适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用
阅读说明：本技术 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用 (Vitreoscilla hemoglobin expression frame suitable for bacillus and application ) 是由 陈守文 张清 蔡冬波 陈耀中 杨帆 马昕 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术与发酵工程领域,提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用,本发明将透明颤菌血红蛋白VHb与枯草芽胞杆菌中YwbN的信号肽SPywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌中淀粉酶终止子TamyL相连,组成VHb蛋白表达框P43-SPywbN-<I>vhb-</I>TamyL。将该表达框应用于三种芽胞杆菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)中,与常规的单独强化表达VHb菌株相比,分别使得聚γ-谷氨酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量提高21.85%、18.77%和23.40%,本发明为透明颤菌血红蛋白VHb在芽胞杆菌中高效表达和广泛应用提供了理论指导。(The invention belongs to the field of biotechnology and fermentation engineering, and provides a vitreoscilla hemoglobin expression frame suitable for bacillus and application thereofBlock P43-SPywbN- vhb‑ TamyL. The expression frame is applied to three kinds of bacillus (bacillus subtilis 168, bacillus amyloliquefaciens LX-12 and bacillus licheniformis DW2), compared with a conventional single intensified expression VHb strain, the yield of poly-gamma-glutamic acid, iturin A and bacitracin is respectively improved by 21.85%, 18.77% and 23.40%, and the invention provides theoretical guidance for efficient expression and wide application of vitreoscilla hemoglobin VHb in bacillus.)
技术领域
本发明属于生物技术与发酵工程领域，具体涉及适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用。
背景技术
透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)是在细菌中发现的第一种血红蛋白，其来源于一种革兰氏阴性菌——透明颤菌。自然状态下的VHb以同型二聚体形式存在，两个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋(A,B,E,F,G,H)，相对分子量为15775，且各含有一分子b型血红素。低氧条件下，VHb可以与氧结合，发生构象变化，又能够与氧解离，将氧传递给呼吸链，调节呼吸链末端氧化酶的活性。目前，VHb已在多种宿主细胞(大肠杆菌、假单胞菌、烟草、水稻、斑马鱼等)中成功表达，用于改善动植物细胞特性、改善细菌在高耗氧或氧气受限的高密度发酵中的生长情况。
虽然已有人将透明颤菌血红蛋白成功异源表达在芽胞杆菌中(熊欢等，微生物学通报，2008,11:1703-1707；Cai et al.,Biotechnol Bioeng,2018,115:2541-2553)，但前人均是将血红蛋白直接在芽胞杆菌中表达，但是如何构建更加高效且具有广谱性的VHb表达框一直亟待研究。
枯草芽胞杆菌中未知功能的蛋白质YwbN是按照Tat分泌途径分泌的蛋白质，其含有双精氨酸信号肽，N端含有双精氨酸(RR/KR)二级结构。然而，目前该YwbN蛋白功能未知。在之前的研究中，人们通过对信号肽的筛选，可以提高目标蛋白的表达水平。然而，相关的文献研究同时提出，对于不同的目标蛋白，其穿膜肽的筛选并不具有普适性，即人们需要根据特定的目标蛋白来选择合适的穿膜肽。然而，暂无穿膜肽YwbN会影响目的蛋白合成的文献报道。
此外，虽然有研究将血红蛋白与Tat型穿膜肽进行耦联表达，提高了盐单胞菌中氧气供给效率和PHA产量(Ouyang et al.,Metab Eng,2018,45:20-31)。然而，文章并没有列出具体的穿膜肽种类。此外，盐单胞菌与芽胞杆菌基因组信息无相似性，生理形态也差别较大。因此，无法根据前人结果进行芽胞杆菌中透明颤菌血红蛋白的高效表达及基于透明颤菌血红蛋白高效表达的代谢产物的高效合成。
