具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(1)培养基

种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。

发酵培养基的成分包括：50g/L葡萄糖、50g/L甘油、50g/L大豆蛋白胨、0.6g/L磷酸二氢钾。

(2)MK-7萃取剂：异丙醇和正已烷混合物(1:2,V/V)

(3)HPLC检测MK-7产量：采用Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18分离柱(5μm，250×4.6mm)，检测的温度在40℃，流动相使用甲醇：二氯甲烷(9:1,v/v)，流速为1mL/min，检测波长254nm，进样量10μL。

(4)菌株生长情况检测：使用紫外-可见分光光度计定时测定发酵液的吸光光度值OD₆₀₀。

实施例1：重组枯草芽孢杆菌BSQ1、BSQ2的构建

分别将P43启动子通过cre/loxp系统整合在重组枯草芽孢杆菌BS20基因组上floA(yuaG)和floT(yqfB)的上游，构建重组枯草芽孢杆菌BSQ1和BSQ2，具体构建过程如下。

通过重叠延伸PCR，对以下序列进行片段扩增，P43-floA整合框所需的扩增序列为floA上游序列(长度1000bp，序列如SEQ ID NO.1)、氯霉素抗性基因zeo序列(1309bp，序列如SEQ ID NO.2)、P43启动子(0.3bp，序列如SEQ ID NO.3)和floA序列(996bp，序列如SEQID NO.4)。P43-floT整合框所需的扩增序列为floT上游序列(长度1000bp，序列如SEQ IDNO.5)、氯霉素抗性基因zeo序列(1309bp)、P43启动子(0.3bp)和floT序列(1000bp，序列如SEQ ID NO.6)。引物序列见表1，其中floA-P7C6-1R和floA-P43-1F为两个整合框的通用引物。通过融合PCR获得floA_up-lox71-zeo-lox66-p43-floA和floT_up-lox71-zeo-lox66-p43-floT融合表达框。

表1

将获得的融合表达框片段通过化学转化的方式整合至重组枯草芽孢杆菌BS20基因组中，整合片段的添加量约为1000ng。通过添加氯霉素抗性的LB固体培养基进行筛选、挑取单菌落进行PCR验证、测序验证，确认整合成功。

对整合成功的重组枯草芽孢杆菌进行氯霉素抗性的消除，通过化学转化的方式将Cre质粒转入构建好的重组枯草芽孢杆菌中，经添加卡纳抗生素的LB固体培养基筛选后，通过IPTG诱导Cre质粒的表达，消除抗性基因。Cre质粒的消除通过挑取单菌落接种到LB液体培养基中，50℃摇床培养12h消除。通过点板无抗、添加氯霉素抗生素、添加卡纳抗生素的LB平板进行筛选，挑选成功消除氯霉素抗性和Cre质粒的单菌落，最后得到分别整合P43-floA和P43-floT的重组枯草芽孢杆菌，命名为BSQ1和BSQ2。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌BSQ12的构建

在实施例1得到的BSQ1的基础上采用与实施例1类似的方法，将P43启动子整合在BSQ1基因组上floT的上游，构建重组枯草芽孢杆菌BSQ12。

将实施例1构建好的floT_up-lox71-zeo-lox66-p43-floT融合表达框通过化学转化的方式转入BSQ1中，经氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序、转入Cre质粒、卡纳抗性平板筛选、IPTG诱导表达、Cre质粒消除、点板验证，最后获得整合P43-floA和P43-floT表达框的重组枯草芽孢杆菌BSQ12。

实施例3：菌株发酵生产MK-7

(1)种子液制备

将重组枯草芽孢杆菌BS20、以及实施例1、2中构建的BSQ1、BSQ2、BSQ12挑取单菌落分别接种到15mL摇菌管中，每管含有2mL液体种子培养基，在37℃、220rpm条件下摇床培养10h。BS20作为对照，每株菌三个平行。

(2)发酵培养

将步骤(1)得到的种子液按照10％的接种量接种到250mL锥形瓶中，每瓶装有发酵培养基20mL，于41℃、220rpm条件下摇床培养3d，每隔24h取样进行OD₆₀₀的检测和样品的制备。具体方法如下。

每天取发酵液1.2mL。取20μL发酵液，用无菌水稀释50倍，摇晃均匀，进行OD₆₀₀的检测；取500μL发酵液加入到4倍体积的MK-7萃取剂中，涡旋振荡提取10min后，滤出提取液，8000r/min离心5min。收集上清液，HPLC检测全细胞组分MK-7的含量。检测结果见图1。发酵6天后，BSQ1菌株产量达到417.08mg/L，较BS20菌株提升了16.57％；BSQ2菌株在发酵前期MK-7含量略有增加，发酵后期产量明显降低；BSQ12菌株在发酵过程中MK-7含量均低于对照，后期下降幅度增大。结果表明强化FMMs脚手架蛋白合成基因floA、floT对MK-7产量的合成是有影响的，其中floA对MK-7的合成有一定的正向效果，达到了提升MK-7产量的效果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

