阅读说明：本技术 脑组织特异性pltp过表达模型构建方法及测定方法 (Method for constructing brain tissue specificity PLTP overexpression model and determination method ) 是由 王浩 王文芝 陈莹 李明伟 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于PLTP过表达模型构建技术领域,公开了一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法及测定方法,10月龄3×Tg-AD雄鼠,随机分为模型组,实验组,以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J作为对照组；AD模型注射携带PLTP基因增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒AAV-PLTP-EGFP,诱导PLTP的高表达；对照组与模型组均注射不携带PLTP基因只携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒AAV-EGFP。本发明的PLTP过表达可改善3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力、对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的改善；通过促进GSK-3β失活进而减少Aβ产生和Tau蛋白磷酸化有关。(The invention belongs to the technical field of PLTP overexpression model construction, and discloses a method for constructing a brain tissue specificity PLTP overexpression model and a determination method, wherein a 10-month-old 3 x Tg-AD male mouse is randomly divided into a model group and an experimental group, and male C57BL/6J with the same genetic background at the same month age is used as a control group; injecting adeno-associated virus AAV-PLTP-EGFP carrying PLTP gene enhanced green fluorescent protein reporter gene into the AD model to induce high expression of PLTP; both the control group and the model group are injected with adeno-associated virus AAV-EGFP which does not carry PLTP gene and only carries enhanced green fluorescent protein reporter gene. The PLTP overexpression can improve the learning and memory ability of a 3 × Tg-AD mouse and improve the learning and memory ability of the 3 × Tg-AD mouse; the reduction of A beta production by promoting GSK-3 beta inactivation is related to Tau protein phosphorylation.)

脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法及测定方法

技术领域

本发明属于PLTP过表达模型构建技术领域，尤其涉及一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法及测定方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是中枢神经系统退行性疾病，是痴呆最常见的类型。目前对于AD的研究国内外学者广泛关注，提出了多个致病机制学说，并研制出了有一定治疗效果的针对性药物，但其发病机制仍未完全阐明，尚缺少有效的治疗药物。磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)是一种广泛表达于中枢神经系统的糖蛋白，近年，体内、外研究发现，PLTP与AD密切相关。PLTP缺乏可促进老年小鼠认知功能的下降，那么PLTP高表达是否对AD具有改善作用，国内外研究还未见报道。多种方式可用于研究PLTP过表达对AD的影响，如给与重组的PLTP蛋白，但重组的蛋白价格昂贵，而且动物给药还要考虑药物是否能被吸收进入机体，能否透过血脑屏障进入脑组织发挥作用等，因此利用病毒作为载体，脑定位注射后，诱导PLTP基因高表达，进而引起PLTP蛋白表达上调是较为理想的技术，利用这种技术，再结合APP/PS1/Tau三转基因的AD小鼠，可以整体水平明确PLTP高表达对AD的保护作用。AD虽然是危害人类的重要疾病，但目前还未有完全能模拟人类AD的动物模型，这给AD机制及药物开发的研究带来了困难。而APP/PS1/Tau三转基因的AD小鼠目前是众多模型中相对较好的一种AD的模型，通过此模型对PLTP高表达的AD保护作用研究，能更加确证PLTP的抗AD作用。另外，Aβ与Tau都是AD发病过程中的关键分子，而PLTP高表达对两种分子都具有调控作用，也说明其有望成为临床抗AD的成分或靶点之一。而通过病毒介导的基因治疗在肿瘤治疗中已有应用，也时通过病毒介导基因表达的AD治疗具有一定可能性。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：PLTP缺乏可促进老年小鼠认知功能的下降，PLTP高表达是否对AD具有改善作用，国内外研究还未见报道。

解决以上问题及缺陷的难度为：侧脑室定位注射，腺相关病毒PLTP高表达基因的构建。

解决以上问题及缺陷的意义为：为临床以PLTP为靶点的AD治疗提供依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法及测定方法。

本发明是这样实现的，一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法，所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法包括：

第一步，以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，10月龄3×Tg-AD雄鼠，随机分为模型组，实验组，以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J作为对照组；