申请人发现，将透明颤菌血红蛋白VHb与穿膜肽耦联表达，可以提高细胞的氧气传递效率，进而有利于代谢产物合成。本发明将透明颤菌血红蛋白基因vhb与枯草芽胞杆菌中未知功能蛋白YwbN的信号肽SPywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌淀粉酶终止子TamyL相连，组成VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL。并将该表达框应用于三种芽胞杆菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)中，分别提高了聚γ-谷氨酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量。本发明的研究结果将对工业生产中透明颤菌血红蛋白VHb在芽胞杆菌中的高效表达和广泛应用提供指导。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个目的在于提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述表达框的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
透明颤菌血红蛋白表达框在提高芽胞杆菌发酵效率中的应用，包括将含有透明颤菌血红蛋白表达框的表达载体，导入芽胞杆菌中，将该转基因菌株进行常规发酵生产。
所述的透明颤菌血红蛋白表达框的序列为SEQ ID NO.1所示；
所述的表达载体为适用于芽胞杆菌的表达载体；
以上所述的应用中，优选的，所述的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌。
以上所述的应用中，优选的，所述的枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌168，所述的解淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌LX-12、所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2；
以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高枯草芽胞杆菌168发酵生产聚γ-谷氨酸中的应用；
以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高解淀粉芽胞杆菌LX-12发酵生产伊枯草菌素A中的应用；
以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高地衣芽胞杆菌DW2发酵生产杆菌肽中的应用；
以上所述的应用中，优选的，所述的表达载体为pHY300PLK载体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明将透明颤菌血红蛋白基因vhb与枯草芽胞杆菌中未知功能蛋白YwbN的信号肽S PywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌淀粉酶终止子TamyL相连，组成VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL，含有该表达框的三种芽胞杆菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)的聚γ-谷氨酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量均有不同程度的提高。本发明结果表明，构建VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL是一种提高芽胞杆菌中透明颤菌血红蛋白表达效率的方法，或对更广泛的芽胞杆菌的工业生产有借鉴意义。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
含有不同芽胞杆菌穿膜肽的透明颤菌血红蛋白表达框的构建：
1.将P43启动子、SPywbN信号肽、vhb基因以及TamyL终止子四段连接起来，构建出P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2.以pHY300PLK质粒为模版，PCR扩增获得pHY300PLK载体，引物为300-T5-F：gaattcctgttataaaaaaaggatc和300-T5-R：tctagaagcttgggcaaagcgtttt。
3.测定pHY300PLK载体与目的基因片段的浓度，计算出载体与片段的使用量，于冰上配制反应体系(使用ClonExpress II重组克隆试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，37℃重组反应30min后立即置于冰上冷却；Ca2+转化法将重组产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，将菌体涂布在Tet抗性平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-F与pHY-R，若出现目的条带为1657bp，则可进行下一步测序，载体的核苷酸序列测定由武汉擎科生物技术有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即表达载体构建成功，转化子命名为游离表达载体pHY-P43-SPywbN-vhb-Tamy L。菌落PCR所用引物的序列如下：
pHY-F:gtttattatccatacccttac
pHY-R:cagatttcgtgatgcttgtc；
4.采用上述同样的方法，发明人选取了芽胞杆菌Sec类型、Tat类型穿膜肽，包括SacC信号肽、Vpr信号肽、AprE信号肽、SacB信号肽、BprA信号肽、YwtF信号肽、YwoF信号肽、YbdN信号肽、YvpA信号肽、YwaD信号肽(Sec型穿膜肽)，PhoD信号肽、TagA信号肽、TorA信号肽(Tat类型穿膜肽)对pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL载体中的SPywbN进行替换，其余表达框元件完全相同，将这些表达框插入pHY300PLK质粒，构建得到了不同穿膜肽介导的透明颤菌血红蛋白表达载体，依次分别为：pHY-P43-SPSacC-vhb-TamyL、pHY-P43-SPVpr-vhb-TamyL、pHY-P43-SPAprE-vhb-TamyL、pHY-P43-SPSacB-vhb-TamyL、pHY-P43-SPBprA-vhb-TamyL、pHY-P43-SPYwtF-vhb-TamyL、pHY-P43-SPYwoF-vhb-TamyL、pHY-P43-SPYbdN-vhb-TamyL、pHY-P43-SPYvpA-vhb-TamyL、pHY-P43-SPYwaD-vhb-TamyL、pHY-P43-SPPhoD-vhb-TamyL、pHY-P43-SPTagA-vhb-TamyL、pHY-P43-SPTorA-vhb-TamyL)。此外，作为对照组，构建了不含信号肽的血红蛋白表达载体pHY-P43-vhb-TamyL；
