。
在本发明的一个实施方式中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为2.5％～12％mL/g。在本发明的一个
具体实施方式
中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为2.5％～10％mL/g。在本发明的一个更具体的实施方式中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为5％～10％mL/g。在本发明的一个具体实施例中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为10％mL/g。
进一步的，在本发明的一个实施方式中，该改性柞蚕丝蛋白采用以下方法制备得到：
a、制备再生柞蚕丝蛋白：将柞蚕丝蛋白与熔融Ca(NO3)2·4H2O按重量比1:1～50混合，反应3～5h后，在2～6℃透析3～5天，除水干燥，得到再生柞蚕丝蛋白；
b、制备改性柞蚕丝蛋白：将再生柞蚕丝蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，控制柞蚕丝蛋白浓度为0.1～10g/mL；加入甲基丙烯酸酐，搅拌反应4～8h后，在2～6℃透析3～5天，除水干燥，得到改性柞蚕丝蛋白；
其中，a步骤和b步骤的透析都采用MW＝3500的透析袋。
在本发明的一个具体实施例中，a步骤中，将柞蚕丝蛋白与熔融Ca(NO3)2·4H2O按重量比1:20混合，反应4h；b步骤中，柞蚕丝蛋白浓度为1g/mL，搅拌反应6h。
在本发明的一个具体实施方式中，a步骤中，所述柞蚕丝蛋白采用以下方法制备得到：将柞蚕茧清洗后，剪碎后，脱去丝胶，干燥，得到柞蚕丝蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，脱去丝胶的操作为至少重复一次以下步骤：柞蚕茧加入Na2CO3溶液，加热煮沸10～20min，取固体，洗涤。
本发明解决的第二个技术问题是提供一种基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印墨水。
本发明基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印墨水，包括上述的改性柞蚕丝蛋白、光引发剂和溶剂。
在本发明的一个具体实施方式中，改性柞蚕丝蛋白占3D打印墨水重量的10～30％，光引发剂占3D打印墨水重量的0.1～2％。在本发明的一个具体实施例中，改性柞蚕丝蛋白占3D打印墨水重量的20％，光引发剂占3D打印墨水重量的1％。
本发明还提供基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印生物墨水。
本发明3D打印生物墨水包括3D打印墨水和细胞，其中，所述3D打印墨水为上述的基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印墨水。
在本发明的一个具体实施方式中，细胞的密度为0.5×106～2×106个/mL；优选细胞的密度为1×106个/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明采用柞蚕丝蛋白为基体，甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白，得到了一种新型的可用于光固化3D打印的生物材料，该材料具有优异的力学性能、较好的生物相容性以及3D打印特性，可用于组织工程等领域。
2)本发明利用改性柞蚕丝蛋白为主要原料，制备得到3D打印墨水，该墨水可打印各种支架材料，其制备和打印方法简单，成本较低，适用于各种细胞，且打印后的支架力学性能较好，同时细胞相容性较好，可以让细胞具有较好的存活率和增殖率。
附图说明
图1为本发明实施例1和2制备的不同取代度的甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例3制备的水凝胶的压缩性能，其中，a)为PBS浸泡处理后的水凝胶压缩应力-应变曲线图；b)为75％乙醇浸泡处理后的水凝胶压缩应力-应变曲线图。
图3为本发明试验例1中不同细胞的增殖率，其中，a)NIH/3T3细胞；b)S16细胞；c)HUVEC细胞。
图4为本发明试验例2的3D打印镂空结构，其标尺为2mm。
图5为本发明试验例2在圆形玻片上打印的“和平鸽”组织构建体以及在第1、2和3天在荧光显微镜下的观察图片，其标尺为500μm。
具体实施方式