第二步，AD模型注射携带PLTP基因增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒AAV-PLTP-EGFP，诱导PLTP的高表达；

第三步，对照组与模型组均注射不携带PLTP基因只携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒AAV-EGFP。

进一步，所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法10月龄3×Tg-AD雄鼠24只，随机分为模型组12只，实验组12只。

进一步，所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J作为对照组12只。

本发明的另一目的在于提供一种由所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法构建的脑组织特异性PLTP过表达模型。

本发明的另一目的在于提供一种所述脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法，所述脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法包括：

第一步，以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，构建脑组织特异性PLTP过表达模型；诱导PLTP基因的高表达。

第二步，观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响；AD主要的临床表现就是认知功能下降，水迷宫等方法可检测动物的认知功能评价PLTP高表达的抗AD作用。

第三步，病理学观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠的保护作用；老年斑和神经纤维缠结时AD特征性的病理学改变，因此病理学观察可以确证PLTP高表达的抗AD作用。

第四步，观察PLTP过表达对Aβ及其生成相关蛋白的影响；Aβ与Tau是AD发病的关键分子，通过两个通路蛋白的检测，明确PLTP改善AD的可能通路。

第五步，观察PLTP过表达对总Tau蛋白及其pTau蛋白的影响；Aβ与Tau是AD发病的关键分子，通过两个通路蛋白的检测，明确PLTP改善AD的可能通路。

第六步，观察PLTP过表达对GSK-3β及GSK-3β的影响；采用western blot检测GSK-3β及GSK-3β的蛋白表达水平。GSK3β既可以调控Aβ，也可以调控Tau，有文献报道PLTP可调控GSK3β的活性，通过对GSK3β的检测明确PLTP抗AD作用的机制。

进一步，所述第二步观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响；小鼠侧脑室注射AAV-PLTP-EGFP病毒2周后，水迷宫实验与穿梭被动回避实验检测小鼠的学习记忆能力；水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分，以小鼠寻找平台的潜伏期、进入平台的次数为指标评价认知功能；穿梭被动回避实验在明暗穿梭箱中进行，以小鼠进入暗箱的潜伏期及在暗箱中的停留时间为指标，评价学习记忆能力。

进一步，所述第三步病理学观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠的保护作用；通过HE染色与尼氏染色检测各组病理学损伤，通过Aβ₁-42免疫组化染色观察各组老年斑SP的变化，通过Bielschowsky银染观察各组神经纤维缠结NFT的变化。

进一步，所述第四步观察PLTP过表达对Aβ及其生成相关蛋白的影响；行为学实验后，处死小鼠，分离小鼠大脑皮质及海马，制备其组织匀浆，采用蛋白免疫印迹技术检测与Aβ生成相关蛋白APP、PS1、BACE1的表达水平；ELISA法检测Aβ₁-40及Aβ₁-42水平。

进一步，所述第五步观察PLTP过表达对总Tau蛋白及其pTau蛋白的影响；采用western blot检测大脑皮质及海马总Tau蛋白及pTau蛋白在pSer199、pSer214、pThr231、pSer404四个磷酸化位点的蛋白的表达。

进一步，所述脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法的数据用SPSS16.0软件进行统计，多组样本间比较采用单因素方差分析ANOVO，P<0.05时具有统计学差异。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明以3×Tg-AD(即APPSwe/PS1dE91/TauP301L三重转基因)小鼠作为AD模型，以腺病毒介导PLTP基因侧脑室内转染构建脑组织特异性PLTP过表达模型，采用水迷宫、穿梭被动回避实验、病理学染色、western blot等技术和方法，通过学习记忆能力、老年斑、Aβ相关蛋白、总Tau蛋白、pTau蛋白、GSK-3β通路相关蛋白的检测，探讨PLTP过表达对AD的防治作用及可能机制，以期为通过PLTP寻找AD治疗的新靶点、新思路提供重要依据。

本发明的PLTP过表达可改善3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力；PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的改善，可能通过促进GSK-3β失活进而减少Aβ产生和Tau蛋白磷酸化有关。本发明说明PLTP高表达能明显改善AD小鼠学习能力，其机制可能与调控GSK3B表达，进而影响Aβ和磷酸化tau的形成，进而产生抗AD作用，有望成为AD治疗的新靶点，而通过病毒介导PLTP基因高表达可能成为一种新的方法。