5.将上述血红蛋白表达载体电转化至枯草芽胞杆菌168中，构建了相应信号肽介导的枯草芽胞杆菌血红蛋白表达菌株BS168/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPSacC-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPVpr-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPAprE-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPSacB-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPBprA-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPYwtF-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPYwoF-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPYbdN-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPYvpA-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPYwaD-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPPhoD-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPTagA-vhb-TamyL、BS168/pHY-P43-SPTorA-vhb-TamyL。此外，将不含信号肽的血红蛋白表达载体pHY-P43-vhb-TamyL也转入枯草芽胞杆菌168中，得到BS168/pHY-P43-vhb-TamyL。
实施例2：
适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框的筛选：
将实施例1中得到的枯草芽胞杆菌血红蛋白表达菌株进行聚γ-谷氨酸发酵实验。种子培养的具体步骤：将实施例1获得的枯草芽胞杆菌菌株分别接种到添加1‰(v/v)Tet抗生素的LB液体培养基中，180～300r/min 37℃摇床培养12h；然后将活化的菌液以1％(v/v)接种量接种于50mL的LB液体培养基，同时添加1‰(v/v)Tet抗生素，230r/min 37℃培养12h，获得发酵所需的种子培养液。
聚γ-谷氨酸发酵培养基配方为：80g/L葡萄糖，30g/L谷氨酸钠，10g/L柠檬酸钠，10g/L硝酸钠，8g/L氯化铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L七水硫酸锌，1g/L无水氯化钙，1g/L硫酸镁，0.15g/L一水硫酸锰，pH7.2
聚γ-谷氨酸发酵的具体步骤：将聚γ-谷氨酸发酵培养基装入500mL锥形瓶中(每瓶的装液量为50mL)，随后以3％(v/v)的接种量将种子培养液接种至对应的发酵培养基中，接种完毕后于230r/min 37℃摇床培养36h。
聚γ-谷氨酸产量检测的方法：采用乙醇沉降及干重法测定，先称取一定重量的发酵液样品，用HCl溶液将pH调至2.0-3.0，12000r/min离心10min除去菌体，再用NaOH将上清液的pH调至中性，加入3倍体积无水乙醇使聚γ-谷氨酸沉降下来，再次离心收集沉淀，并置于80℃烘箱干燥，测得聚γ-谷氨酸的质量。根据干重法计算发酵后的各个菌株的聚γ-谷氨酸的产量(具体数据见下表)。
表1 含有不同透明颤菌血红蛋白表达框的枯草芽胞杆菌168聚γ-谷氨酸产量
菌株
聚γ-谷氨酸产量(g/L)
BS168/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL
36.75
BS168/pHY-P43-SPSacC-vhb-TamyL
27.32
BS168/pHY-P43-SPVpr-vhb-TamyL
29.75
BS168/pHY-P43-SPAprE-vhb-TamyL
30.43
BS168/pHY-P43-SPSacB-vhb-TamyL
31.24
BS168/pHY-P43-SPBprA-vhb-TamyL
29.54
BS168/pHY-P43-SPYwtF-vhb-TamyL
31.25
BS168/pHY-P43-SPYwoF-vhb-TamyL
24.32
BS168/pHY-P43-SPYbdN-vhb-TamyL
21.46
BS168/pHY-P43-SPYvpA-vhb-TamyL
28.43
BS168/pHY-P43-SPYwaD-vhb-TamyL
30.43
BS168/pHY-P43-SPPhoD-vhb-TamyL
28.43
BS168/pHY-P43-SPTagA-vhb-TamyL
26.54
BS168/pHY-P43-SPTorA-vhb-TamyL
31.25
BS168/pHY-P43-vhb-TamyL
28.43
结果表明，当采用YwbN信号肽时，透明颤菌血红蛋白的表达效果最好(即SEQ IDNO.1所示的透明颤菌血红蛋白表达框)，聚γ-谷氨酸的提升效果也最为明显，同时发现并不是所有的Tat型信号肽都适用于芽胞杆菌中透明颤菌血红蛋白的表达，至于哪种信号肽适用于血红蛋白表达并无原理可推导。
