阅读说明：本技术 一种提高转基因效率的鸡胚背主动脉注射方法 (Chick embryo dorsal aorta injection method for improving transgenic efficiency ) 是由 郑喜邦 李恭贺 李非 韦金鱼 韦茏芹 徐小明 邢青波 刘灵康 韦宗海 苏立燧 唐 于 2020-03-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高转基因效率的鸡胚背主动脉注射方法,包括对发育2.5天的鸡胚进行壳外背主动脉注射腺相关病毒颗粒,注射后的鸡胚转入受体蛋(双黄蛋)壳中继续孵化出壳。本发明通过改良的背主动脉注射方法实现了对鸡胚背主动脉的壳外注射,提高了注射的准确率,也实现了对鸡胚发育过程的直视观察,其胚存活率、孵化率和转基因表达效率明显高于胚盘下腔注射组和传统背主动脉注射组,提高了转基因鸡胚孵化率和EGFP阳性检出率。(The invention discloses a chicken embryo dorsal aorta injection method for improving transgenic efficiency, which comprises the steps of injecting adeno-associated virus particles into the dorsal aorta of a chicken embryo which grows for 2.5 days, transferring the injected chicken embryo into a recipient egg (double-yolk egg) shell, and continuously hatching the egg shell. According to the invention, the extracapsid injection of the chick embryo dorsal aorta is realized through the improved dorsal aorta injection method, the injection accuracy is improved, the direct-view observation of the development process of the chick embryo is also realized, the embryo survival rate, the hatching rate and the transgene expression efficiency are obviously higher than those of a blastoderm inferior cavity injection group and a traditional dorsal aorta injection group, and the transgenic chick embryo hatching rate and the EGFP positive detection rate are improved.)

一种提高转基因效率的鸡胚背主动脉注射方法

技术领域

本发明涉及转基因生物技术领域，尤其涉及一种提高转基因效率的鸡胚背主动脉注射方法。

背景技术

自20世纪80年代以来，禽类转基因是生物技术领域研究的热点之一。在提高家禽产肉产蛋率、提高抗病能力、建立生物反应器模型等方面，家禽转基因具有重要的应用价值。相比于哺乳动物生物反应器，禽类输卵管生物反应器具有孵化时间短(平均为3周)，世代间隔短(平均为20周)，繁殖速度快，生产成本低，产量高等诸多优点。

转基因鸡生产在技术上具有挑战性，因为鸡的卵子与卵黄紧密连接，不能像哺乳动物那样进行胚胎体外培养并通过核移植技术产生转基因鸡。直到1988年，Perry开发了鸡胚培养体系(System I-Ⅲ)。目前常用System Ⅱ和System Ⅲ换壳培养方法。在System Ⅱ阶段，将来自新鲜受精蛋的供体全胚转移到受体(比供体重约3-5g) 蛋壳中；在System Ⅲ阶段，将培养2.5天的鸡胚转移到更大的受体 (比供体重30-40g)蛋壳中，继续培养至出壳。虽然胚盘下腔注射法技术简单，但注射后的鸡胚需要两次换壳，对鸡胚造成机械性损伤，鸡胚存活率低。

传统背主动脉注射法就是通过蛋壳钝端开窗，将外源基因注射到 HH14-16期鸡胚背主动脉中，封闭窗口，继续孵化出壳。传统背主动脉注射法的优点是不需要换壳培养，缺点是壳内注射精准度低，转基因效率也随之下降，也不能对转基因鸡胚发育过程进行直视观察。因此，传统背主动脉注射方法有待改进。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有问题而提出的一种提高转基因效率的鸡胚背主动脉注射方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种提高转基因效率的鸡胚背主动脉注射方法，包括以下步骤：

A将新产受精蛋置于孵化箱，在温度37.8℃，相对湿度60％的环境下培养2.5天；

B对所述受精蛋的鸡胚全胚轻缓倒入称量盘中；

C对所述鸡胚进行背主动脉注射病毒颗粒；

D所述受体蛋选用双黄蛋，开窗前对受体蛋进行消毒，钝端开窗后弃去内容物；

E.注射后的所述鸡胚全胚转移至所述受体蛋壳内，用保鲜膜封闭所述受体蛋壳窗口并将窗口朝上，放入孵化箱继续培养至出壳。

具体地，所述消毒方法包括；用0.01％苯扎溴铵溶液清洗受精蛋与受体蛋壳外表面，再用75％酒精喷洒消毒。

进一步地，所述受体蛋进行开窗的方法，包括在受体蛋壳的钝端开窗，直径为40mm。

具体地，所述背主动脉注射的方法包括在体视显微镜下，通过显微注射针注射2μl的病毒颗粒至鸡胚背主动脉中。

进一步地，所述封口膜采用Handi-Wrap保鲜膜。

具体地，所述受精蛋和受体蛋均来自同一物种。

进一步地，选用双黄蛋作为受体，比相对应受精蛋重30-40g。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过改良的背主动脉注射方法实现了对鸡胚的壳外注射，提高了注射的准确率，注射后的鸡胚转入代用蛋壳(双黄蛋)培养至孵化出壳，也实现了对鸡胚发育过程的直视观察，其胚存活率、孵化率和转基因表达效率明显高于胚盘下腔注射组和传统背主动脉注射组，提高了转基因鸡胚孵化率和EGFP阳性检出率。