附图说明

图1是本发明实施例提供的脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法流程图。

图3是本发明实施例提供的PLTP在各组小鼠大脑皮质及海马的表达(n＝4,#P<0.05，##P<0.01vs.WT；*P<0.05，**P<0.01vs.3×Tg-AD)示意图；

图中：A：PLTP蛋白条带在模型和3×Tg-AD小鼠海马和皮质内的表达；,B：PLTP在模型和3×Tg-AD小鼠海马和皮质内的表达。

图4是本发明实施例提供的PLTP过表达能改善3×Tg-AD小鼠学习记忆能力(n＝12，#P<0.05，##P<0.01vs.WT；*P<0.05，**P<0.01vs.3×Tg-AD)示意图；

图中：A：水迷宫定位航行实验小鼠逃避潜伏期；B：定位航行实验小鼠运行轨迹；C：水迷宫空间探索实验60秒穿越平台次数及小鼠进入平台所在区域的潜伏期；D：穿梭被动回避实验小鼠进入暗箱的潜伏期及暗箱停留时间。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法及测定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法包括以下步骤：

S101：以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，10月龄3×Tg-AD雄鼠24只，随机分为模型组(12只)，实验组(12只)，以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J(Wild Type,WT)作为对照组(12只)。

S102：AD模型注射携带PLTP基因增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒(AAV-PLTP-EGFP)，诱导PLTP的高表达。

S103：对照组与模型组均注射不携带PLTP基因只携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒(AAV-EGFP)。

如图2所示，本发明实施例提供的脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法包括以下步骤：

S201：以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，构建脑组织特异性PLTP过表达模型。

S202：观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响。

S203：病理学观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠的保护作用。

S204：观察PLTP过表达对Aβ及其生成相关蛋白的影响。

S205：观察PLTP过表达对总Tau蛋白及其pTau蛋白的影响。

S206：观察PLTP过表达对GSK-3β及GSK-3β(pSer9)的影响；采用western blot检测GSK-3β及GSK-3β(pSer9)的蛋白表达水平。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

一、方法

1、以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，构建脑组织特异性PLTP过表达模型；10月龄3×Tg-AD雄鼠24只，随机分为模型组(12只)，实验组(12只)，以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J(Wild Type,WT)作为对照组(12只)。侧脑室(自前囟向后0.6mm矢状缝旁开1.2mm处)注射携带PLTP基因增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒(AAV-PLTP-EGFP)，诱导PLTP的高表达。对照组与模型组均注射不携带PLTP基因只携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒(AAV-EGFP)。

2、观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响；小鼠侧脑室注射AAV-PLTP-EGFP病毒2周后，水迷宫实验与穿梭被动回避实验检测小鼠的学习记忆能力。水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分，以小鼠寻找平台的潜伏期、进入平台的次数为指标评价其认知功能。穿梭被动回避实验在明暗穿梭箱中进行，以小鼠进入暗箱的潜伏期及在暗箱中的停留时间为指标，评价其学习记忆能力。

3、病理学观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠的保护作用；通过HE染色与尼氏染色检测各组病理学损伤，通过Aβ₁-42免疫组化染色观察各组老年斑(senile plaques,SP)的变化，通过Bielschowsky银染观察各组神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)的变化。

4、观察PLTP过表达对Aβ及其生成相关蛋白的影响；行为学实验后，处死小鼠，分离小鼠大脑皮质及海马，制备其组织匀浆，采用蛋白免疫印迹技术(western blot)检测与Aβ生成相关蛋白APP、PS1、BACE1的表达水平；ELISA法检测Aβ₁-40及Aβ₁-42水平。

5、观察PLTP过表达对总Tau蛋白及其pTau蛋白的影响；采用western blot检测大脑皮质及海马总Tau蛋白及pTau蛋白在pSer199、pSer214、pThr231、pSer404四个磷酸化位点的蛋白的表达。