实施例3：
P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框在提高枯草芽胞杆菌聚γ-谷氨酸发酵产量中的应用：
本实施例，针对不同的聚γ-谷氨酸发酵培养基配方，考察了解枯草芽胞杆菌BS168/pH Y-P43-SPywbN-vhb-TamyL的生产聚γ-谷氨酸的能力(同时也在这21种培养基中接种枯草芽胞杆菌BS168/pHY-P43-vhb-TamyL作为对照)，21组培养基配方具体如表2所示：
表2 不同的聚γ-谷氨酸发酵培养基配方
种子培养的具体步骤：将实施例1获得的枯草芽胞杆菌菌株BS168/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL和对照菌株枯草芽胞杆菌BS168/pHY-P43-vhb-TamyL接种到添加1‰(v/v)Tet抗生素的LB液体培养基中，180～300r/min 37℃摇床培养12h；然后将活化的菌液以1％(v/v)接种量接种于50mL的LB液体培养基，同时添加1‰(v/v)Tet抗生素，230r/min 37℃摇床培养12h，获得发酵所需的种子培养液；
聚γ-谷氨酸发酵的具体步骤：将表2中不同的聚γ-谷氨酸发酵培养基装入500mL锥形瓶中(每瓶的装液量为50mL)，随后以3％(v/v)的接种量将种子培养液接种至对应的发酵培养基中，接种完毕后于230r/min 37℃摇床培养36h。
聚γ-谷氨酸产量检测的方法：采用乙醇沉降及干重法测定，先称取一定重量的发酵液样品，用HCl溶液将pH调至2.0-3.0，12000r/min离心10min除去菌体，再用NaOH溶液将上清液的pH调至7.0左右，加入3倍体积的无水乙醇使聚γ-谷氨酸沉降，再次离心收集沉淀后，置于80℃烘箱干燥，测得聚γ-谷氨酸的干重。计算发酵后的菌液中聚γ-谷氨酸的产量(具体数据见表3)。
表3 不同培养基配方发酵后的聚γ-谷氨酸产量
由表3可看出，在相同种子发酵和不同生产发酵的条件下，相对于现有技术的枯草芽胞杆菌BS168/pHY-P43-vhb-TamyL来说，采用本发明的枯草芽胞杆菌菌株BS168/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL的生产发酵的聚γ-谷氨酸产量有大幅提升(至少提高21.85％)，说明：本发明P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框在提高枯草芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸产量方面具有重大应用价值。
实施例4：
P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框在提高解淀粉芽胞杆菌伊枯草菌素A发酵产量中的应用:
将血红蛋白表达载体pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL及pHY-P43-vhb-TamyL分别转化至解淀粉芽胞杆菌LX-12，得到解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL和LX-12/pHY-P43-vhb-TamyL。本实施例，针对不同的伊枯草菌素A发酵培养基配方，考察了解解淀粉芽胞杆菌菌株LX-12/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL生产伊枯草菌素A的能力(同时也在这13种培养基中接种解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-P43-vhb-TamyL作为对照)，13组培养基配方具体如表4所示：
表4 不同的伊枯草菌素A发酵培养基配方
种子培养的具体步骤：将解淀粉芽胞杆菌菌株LX-12/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL和对照菌株解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-P43-vhb-TamyL接种到添加1‰(v/v)Tet抗生素的LB液体培养基中，230r/min 37℃摇床培养12h；然后将活化的菌液以1％(v/v)接种量接种于50mL的LB液体培养基，同时添加1‰(v/v)Tet抗生素，230r/min 30℃中培养12h，获得发酵所需的种子培养液；
伊枯草菌素A发酵的具体步骤：将表4中不同的伊枯草菌素A发酵培养基装入500mL锥形瓶中(每瓶的装液量为150mL)，随后以3％(v/v)的接种量将种子培养液接种至对应的发酵培养基中，接种完毕后于250r/min 28℃摇床培养72h，收集发酵液用于伊枯草菌素A产量检测。
伊枯草菌素A产量检测的方法：采用高效液相色谱(HPLC)法检测样品。HPLC系统为Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱Lichrospher C18(规格：5μm，25cm×4.6mm)，流动相为10mmol/L乙酸铵/乙腈＝65:35(v/v)，进样量为10μL，检测波长210nm，流速为1.0mL/min。根据此法计算出发酵后的菌液中伊枯草菌素A的产量(具体数据见表5)。
表5 不同培养基配方发酵后的伊枯草菌素A产量
由表5可看出，在相同种子发酵和不同生产发酵的条件下，相对于现有技术的对照菌株解淀粉芽胞杆菌LX-12/pHY-P43-vhb-TamyL来说，采用本发明的解淀粉芽胞杆菌菌株LX-12/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL生产发酵的伊枯草菌素A产量大幅提升(至少提高18.77％)，说明：本发明P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框在提高解淀粉芽胞杆菌的伊枯草菌素A产量方面具有重大应用价值。
实施例5：
