阅读说明：本技术 一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用 (Expression vector suitable for bacillus subtilis secretion expression protein and application ) 是由 饶志明 李谞 张显 朱曼迟 杨套伟 徐美娟 邵明龙 杜宇轩 贾以泽 王嘉轩 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用,属于基因工程和生物技术领域。该分泌载体是将编码信号肽SP<Sub>phoD</Sub>的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和编码分子伴侣PrsA的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3)分别连接到pMA5-P43上构建分泌质粒pMA5-SPP。以pMA5-SPP为载体,在枯草芽孢杆菌中表达L-天冬酰胺酶,其胞外分泌量占总表达量的38％,胞外分泌量是常见信号肽SP<Sub>pel</Sub>介导下分泌量的2.95倍。(The invention discloses an expression vector suitable for bacillus subtilis to secrete expression protein and application thereof, belonging to the field of genetic engineering and biotechnology. The secretion carrier is a polypeptide which encodes a signal peptide SP phoD The gene (the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1) and the gene (the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.3) for coding the molecular chaperone PrsA are respectively connected to pMA5-P43 to construct a secretion plasmid pMA 5-SPP. pMA5-SPP is used as a vector to express L-asparaginase in bacillus subtilis, the extracellular secretion amount accounts for 38 percent of the total expression amount, and the extracellular secretion amount is common signal peptide SP pel 2.95 times of the amount secreted under mediation.)

一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用

技术领域

本发明涉及一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用，属于基因工程和生物技术领域。

背景技术

在利用微生物进行表达重组蛋白的过程中，良好的分泌性能降低产品回收成本，是重组蛋白能否进行工业生产的重要考量因素。信号肽是分泌蛋白N端的一段能介导蛋白分泌到胞外的肽链，对蛋白的分泌表达具有重要意义。分子伴侣在细胞中能识别并结合到不完整折叠或装配的蛋白，帮助这些蛋白进行折叠、分泌(Molecular microbiology,2010,8(4):727-37；Microbial cell factories,2015,14,92)。因此，在构建蛋白的分泌表达载体中，选择合适的信号肽及分子伴侣具有重要的意义。

枯草芽孢杆菌由于缺少细胞外膜而具有良好的分泌能力，是分泌生物制品的理想宿主。同时，枯草芽孢杆菌还具有食品安全性、基因信息清楚良好的生产技术和发酵基础等特性，因此被广泛应用于蛋白、食品添加剂、抗生素的生物发酵制备当中(Trends inbiotechnology,1992,10(7):247-56；Journal of clinical microbiology,1998,36(1):325-6；Nature,1997,390(6657):249-56.)。

以枯草芽孢杆菌为宿主菌分泌表达外源蛋白的过程中，构建含有有效的信号肽及分子伴侣的载体对蛋白的分泌具有重要意义。目前没有同时在载体上构建信号肽SP_phoD基因及分子伴侣PrsA基因以提高枯草芽孢杆菌蛋白的分泌水平的文献报道。

L-天冬酰胺酶胞外分泌的相关报道相对较少，有研究表明，以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，表达B.subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶，胞外酶活占总酶活的57.1％(JournalOf Agricultural And Food Chemistry,2013,61(39):9428-9434)，但重组酶酶活只有9.98U/mL。以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，表达Pyrococcus yayanosii来源的L-天冬酰胺酶，胞外、胞内酶活分别为23.31U/mL、65.72U/mL(Scientific Reports,2018,8(1):7915)，酶活水平有限。

因此，提供一种进一步提高L-天冬酰胺酶胞外分泌水平的方法，对于工业制备L-天冬酰胺酶有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌表达载体，是将编码信号肽SPphoD的基因和编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43上，得到表达载体pMA5-SPP；所述信号肽SPphoD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子伴侣PrsA的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。在本发明的一种实施方式中，将所述编码信号肽SPphoD的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点EcoR V和Kpn I之间，在P43启动子的介导下表达，并将所述编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点BamH I和Mlu I之间，在PpHpaII启动子的介导下表达。

所述pMA5-P43质粒是利用酶切连接将启动子P43连接到pMA5载体上得到的。

所述pMA5-P43质粒的构建方法具体是以正向引物F(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和反向引物R(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168基因组中扩增出启动子P43；用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切载体pMA5；利用同源重组试剂盒(MultiS One-Step Cloning Kit，诺唯赞)将启动子P43连接到pMA5的多克隆位点EcoR I和Hind III之间，得到重组质粒pMA5-P43。

在本发明的一种实施方式中，所述编码信号肽SPphoD的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码分子伴侣PrsA的基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供一种基因工程菌，以上述表达载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的L-天冬酰胺酶。

在本发明的一种实施方式中，编码所述L-天冬酰胺酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.14所示。