本发明改性柞蚕丝蛋白，为甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白，采用甲基丙烯酸酐与柞蚕丝蛋白反应得到，其中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为0.1～14％mL/g。
本发明改性柞蚕丝蛋白，采用甲基丙烯酸酐接枝到柞蚕丝蛋白上，该材料具有良好的力学性能、生物相容性和3D打印特性，为光固化3D打印生物墨水提供了新方法和新选择，在组织工程等领域具有良好的应用前景。
甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比与产品中的甲基丙烯酰基取代度相关，在本发明的一个实施方式中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为2.5％～12％mL/g。在本发明的一个具体实施方式中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为2.5％～10％mL/g。在本发明的一个更具体的实施方式中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为5％～10％mL/g。在本发明的一个具体实施例中，甲基丙烯酸酐的体积与柞蚕丝蛋白的质量比为10％mL/g。
进一步的，在本发明的一个实施方式中，该改性柞蚕丝蛋白采用以下方法制备得到：
a、制备再生柞蚕丝蛋白：将柞蚕丝蛋白与熔融Ca(NO3)2·4H2O按重量比1:1～50混合，反应3～5h后，在2～6℃透析3～5天，除水干燥，得到再生柞蚕丝蛋白；
b、制备改性柞蚕丝蛋白：将再生柞蚕丝蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，控制柞蚕丝蛋白浓度为0.1～10g/mL；加入甲基丙烯酸酐，搅拌反应4～8h后，在2～6℃透析3～5天，除水干燥，得到改性柞蚕丝蛋白；
其中，其中，a步骤和b步骤的透析都采用MW＝3500的透析袋。
在本发明的一个具体实施例中，4℃水透析3天，透析时每隔4h换水一次。
在本发明的一个具体实施例中，a步骤中，将柞蚕丝蛋白与熔融Ca(NO3)2·4H2O按重量比1:20混合，反应4h；b步骤中，柞蚕丝蛋白浓度为1g/mL，搅拌反应6h。
a步骤为制备再生柞蚕丝蛋白，可以采用市售的柞蚕丝蛋白为原料进行制备，也可以自制柞蚕丝蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述柞蚕丝蛋白采用以下方法制备得到：将柞蚕茧清洗后，剪碎后，脱去丝胶，干燥，得到柞蚕丝蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，脱去丝胶的操作为至少重复一次以下步骤：柞蚕茧加入Na2CO3溶液，加热煮沸10～20min，取固体，洗涤。
本发明所有的干燥步骤均可采用本领域常规干燥方法，在本发明的一个具体实施方式中，干燥采用冷冻干燥。采用冷冻干燥，可以使得干燥后的物料保持原来的化学组成和物理性质。
具体的，本发明改性柞蚕丝蛋白采用如下方法制备得到：
a、再生柞蚕丝蛋白的制备
将柞蚕茧清洗去除污垢晾干后，每个剪成4-5片，称量40g蚕茧，将1L 0.05M Na2CO3溶液加入其中并100℃加热煮沸15min脱去丝胶，蒸馏水洗涤数次拧干，重复前一操作，继续加入1L 0.05M Na2CO3溶液煮沸30min，拧干后采用纯水清洗几次，直至水中未见浑浊残留物，然后将柞蚕丝蛋白室温晾干备用。称量500g Ca(NO3)2·4H2O置于500mL的圆底烧瓶中，110℃加热熔融后缓慢加入25g柞蚕丝蛋白，反应4h后将反应溶液置于MW＝3500的透析袋中，4℃纯水透析3天，每4h换水一次，将透析后的溶液冻干得到20g的再生柞蚕丝蛋白，呈松软的浅棕色固体。
b、改性柞蚕丝蛋白的制备
称量1g再生柞蚕丝蛋白溶于10mL 0.25M碳酸盐缓冲液中，待搅拌溶解完毕后，滴加甲基丙烯酸酐(MAA)，搅拌反应6h后，溶液经神奇滤布过滤后置于MW＝3500的透析袋中，4℃纯水透析3天，每4h换水一次，将透析的溶液冻干，得到改性柞蚕丝蛋白。
本发明解决的第二个技术问题是提供一种基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印墨水。
本发明基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印墨水，包括上述的改性柞蚕丝蛋白、光引发剂和溶剂。