6、观察PLTP过表达对GSK-3β及GSK-3β(pSer9)的影响；采用western blot检测GSK-3β及GSK-3β(pSer9)的蛋白表达水平。

7、实验数据用SPSS16.0软件进行统计，多组样本间比较采用单因素方差分析(ANOVO)，P<0.05时具有统计学差异。

二、结果

1、PLTP过表达能改善3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力；水迷宫结果显示：在定位航行实验、空间探索实验中，3×Tg-AD小鼠与WT小鼠相比，逃避潜伏期明显延长，探索实验中进入平台所在区域的次数明显减少，进入平台所在区域的潜伏期明显增长；而PLTP高表达的3×Tg-AD小鼠逃避潜伏期明显缩短，探索实验中进入平台所在区域的次数明显增多，进入平台所在区域的潜伏期明显缩短。差异具有统计学意义。穿梭被动回避实验结果显示：与WT小鼠相比，3×Tg-AD小鼠进入暗箱的潜伏期明显缩短，暗箱停留时间明显延长；而PLTP高表达的3×Tg-AD小鼠，进入暗箱的潜伏期明显延长，停留时间明显缩短，，差异具有统计学意义。说明PLTP过表达能明显改善3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力。

2、PLTP过表达可改善3×Tg-AD小鼠病理学损伤、老年斑、神经纤维缠结的形成；通过HE染色和尼氏染色显示：3×Tg-AD小鼠皮层神经细胞减少，细胞核浓缩，细胞凋亡，Aβ₁-42免疫组化染色可见明显的SP，而银染发现明显的NFT；PLTP过表达后，皮质神经元细胞增多，SP减少，NFT也明显减少。

3、PLTP过表达可减少Aβ形成；ELISA结果显示：3×Tg-AD小鼠海马及皮层区，Aβ_1-40及Aβ_1-42蛋白表达均升高；PLTP过表达后，Aβ_1-40及Aβ_1-42蛋白表达均降低。

4、PLTP过表达能减少与Aβ生成相关蛋白的表达；Western blot结果显示：3×Tg-AD小鼠海马与皮层区，Aβ生成相关标记物APP、PS1、BACE1表达均增高；PLTP过表达后，APP、PS1、BACE1表达均降低。

5、PLTP过表达能抑制Tau蛋白及其pTau蛋白的表达；Western blot结果显示：3×Tg-AD小鼠海马与皮层区，总Tau及其pTau蛋白在pSer199、pSer214、pThr231、pSer404四个位点的表达均升高；PLTP过表达后总Tau及其pTau蛋白在pSer199、pSer214、pThr231、pSer404四个位点的表达均降低。

6、PLTP过表达能促进GSK-3β9位丝氨酸磷酸化使GSK-3β失活；Western blot结果显示：3×Tg-AD小鼠的海马及皮层区，GSK-3β表达增高，其在9位苏氨酸残基磷酸化生成的GSK3β(pSer9)表达降低；PLTP过表达后，GSK-3β表达降低，其在9位苏氨酸残基磷酸化生成的GSK3β(pSer9)表达增高。

本发明的PLTP过表达可改善3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力；PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的改善，可能通过促进GSK-3β失活进而减少Aβ产生和Tau蛋白磷酸化有关。

下面结合附图对本发明的技术效果作详细的描述。

图3是本发明实施例提供的PLTP在各组小鼠大脑皮质及海马的表达(n＝4,#P<0.05，##P<0.01vs.WT；*P<0.05，**P<0.01vs.3×Tg-AD)；图中：A：PLTP蛋白条带在模型和3×Tg-AD小鼠海马和皮质内的表达；,B：PLTP在模型和3×Tg-AD小鼠海马和皮质内的表达。

图4是本发明实施例提供的PLTP过表达能改善3×Tg-AD小鼠学习记忆能力(n＝12，#P<0.05，##P<0.01vs.WT；*P<0.05，**P<0.01vs.3×Tg-AD)；图中：A：水迷宫定位航行实验小鼠逃避潜伏期；B：定位航行实验小鼠运行轨迹；C：水迷宫空间探索实验60秒穿越平台次数及小鼠进入平台所在区域的潜伏期；D：穿梭被动回避实验小鼠进入暗箱的潜伏期及暗箱停留时间。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。