P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框在提高地衣芽胞杆菌的杆菌肽发酵产量中的应用：
将血红蛋白表达载体pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL及pHY-P43-vhb-TamyL分别转化至地衣芽胞杆菌DW2，得到地衣芽胞杆菌DW2/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL和DW2/pHY-P43-vhb-TamyL。本实施例，针对不同的杆菌肽发酵培养基配方，考察了解地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL的生产杆菌肽的能力(同时也在这11种培养基中接种地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-P43-vhb-TamyL作为对照)，11组培养基配方具体如表6所示：
表6 不同的杆菌肽发酵培养基配方
配方编号
豆粕(g/L)
玉米淀粉(g/L)
CaCO<sub>3</sub>(g/L)
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(g/L)
1
80
30
4
0.5
2
60
30
4
0.5
3
100
30
4
0.5
4
80
15
4
0.5
5
80
45
4
0.5
6
80
30
2
0.5
7
80
30
6
0.5
8
80
30
8
0.5
9
80
30
4
0.25
10
80
30
4
0.75
11
80
30
4
1
种子培养的具体步骤：将地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL和对照菌株地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-P43-vhb-TamyL接种到添加1‰(v/v)Tet抗生素的LB液体培养基中，230r/min 37℃摇床培养12h；然后将活化的菌液以1％(v/v)接种量接种于50mL的LB液体培养基，同时添加1‰(v/v)Tet抗生素，230r/min 37℃摇床培养12h，获得发酵所需的种子培养液；
杆菌肽发酵的具体步骤：将表6中不同的杆菌肽发酵培养基装入500mL锥形瓶中(每瓶的装液量为70mL)，随后以2％(v/v)的接种量将种子培养液接种至对应的发酵培养基中，接种完毕后于230r/min 28℃摇床培养48h，收集发酵液用于杆菌肽产量检测。
杆菌肽产量检测的方法：采用高效液相色谱(HPLC)法检测样品。HPLC系统为Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱Hypersil BDS C18(5μm,4.6mm×250mm)，流动相为A:B＝35:65(A相：100mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300mL水中混合均匀；B相：520mL甲醇与40mL乙腈混合均匀)；进样量20μL；检测波长254nm；流速为1.0mL/min。根据此法计算出发酵后的菌液中杆菌肽的产量(具体数据见表7)。
表7 不同培养基配方发酵后的杆菌肽产量
由表7可看出，在相同种子发酵和不同生产发酵的条件下，相对于现有技术的对照菌株地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-P43-vhb-TamyL来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-P43-SPywbN-vhb-TamyL的杆菌肽产量大幅提升(至少提高23.40％)。说明：本发明的P43-SPywbN-vhb-TamyL表达框在提高地衣芽胞杆菌的杆菌肽产量方面具有重要应用价值。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1379
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
atgaaatgag cgatgaacaa aaaaagccag aacaaattca tagacgggac attttaaaat 360
ggggagcgat ggcgggggca gccgttgcga tcggtgccag cggtctcggc ggtctcgctc 420
cgcttgttca gactgcgatg ttagaccagc aaaccattaa catcatcaaa gccactgttc 480
ctgtattgaa ggagcatggc gttaccatta ccacgacttt ttataaaaac ttgtttgcca 540
aacaccctga agtacgtcct ttgtttgata tgggtcgcca agaatctttg gagcagccta 600
aggctttggc gatgacggta ttggcggcag cgcaaaacat tgaaaatttg ccagctattt 660
tgcctgcggt caaaaaaatt gcagtcaaac attgtcaagc aggcgtggca gcagcgcatt 720
atccgattgt cggtcaagaa ttgttgggtg cgattaaaga agtattgggc gatgccgcaa 780
ccgatgacat tttggacgcg tggggcaagg cttatggcgt gattgcagat gtgtttattc 840
aagtggaagc agatttgtac gctcaagcgg ttgaataaaa gagcagagag gacggatttc 900
ctgaaggaaa tccgtttttt tattttgccc gtcttataaa tttctttgat tacattttat 960
aattaatttt aacaaagtgt catcagccct caggaaggac ttgctgacag tttgaatcgc 1020