附图说明

图1为本发明提出的改良背主动脉注射及换壳操作过程图；

图2为本发明提出不同注射方法对鸡胚存活率的影响柱状图；

图3为本发明提出不同注射方法对鸡胚孵化率的影响柱状图；

图4为本发明提出不同注射方法对鸡胚EGFP表达效率的影响柱状图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本试验所用受精蛋及非受精蛋(system Ⅱ待用受体)采购于广西南宁富凤农牧有限责任公司，双黄蛋(system Ⅲ待用受体)购自南宁良凤农牧有限责任公司，注射用AAV病毒颗粒(HBAAV-CMV-EGFP) 购自上海汉恒生物科技有限公司，滴度为1X10^8TU/ML。

试验组分别为Ⅹ期鸡胚胚盘下腔注射组(以下简称胚盘下腔注射组)、HH14-16期鸡胚背主动脉注射组(以下简称传统背主动脉注射组)，HH14-16期鸡胚改良背主动脉注射组(以下简称改良背主动脉注射组)。各试验组每次均注射30枚受精蛋，进行5次独立试验，各组共注射150枚受精蛋。空白对照组不做任何处理，每次入孵12 枚受精蛋，总共入孵60枚受精蛋。

鸡胚孵化期间，每天观察鸡胚发育情况，记录鸡胚存活率。鸡胚孵化出壳后，统计孵化率。对新鲜死亡的雏鸡或引颈处死后的雏鸡，用荧光蛋白手电筒照射观察雏鸡体表和内脏组织是否有绿色荧光蛋白(EGFP)表达，并统计EGFP阳性率。

胚盘下腔注射法：采用新产受精蛋作为供体，选择比供体重3-5g 的非受精蛋作为System Ⅱ受体，称重并逐一配对，用0.01％苯扎溴铵溶液清洗受精蛋与受体蛋壳外表面，再用75％酒精喷洒消毒。用微型电磨机在受体蛋尖端切开直径为32mm窗口，弃去内容物，蒸馏水冲洗内、外表面。受体蛋窗口朝下，放置在一个内衬湿润纱布的陶瓷盘里。在超净工作台内轻轻敲破受精蛋壳，将全胚移入System Ⅱ受体蛋壳中，使胚盘上浮，用口吸管连接显微注射针，在体视显微镜下，借助冷光源照射，将2μl EGFP-AAV病毒注射至胚盘下腔，SaranWrap 保鲜膜(5cm×5cm)封闭蛋壳窗口，窗口朝下，放入鸡胚培养箱中，在温度为37.8℃，相对湿度为60％的条件下，培养2.5天。对于存活鸡胚，选择比相应供体重30-40g双黄蛋作为System Ⅲ受体。受体蛋壳的处理方法同System Ⅱ，不同之处就是在受体蛋壳的钝端开窗，直径为40mm。将存活鸡胚转移到System Ⅲ受体蛋壳中， Handi-Wrap保鲜膜封闭窗口，窗口朝上，放入培养箱，继续培养至出雏。

传统背主动脉注射法：将新产受精蛋置于孵化箱孵化，孵化约2.5 天后，将受精蛋钝端朝上，水平静置1～2h。使用照蛋器确定气室位置，并用铅笔标记。75％酒精棉擦拭蛋壳，用镊子在铅笔标识区域中央开一个直径为1-1.5cm窗口，壳膜表面滴加少许灭菌生理盐水，撕破壳膜，口吸管连接显微注射针，将2μl EGFP-AAV病毒液注射至鸡胚背主动脉中。使用封口膜(Parafilm)封闭窗口。窗口朝上，继续培养，直至出雏。

如图1所示，为改良背主动脉注射及换壳操作过程图；改良背主动脉注射法采用新产受精蛋用作供体，称量并记录重量，将其放入温度设置为37.8℃，相对湿度为60％的培养箱中。对发育至HH14-16 期(约2.5天)鸡胚，选用比相应供体重30-40g双黄蛋作为受体。受体蛋壳的处理方法同胚盘下腔注射法System Ⅲ。用75％的酒精擦拭供体蛋壳表面，在超净台内轻轻敲破蛋壳，将全胚倒入一次性称量盘中，鸡胚朝上，口吸管连接显微注射针，在体视显微镜下，2μl EGFP -AAV病毒注射至鸡胚背主动脉中。将注射后的鸡胚移入受体蛋壳内， Handi-Wrap保鲜膜封闭窗口，窗口朝上放入培养箱，继续培养至出雏。