agatcacatt tatatggcgc ctggcggaaa aatgggagcc gccgcgattg ttgatggcca 60

aggcaatgcc gctgaccaaa aagctcaatc actttggctg gcagagatgg aagatgccgc 120

agtgaaaaat aaccgcgatc caaaatatgc gctcgcaatg gctgacccag atatagatgc 180

caaggaagtt ggcgcgccta agggagatct gctgacactt aacgcagaca aggcgattga 240

ggtaggctat tcagaaggca ctgctgacaa tttgtccacg ctcgtaaaga agcttgggtt 300

cgaaaaggcg cagatcagct atgcaaagga gagctttgcg gaaaagacgg caagatggct 360

gacgaatccg gtcattgtcc ctattctgct gacaatcgct tttttaggtc tgacggtaga 420

gcttttttcc ccgggtgtcg gcctccctgg aacggctgga ctcattgcgt tattgctgtt 480

cttttacggg catcttgcag ccggccttgc cgggtatgag acggttctcc tctttatagc 540

aggggtgatt ctcattctgc ttgagatttt tcttcccgga ggaatcattg gattactggg 600

cttgggagcg attattgcga gcctgttttt agccgcgggg agcttcactg tcatggcggt 660

ttctctcttg atcgcctcag ctgtttcgat tacagctttt attttactga caagggtgtt 720

gggaaagcgt atgaaattct ttaagaaatt gatattaaat gattctacaa acacggagag 780

cggctacgtt tcaaatcaaa cgcgcacgga cttaatggga aaagtgggta taacctttac 840

accgctgcgt ccttccggta ccgtgattat tgatgatgaa cgccttgacg ttgtatcgga 900

gggatcgttt acagaaaaag ataaaaaagt aaaagtgata aaagtagaag gctcacgcat 960

tgtcgtgaga gaaatttaaa tagaaacgag gagaagttat 1000

<210> 2

<211> 1309

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg 60

tacccgggga tcctctagag attgtaccgt tcgtatagca tacattatac gaagttatgc 120

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gttatcatgc aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact 1080

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attaataggt acgaaaaagc aacttttttt gcgcttaaaa ccagtcatac caataaataa 1200

cttcgtatag catacattat acgaacggta gaatcgtcga cctgcaggca tgcaagcttg 1260

gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgtta 1309

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

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gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

<210> 4

<211> 996

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

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gctaacattg aactcacatt cgagcgctgt gctgccattg atcttgcagg ccgggacgtg 360

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tctcagacag tccttggaaa aggattggac tcaggaactg cgtttgaaat tctctcaatt 660

gatattgcag atgtagatat cggcaaaaac atcggggcaa ttttacaaac cgatcaggcc 720

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caagaacagg aaatgcgtgc ccgcgtagaa gaaatgcgcg cgaaagtagt agaagccgag 840

gcggaagtgc cgcttgcgat ggcagaagct ttgcgtgaag ggaatattgg cgtcatggat 900

tacatgaata tcaagaacat cgatgctgac acagaaatgc gtgattcatt cggcaagctg 960

acgaaagacc cttcggatga agaccgcaaa tcataa 996

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

ttggctgcct gaaataaaat catgcgcagg ctcaagatga ctcggggctt tccgtttatt 60

atttctgtcc tgtgctactt caagcggttt ttcttcaatt tctttaatcg gagcgtcctt 120

tacacgttcc ttcaacattt tttgtgcggt catatcgatt tttttcaaat ggtcaagaac 180

ttcccgtatg ctccattctt cagcagaagg cttttgattc agcttttcgt cagaaagtcc 240

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tttgtcttaa aattttgaaa cttttcccga ggtgtctcgt ataaatggta acggcagccg 420

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aaacaatgta tctttatacg cttattattg cgggcagcct tacgctgtta ttcctgtttt 540

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tctcattttt tacatgtttt tcagcgggcg gatatatagg tgaacttgta ttgcctctgt 660

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tggtcataga agggataggc gggaccattt caaagtcagc ggtcagtttt gataatcagc 900

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ctccgcatga acccatttaa cataaaagga ggaatttgat 1000

<210> 6

<211> 1000

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

atgacaatgc cgattataat gatcatcgga gttgtattct ttttattaat tgcactaata 60

gctgtgttta ttacgaagta tcgtacagca gggcctgatg aagcgttaat tgtaacaggg 120

agctatctgg gtaataaaaa tgttcatgtc gatgaaggcg gcaaccgtat taaaatcgtc 180

cgcggcggag gaacctttgt ccttcccgtc ttccagcagg cagagccgct aagcctatta 240

tcaagcaaac tcgatgtttc gacacctgaa gtctatacag aacaaggagt gccagtaatg 300

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ggccaccttc gttccattct cggctcaatg acagtagaag aaatctataa aaacagagaa 480

aaattctctc aagaggtgca gcgtgtcgct tcacaggatc tcgcgaaaat gggacttgta 540

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gaaacccgaa ttaagcgggc agaagccgat aaagacgcaa aaaaatcaga acttgaacgg 720

gcgacggaaa tcgctgaagc tgaaaaaatc aatcagctca aaatggctga attccgcaga 780

gaacaagata cggcaaaagc gaatgccgac caagcatatg atttagagac tgcccgagcg 840

cgccagcaag tcacagagca ggaaatgcag gttaaaatta tcgaacgcca aaaacaaata 900

gaactagaag aaaaagaaat tcttcgccgt gaacgtcaat acgactcaga ggtaaagaaa 960

aaagccgatg cagaccgtta ttctgttgag cagtccgcag 1000