本发明的第三个目的是提供上述基因工程菌的制备方法，是将编码L-天冬酰胺酶的基因连接到pMA5-SPP的限制性酶切位点Kpn I和Hind III之间，得到重组质粒，将该重组质粒转化到枯草芽孢杆菌168中，即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供一种制备L-天冬酰胺酶的方法，是将上述基因工程菌接种于LB培养基中，35-39℃，200-220rpm，培养8-12h，按0.5-5％的接种量转接于新的LB培养基中，35-39℃培养20-30h，取发酵液离心，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液。

本发明的第五个目的是提供上述枯草芽孢杆菌表达载体在制备内源蛋白或外源蛋白中的应用。

本发明通过利用信号肽SPphoD介导蛋白分泌，并共表达分子伴侣PrsA协助蛋白转运出细胞膜，使用L-天冬酰胺酶胞外分泌量达到总表达量的38％，与用常见信号肽SPpel介导分泌表达相比，本发明提供的方法使L-天冬酰胺酶胞外分泌量提高了2.95倍。

具体实施方式

实施例1 表达载体pMA5-SPP的构建

(1)SP_phoD及PrsA基因的扩增：以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，分别以F1primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和R1 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、F2 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)和R2 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)为引物，分别克隆SP_phoD和PrsA基因。

(2)在载体pMA5-P₄₃的基础上，利用同源重组试剂盒(MultiS One-Step Cloning Kit，诺唯赞)将信号肽SP_phoD基因连接到其多克隆位点EcoR V和Kpn I之间，并将分子伴侣PrsA基因连接到其多克隆位点BamH I和Mlu I之间，构建出有利于蛋白分泌的表达载体pMA5-SPP。

实施例2 L-天冬酰胺酶分泌表达菌株的构建

以质粒pMA5-pyasnase(构建方法见文献：Xu L,Xian Z,Shuqin X,etal.Simultaneous cell disruption and semi-quantitative activity assays forhigh-throughput screening of thermostable L-asparaginases[J].ScientificReports,2018,8(1):7915.)为模板，以F3 primer(核苷酸SEQ ID NO.9所示)和R4 primer(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)为引物，扩增编码L-天冬酰胺酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，并用同源重组试剂盒(MultiS One-Step Cloning Kit)将基因连接到pMA5-SPP的限制性酶切位点Kpn I和Hind III之间，得到重组质粒。将得到的重组质粒化学法转化入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，即构建得到L-天冬酰胺酶分泌表达菌株B.subtilis/pMA5-SPP-pyasnase

实施例3 B.subtilis/pMA5-SPP-pyasnase分泌性测定

(1)将实施例2得到的重组菌B.subtilis/pMA5-SPP-pyasnase与仅由常见SPpel介导的L-天冬酰胺酶表达菌株(构建方法同实施例1和2，引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示)分别接种于10mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按0.5％的接种量转接于100mL LB培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心10min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。

(2)L-天冬酰胺酶的酶活测定。

反应体系：100μL适当稀释后的酶液、800μL 25mmol·L^-1L-天冬酰胺溶液(用50mmol·L^-1、pH 8Tris-HCl缓冲液溶解L-天冬酰胺)，在40℃水浴中反应15min，加入100μL质量体积百分浓度为15％(w/v)的三氯乙酸溶液(TCA)终止反应。对照组在酶反应即水浴前加入100μL质量体积百分浓度为15％的TCA提前终止酶促反应。反应后在10000g转速下常温离心10min，显色反应体系为：200μL离心上清液、4.8mL ddH₂O、200μL奈斯勒试剂，混匀后室温静置10-15min，于450nm波长处读取吸光度。同条件下。用不同浓度的氯化铵进行显色反应，绘制氨浓度标准曲线。L-天冬酰胺酶酶活通过测定酶促反应所生成氨的量来计算。

酶活单位：在一定条件下，每分钟内产生1μmol氨气所需的酶量为1个酶活单位。

在表达载体pMA5-SPP介导下L-天冬酰胺酶胞内、胞外酶活分别为105.4U/mL、40.12U/mL，酶蛋白分泌量占总表达量的38％，并且胞外分泌量是常见信号肽SP_pel介导下的2.95倍。

对比例1

将编码信号肽SPphoD的基因和编码分子伴侣DnaK(氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示)的基因连接到载体pMA5-P43上，得到表达载体pMA5-SPD。将实施例中的pMA5-SPP替换为pMA5-SPD，其余同实施例中一致。结果显示，以pMA5-SPD为表达载体，表达后的L-天冬酰胺酶胞外酶活与常见SPpel介导的L-天冬酰胺酶表达菌株表达的胞外酶活相比，无显著性差异。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

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<213> Bacillus subtilis

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<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

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