其中，所述光引发剂可以采用本领域普遍使用的光引发剂，包括但不限于LAP等，本领域常用的溶剂也都适用于本发明，包括但不限于PBS缓冲液等。
在本发明的一个具体实施方式中，改性柞蚕丝蛋白占3D打印墨水重量的10～30％，光引发剂占3D打印墨水重量的0.1～2％。在本发明的一个具体实施例中，改性柞蚕丝蛋白占3D打印墨水重量的20％，光引发剂占3D打印墨水重量的1％。
本发明还提供基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印生物墨水。
本发明3D打印生物墨水包括3D打印墨水和细胞，其中，所述3D打印墨水为上述的基于改性柞蚕丝蛋白的3D打印墨水。
所述细胞可以为任何现有细胞，包括但不限于3T3，HUVEC，S16等。
在本发明的一个具体实施方式中，细胞的密度为0.5×106～2×106个/mL；优选细胞的密度为1×106个/mL。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
1、再生柞蚕丝蛋白的制备
将柞蚕茧清洗去除污垢晾干后，每个剪成4-5片，称量40g蚕茧，将1L 0.05M Na2CO3溶液加入其中并100℃加热煮沸15min脱去丝胶，蒸馏水洗涤数次拧干，重复前一操作，继续加入1L 0.05M Na2CO3溶液煮沸30min，拧干后采用纯水清洗几次，直至水中未见浑浊残留物，然后将柞蚕丝蛋白室温晾干备用。称量500g Ca(NO3)2·4H2O置于500mL的圆底烧瓶中，110℃加热熔融后缓慢加入25g柞蚕丝蛋白，反应4h后将溶液置于MW＝3500的透析袋中，4℃纯水透析3天，每4h换水一次，将透析后的溶液冻干得到20g的再生柞蚕丝蛋白，呈松软的浅棕色固体。
2、甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白的制备
称量1g再生柞蚕丝蛋白溶于10mL 0.25M碳酸盐缓冲液中，待搅拌溶解完毕后，缓慢滴加100μL MAA，搅拌反应6h后，经神奇滤布过滤后置于MW＝3500的透析袋中，4℃纯水透析3天，每4h换水一次，将透析的溶液冻干，得到800mg甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白，记作ASF-MA10％，采用核磁共振氢谱H1-NMR分析合成结果，如图1所示。
实施例2
采用实施例1的方法，改变甲基丙烯酸酐(MAA)的加入量，分别加入缓慢滴加10μL、25μL、50μL和150μL MAA，制得甲基丙烯酸酐接枝柞蚕丝蛋白，分别记作ASF-MA1％、ASF-MA2.5％、ASF-MA5％和ASF-MA15％。其中，ASF-MA15％在搅拌反应6h后，产生沉淀严重，这是由于取代度过高不利于丝蛋白水溶液的稳定性。
制得的ASF-MA1％、ASF-MA2.5％、ASF-MA5％的核磁共振氢谱H1-NMR详见图1。如图1所示，结果显示甲基丙烯酰基成功接枝到柞蚕丝蛋白上，随着MAA的增加，特征峰的强度升高，甲基丙烯酰基取代度增加。
实施例3
将得到的ASF-MA2.5％、ASF-MA5％、ASF-MA10％依次分别配制10wt％、20wt％和30wt％的溶液，加入1wt％光引发剂LAP，得到打印墨水。
该打印墨水经405nm的紫外光照射10s，制备得到不同浓度和取代度的水凝胶。测定其力学性能，其方法为：采用DMA Q800动态力学分析仪，利用单轴压缩试验方法对水凝胶样品进行压缩性能评估。测试样品采用DLP 3D打印制成直径为6mm，高度为4mm的圆柱形的水凝胶。分别经PBS浸泡处理和75％乙醇浸泡处理后测压缩性能。其中，PBS浸泡处理为将打印完成的样品经PBS浸泡处理4h后，以1mm·min-1的速度压缩到最底部，观察样品情况。75％乙醇浸泡处理为将打印完成的样品经过75％乙醇溶液浸泡4h，然后将其采用PBS洗涤浸泡3次，每次10min，平衡后将其采用2mm·min-1的速度压缩测量。每组至少准备三个样品进行压缩试验。其结果见图2。图2中，30％ASF-MA10％为30wt％浓度的ASF-MA10％溶液制得的水凝胶，以此类推，20％ASF-MA10％为20wt％浓度的ASF-MA10％溶液制得的水凝胶，10％ASF-MA10％为10wt％浓度的ASF-MA10％溶液制得的水凝胶，30％ASF-MA5％为30wt％浓度的ASF-MA5％溶液制得的水凝胶，20％ASF-MA5％为20wt％浓度的ASF-MA5％溶液制得的水凝胶，10％ASF-MA5％为10wt％浓度的ASF-MA5％溶液制得的水凝胶，30％ASF-MA2.5％为30wt％浓度的ASF-MA2.5％溶液制得的水凝胶，20％ASF-MA2.5％为20wt％浓度的ASF-MA2.5％溶液制得的水凝胶。数据分析表明，75％乙醇浸泡后水凝胶压缩模量显著增加，硬度增强，力学性能显著提高。而由于ASF-MA2.5％取代度较低，10％ASF-MA2.5％PBS水凝胶过于柔软易碎，未能进行压缩试验。