ataggtaagg cggggatgaa atggcaacgt tatctgatgt agcaaagaaa gcaaatgtgt 1080
cgaaaatgac ggtatcgcgg gtgatcaatc atcctgagac tgtgacggat gaattgaaaa 1140
agcttgttca ttccgcaatg aaggagctca attatatacc gaactatgca gcaagagcgc 1200
tcgttcaaaa cagaacacag gtcgtcaagc tgctcatact ggaagaaatg gatacaacag 1260
aaccttatta tatgaatctg ttaacgggaa tcagccgcga gctggaccgt catcattatg 1320
ctttgcagct tgtcacaagg aaatctctca atatcggcca gtgcgacggc attattgcg 1379
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaaga gaatgattca gatggggatc ataggggcta tgatgttccc ggaagccttt 60
tccgca 66
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgagaaaaa gtatcgtgcg ctattttgtt atggctttta ttctattatt tgcgttatcc 60
acattcctca ccggagtgca ggca 84
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttcatgct cgtgttcacg 60
atggcattca gcgattccgc t 81
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaacatca aaaacattgc taaaaaagcg tcagccttaa ccgttgctgc ggcactgctg 60
gccggaggtg cgccgcaaac ctttgca 87
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgaagaaaa agccattatt cagcacattc atgtgcgctg cactcatcgg ttcacttctc 60
gctccggctg ctgtgcaggc tgaaacaggc acgaca 96
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgctacgat cgcagcgaac gaagaaaaag agactaagaa aatgggtgaa atactcactg 60
tttttcattg ccttaatcct gacggcgacg gca 93
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgagaaaat ggtattttat tttatcagcg tgtattttag tttctgttat catcgctttt 60
gct 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgaaaaaaa gtttgtttct tttcgtgttc agtgtgtttt tgatggcgat tccagcattt 60
tcggcttcgg caaat 75
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgaaaaaaa tcgtgtctat cctatttatg ttcggtttgg ttatgggttt cagccagttt 60
cagccatcaa ccgtttttgc agctgac 87
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<212> DNA
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atgaagagaa aaatgatgat gttcggattg gcgctatcga tcattgcagg cggcgtggtc 60
gccgatggaa cggggaatgc agctcaagcg 90
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<212> DNA
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atgaaaaaac tgagcgagga aagcctcaag gacaatacgt ttgaccgccg ccgctttatt 60
caaggggccg gcaaaatagc cgggctttcg ctcggacttg cgatcgcgca atcgatgggg 120
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atgctgcaaa cggaaacggt tcatcatctt gcatatgtta acggggattt gcccggattt 60
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atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60
ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcg 117
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tctagaagct tgggcaaagc gtttt 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagatttcgt gatgcttgtc 20