阅读说明：本技术 一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷a的方法 (Method for preparing rebaudioside A by utilizing fermentation catalysis of bacillus subtilis ) 是由 夏家信 祁飞 陈永旭 陆晓雨 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法,其特征在于：1.糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上,将质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中,将枯草芽孢杆菌接入LB培养基,30～37℃培养20～24 h；2.按1%～10%体积比的接种量接入种子罐中培养,通气,30～37℃培养20～24 h；3.按1%～10%体积比的接种量接入发酵罐中培养,通气,控制pH为6～8,30～37℃培养48～72h；4.压滤得到枯草芽孢杆菌菌体,重悬,高压均质破碎,压滤得粗酶液；5.将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5-10：1-5：40-60：5-20混合,在25-40℃反应12-48 h即可。本发明优点：提高了莱鲍迪苷A的产量,可达85.3 g/L；操作步骤少,生产成低本,易于工业化生产。(The invention relates to a method for preparing rebaudioside A by utilizing fermentation catalysis of bacillus subtilis, which is characterized by comprising the following steps: 1. the glycosyltransferase UGT76G1 gene is connected to a PBR322 plasmid vector, the plasmid vector is transferred to the competence of the bacillus subtilis, the bacillus subtilis is inoculated into an LB culture medium and cultured for 20-24 h at the temperature of 30-37 ℃; 2. inoculating the mixture into a seeding tank according to the inoculation amount of 1-10% of the volume ratio for culture, ventilating, and culturing for 20-24 h at 30-37 ℃; 3. inoculating the mixture into a fermentation tank according to the inoculation amount of 1-10% of the volume ratio for culture, ventilating, controlling the pH to be 6-8, and culturing for 48-72 h at 30-37 ℃; 4. filter-pressing to obtain bacillus subtilis thallus, resuspending, homogenizing and crushing under high pressure, and filter-pressing to obtain crude enzyme solution; 5. mixing stevioside, uridine diphosphate glucose, a phosphate buffer solution and a crude enzyme solution according to a mass ratio of 5-10: 1-5: 40-60: 5-20, and reacting at 25-40 ℃ for 12-48 h. The invention has the advantages that: the yield of rebaudioside-A is improved and can reach 85.3 g/L; the operation steps are few, the production cost is low, and the industrial production is easy to realize.)

一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法

技术领域

本发明属微生物发酵酶制剂技术领域，涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法。

背景技术

甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的200～300倍，能量约为蔗糖的1/300，无毒无副作用，具有较高的稳定性和安全性，是代替蔗糖理想的天然甜味剂，被国际上誉为“第三糖源”。有研究报道，长期食用甜菊糖可以预防高血压、糖尿病、肥胖病、蛀齿等疾病。甜菊苷占糖苷总量的60% ～ 70%，其口感差于莱鲍迪苷A，有一定的后苦味。莱鲍迪苷A是甜菊糖苷混合物中的一种糖苷成分，是甜菊糖苷成分中甜度最高的，口感最接近蔗糖，具有更高的稳定性。

目前，有报道利用酶法和发酵法对甜菊糖进行改质，专利公开号为CN108486160A中报道了一种高密度发酵法合成莱鲍迪苷A的方法，但其发酵液中的成分复杂，且甜菊糖产量低，分离成本高；全细胞催化效率低，需要大量的细胞菌体进行催化，成本高，难以工业化生产。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有酶法和发酵法将甜菊苷催化为莱鲍迪苷A的生产中存在的生产成本高，操作复杂，不能应用于工业化生产的问题，提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将载有基转移酶UGT76G1基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30～37 ℃，转速100-250 rpm，培养时间20～24 h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照1%～10%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为200～400 rpm，通气比为0.1～1 V/V.min，30～37℃温度下培养20～24 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为200～1000 rpm，通气比为0.1～2 V/V.min，在30～37℃温度下，控制pH为6～8，培养48～72小时，发酵结束得到发酵液；

（4）将步骤（3）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（5）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5-10 ：1-5：40-60 ：5-20 混合，随后在25-40℃下反应时间12-48 h即可得莱鲍迪苷A。

进一步，所述步骤（3）中发酵培养基制备方法如下：按照豆饼粉10-40 g、麸皮20-50 g、玉米粉30-60 g、磷酸氢二铵1-10 g、磷酸氢二钠1-10 g、氯化钙0.1-5 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6～8，用去离子水定容至1000 ml。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明所述制备莱鲍迪苷A的方法，通过发酵方法获得粗酶液，提高了莱鲍迪苷A的产量，减少了操作步骤，降低了生产的成本，易于工业化生产，解决了目前发酵法酶活低，操作复杂，生产成本高的问题；