试验例1水凝胶的细胞相容性
考虑3D打印的精度和力学性能，选择ASF-MA10％进行细胞相容性研究。采用常用的甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)与同类型的BSF-GMA水凝胶作为对照组。其中，BSF-GMA水凝胶参照对比文件的方法制备[Kim S H,Yeon Y K,Lee J M,et al.Precisely printable andbiocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing[J].Nature Communications,2018,9(1):1620]，具体的实验操作为：采用与提取柞蚕丝蛋白相同的方法，将20g家蚕茧经0.05M Na2CO3溶液煮沸脱去丝胶提取家蚕丝蛋白，室温晾干蓬松。称量2g家蚕丝蛋白溶于精确配制的10mL 9.3M溴化锂溶液中，60℃搅拌溶解1h。然后将600μL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)缓慢滴加至溶液中，以300rpm的搅拌速度、60℃反应3h后终止反应。将反应后的溶液转移至MW＝12400kDa的透析袋中，超纯水低温透析7天，将透析后的溶液采用3500rpm转速离心15min，上清液经冷冻干燥后即得到白色固体BSF-GMA材料。
将常用的甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)、BSF-GMA材料，与ASF-MA10％分别配制浓度为20％的打印墨水，将溶液加入到96孔板内，每孔30μl，铺满每孔的底部，经405nm紫外光照射形成水凝胶，PBS缓冲液换液三次，经培养基浸泡平衡后，将处于对数生长期的S16细胞，NIH/3T3细胞，HUVEC细胞分别以8×102个/孔、1×103个/孔、1×103个/孔的密度接种于96孔板内，每2天更换一次培养基，保证细胞正常增殖，分别在第1、3、5、7天采用CCK-8试剂，按照说明书的要求加入一定量的培养基和CCK-8试剂37℃避光孵育2h后，每孔吸出100μL置于96孔板内，采用酶标仪检测450nm处吸光度，分析细胞的增殖情况。此三种细胞在GelMA水凝胶上都能正常增殖，而BSF-GMA水凝胶由于缺乏细胞粘附序列RGD，此三种细胞均不能很好地与基底材料发生粘附，容易脱落，从而导致检测的数值均很低，在第7天随着增殖数量增多才能被检测出有明显地增殖；而细胞在两种ASF-MA10％水凝胶能够粘附生长，具有与GelMA水凝胶比较相近的增殖速率。同时，根据ASF-MA10％PBS和ASF-MA10％EtOH水凝胶表面的三种细胞增殖情况可以发现，经乙醇浸泡水凝胶上细胞的增殖速率相对较缓慢，但细胞仍具有较好的增殖速率。
试验例2 3D打印
采用DLP 3D打印技术，设定相应的程序，将镂空结构层层拆分切割导入程序内，数据经处理后以数字光投影到打印平台，ASF-MA10％打印墨水经紫外光光固化形成如图4所示的镂空结构，高度约5mm，证明制备的ASF-MA10％材料具有较好的3D打印特性。
另一方面，将处于对数生长期的红色荧光蛋白标记的小鼠结肠癌细胞(CT26-RFP)采用胰酶消化，离心重悬混匀后采用自动计数仪进行计数，将一定量的细胞离心后弃去上清，加入一定量的0.22μm无菌滤膜过滤的20％ASF-MA10％PBS溶液，使细胞的密度为1×106个/mL，立即将其与细胞混匀。无菌条件下在直径为16mm圆形玻片上进行打印，打印完后样品转移至12孔板内，采用无菌PBS洗涤浸泡，除去未交联的单体、未在水凝胶内部的细胞以及光引发剂LAP，并及时更换为DMEM完全培养基，平衡15min后再更换新鲜的DMEM完全培养基，将其在含5％CO2、饱和湿度的37℃孵箱内培养，第1、2和3天在荧光显微镜下观察细胞及荧光强度，详见图5。从图中可以看出，细胞荧光强度逐渐增强，说明细胞可以在3D打印的水凝胶内部有较好的细胞存活率。
综上，本发明的基于柞蚕丝蛋白的3D打印墨水，具有较好的生物相容性和压缩性能，在组织工程等领域具有一定的应用前景。