计算培养至第8、14、18和21天转基因鸡胚存活率和14天至出壳后EGFP阳性检出率。采用SPSS22.0软件单因素方差分析方法，分析不同试验组间的差异显著性。P<0.05，表示差异显著；P<0.01，标示差异极显著。

结果

如图2与表1所示，鸡胚发育至8天时，胚盘下腔注射组与传统背主动脉注射组的鸡胚存活率无显著差异(P>0.05)。然而，改良背主动脉注射组鸡胚存活率高于传统背主动脉注射组，差异显著 (P<0.01)。随着时间推移，鸡胚存活率总体呈现下降趋势。但是，当鸡胚胎发育至14天、18天和21天时，改良背主动脉注射组的存活率明显高于胚盘下腔注射组(P<0.05或P<0.01)和传统背主动脉注射组(P<0.01)。

表1.三种注射方法对鸡胚存活率的影响

如图3与表2所示，改良背主动脉注射组转基因鸡胚孵化率(37％) 显著高于胚盘下腔注射组(26％)和传统背主动脉注射组(16％) (P<0.01)。

表2.三种注射方法对鸡胚孵化率的影响

对新鲜死亡或引颈处死后的雏鸡，用荧光蛋白手电筒及其适配滤光镜，观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果显示,EGFP多在心脏、胆囊、胸骨、皮肤、喙等部位表达；改良背主动脉注射组鸡胚GFP阳性率明显高于胚盘下腔注射组与传统背主动脉注射组(图4，表3) (P<0.01)。

表3.三种注射方法对鸡胚EGFP表达效率的影响

在本试验中，胚胎从System Ⅱ至System Ⅲ阶段胚胎存活率逐渐下降的原因之一，可能是由于胚胎换壳操作而引起的胚胎损伤所致。另外，胚盘下腔注射和背主动脉注射也对胚胎造成机械性损伤，这也是造成胚胎死亡的原因。本试验中改良背主动脉注射组转基因鸡胚孵化率高于传统背主动脉注射组，是因为前者只需要1次换壳培养操作，对鸡胚造成的机械性损伤小于后者。

在不同发育时期进行显微注射，可能会直接影响后续胚胎存活率和外源基因的表达效率。作为精子和卵子的前体细胞，原始生殖细胞(primorldial germ cells,PGCs)被认为是制备转基因鸡较为理想的靶细胞，通过体内转染或转导PGCs，就有希望获得转基因鸡。新产受精蛋已经处于鸡胚发育HH 10期，位于胚盘和卵黄之间的胚盘下腔内已经有5-6万个胚胎细胞，但其中只有40个PGCs；在HH 14-16 期(约2.5日龄)，当血岛和血管形成时，PGCs进入血液循环，其数量增加至100-200个。这也是本试验改良背主动脉注射组转基因鸡胚EGFP阳性率高于胚盘下腔注射组的原因。相对于传统背主动脉注射法，改良背主动脉注射法实现了壳外背主动脉注射，提高了注射的准确度，进而提高了转基因鸡胚胎组织EGFP阳性率。

种族亲缘关系的远近(种族发生间隔)也是影响孵化率的另一个因素。从鸡、火鸡、珍珠鸡和鸭蛋分离稀蛋清作为受体蛋清，鸡蛋壳作为System Ⅲ阶段受体，鸡胚在这些不同受体蛋清和相同受体蛋壳中的孵化率分别为60.4％、55.3％、47.9％和19.1％，证明了鸡胚在鸡蛋清和鸡蛋壳中的孵化率最高。因此，选用亲缘关系较近的禽蛋作为受体进行换壳培养，就可以减少鸡胚死亡率。在本试验的System Ⅱ至System Ⅲ阶段，均采用鸡蛋清和鸡蛋壳作为受体，规避了上述风险，在一定程度上降低了鸡胚死亡率。

禽类胚胎在发育过程中高度依赖蛋壳，蛋壳不但可以保护胚胎免受物理应激和微生物感染，还能调节水分和提供矿物质。受体蛋壳的厚度、封口膜材质影响孵化率。通过受体蛋壳改善氧气供应是胚胎体外培养的重要因素，不同受体蛋壳会造成不同孵化率。本试验中，改良背主动脉注射组和胚盘下腔注射组均采用鸡双黄蛋为System Ⅲ受体，尽管有显微注射操作造成的机械性损伤，改良背主动脉注射组和胚盘下腔注射组转基因鸡胚孵化率分别达到37％和26％。在System Ⅲ阶段，受体窗口封闭时，相对于Saran Wrap膜，Handi-Wrap膜封口后的孵化率提高了30％。

总而言之，改良背主动脉注射法，实现了对鸡胚的壳外背主动脉注射和对鸡胚发育过程的直视观察，提高了注射的准确率，进而提高了转基因鸡胚孵化率和转基因表达效率。

本试验采用壳外背主动脉注射与System Ⅲ换壳培养相结合，对传统背主动脉注射法进行了改良，提高了注射的准确度，提高了转基因鸡胚存活率、孵化率和转基因表达效率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。