2.本发明中宿主菌为枯草芽孢杆菌，食品安全性能高；

3.发酵培养基中所用的豆饼粉、麸皮、玉米粉等均为廉价、来源广泛的原料，大幅度的降低了生产的成本；

4.本发明中催化莱鲍迪苷A的方法，产物莱鲍迪苷A的产量能达到85.3 g/L，远高于现有报道产量，降低了生产成本，更有利于工业化生产。

具体实施方式

一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，具体实施步骤如下：

实施例1

（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将载有基转移酶UGT76G1基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度34 ℃，转速150rpm，培养时间22 h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照5%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为300 rpm，通气比（通气比为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比）为0.5 V/V.min，35℃温度下培养22 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照50%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中所述发酵培养基，按照豆饼粉20 g、麸皮28 g、玉米粉40 g、磷酸氢二铵5 g、磷酸氢二钠5 g、氯化钙2 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为7，用去离子水定容至1000 ml；控制发酵罐转速为500 rpm，通气比为1 V/V.min，在34℃温度下，控制pH为7，培养55小时，发酵结束得到发酵液；

（4）将步骤（3）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬10min，高压（0.3Mp）均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（5）催化体系：

1000 L反应体系，甜菊糖苷50 kg，尿苷二磷酸葡萄糖1.2 kg，磷酸缓冲液600 kg，粗酶液60 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间30 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为47.9 g/L。

实施例2

（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将载有基转移酶UGT76G1基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30℃，转速200 rpm，培养时间20 h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照5%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为300 rpm，通气比（通气比为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比）为0.4 V/V.min，30℃温度下培养20h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照50%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中所述发酵培养基，按照豆饼粉15 g、麸皮40 g、玉米粉35 g、磷酸氢二铵2.8g、磷酸氢二钠7 g、氯化钙0.2 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为7.2，用去离子水定容至1000 ml；控制发酵罐转速为500 rpm，通气比为1.5 V/V.min，在30℃温度下，控制pH为7.5，培养60小时，发酵结束得到发酵液；

（4）将步骤（3）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬18min，高压（0.4Mp）均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（5）催化体系：

1000 L反应体系，甜菊糖苷70 kg，尿苷二磷酸葡萄糖2.3 kg，磷酸缓冲液500 kg，粗酶液100 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间34 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为66.8g/L。

实施例3

（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将载有基转移酶UGT76G1基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30℃，转速220 rpm，培养时间24 h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照8%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为400 rpm，通气比（通气比为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比）为0.3 V/V.min，30℃温度下培养24h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照8%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中所述发酵培养基，按照豆饼粉25 g、麸皮24 g、玉米粉35 g、磷酸氢二铵7 g、磷酸氢二钠8 g、氯化钙1 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为7.8，用去离子水定容至1000 ml；控制发酵罐转速为800 rpm，通气比为1.8 V/V.min，在30 ℃温度下，控制pH为8，培养72小时，发酵结束得到发酵液；

（4）将步骤（3）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬13min，高压（0.2Mp）均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（5）催化体系：1000 L反应体系，甜菊糖苷80 kg，尿苷二磷酸葡萄糖3.5 kg，磷酸缓冲液450 kg，粗酶液140 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间38 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为75.3g/L。

实施例4

（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将载有基转移酶UGT76G1基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度37℃，转速180 rpm，培养时间24 h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照2%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为200 rpm，通气比（通气比为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比）为0.3 V/V.min，37℃温度下培养24h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照2%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中所述发酵培养基，按照豆饼粉11 g、麸皮25 g、玉米粉50 g、磷酸氢二铵6 g、磷酸氢二钠4 g、氯化钙4 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6.8，用去离子水定容至1000 ml；控制发酵罐转速为800 rpm，通气比为2 V/V.min，在37 ℃温度下，控制pH为6.8，培养72小时，发酵结束得到发酵液；

（4）将步骤（3）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬15min，高压（0.1Mp）均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（5）催化体系：

1000 L反应体系，甜菊糖苷90 kg，尿苷二磷酸葡萄糖4.2 kg，磷酸缓冲液420 kg，粗酶液180 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间42 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为85.3 g/L。

上述实施例中所用LB培养基的配方为：5 g酵母粉、10 g氯化钠、10 g蛋白胨，用去离子水定容至1000 ml；本发明所用到的各种培养基以及各种容器均经过高压蒸汽灭菌处理。

粗酶液酶活检测方法：

（1）取粗酶液120 ul， 100 g/L甜菊糖苷100 ul ，10 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖100ul，Tris-HCl缓冲液680 ul，37℃反应24 h；

（2）对照样品处理方法同上，将粗酶液更换为120 ul缓冲液；

（3）反应结束后沸水浴灭酶10 min，再10000 g离心5 min，取上清液过0.22 um滤膜，液相检测；

（4）酶活定义：在上述条件下1ml粗酶液1小时生成莱鲍迪苷A液相峰面积，定义为酶的活力单位；

液体酶活（U/ml）=

（5）式中ΔA为生成莱鲍迪苷A的峰面积；T为反应的时间（h）；V为参与反应粗酶液的体积（ml）。

各实施例的结果表明，一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，用发酵获得的粗酶液催化反应，体系中莱鲍迪苷A最高浓度可达85.3 g/L；有效解决了酶催化反应效率低，产量低的问题，操作简单，清洁环保，具有重要的市场价值和应用价值。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。