一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用 (Method for co-expressing four structural proteins of African swine fever virus in insect cells and application of method ) 是由 黄超华 花群义 史卫军 吴江 林彦星 曹琛福 曾少灵 刘建利 阮周曦 杨俊兴 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本申请涉及一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用。本发明将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入经改造pFastBac-Dual后获得的穿梭载体,制备重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-p72,并获得重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72,实现昆虫细胞中的高效共表达。基于共表达的混合重组蛋白建立用于检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,具有敏感性高、特异性高和重复性好等优点。(The application relates to a method for co-expressing four structural proteins of African swine fever virus in insect cells and application thereof. The invention inserts four structural proteins pp62, p54, p30 and p72 genes of African swine fever virus into a shuttle vector obtained after the improvement of pFastBac-Dual, prepares a recombinant shuttle plasmid pF4-pp62-p54-p30-p72, obtains a recombinant baculovirus rBac-pp62-p54-p30-p72, and realizes the high-efficiency co-expression in insect cells. The indirect ELISA method for detecting the African swine fever antibody is established based on the co-expressed mixed recombinant protein, and has the advantages of high sensitivity, high specificity, good repeatability and the like.)
技术领域
本申请涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种同时表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p30、p54和p72的昆虫杆状病毒表达系统及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)感染引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。其急性症状以高热、网状内皮系统出血及高死亡率为特征。家猪和野猪所有品种及各年龄段均易感。钝缘蜱属软蜱，特别是O.moubata和O.erraticus是非洲猪瘟病毒的贮存媒介和传播媒介。此前该病仅限于非洲发生，直到上世纪中叶传到欧洲、南美及加勒比海地区，2007年传入东欧并逐渐蔓延至俄罗斯西伯利亚地区。2018年8月3日，我国确诊首例非洲猪瘟疫情，随后该病在全国大范围爆发，并给我国养猪业带来巨大损害。
非洲猪瘟病毒属于DNA病毒，病毒粒子呈正二十面体结构。其基因组DNA包含151～167个开放阅读框，约编码68种结构蛋白和100多种非结构蛋白。其中，pp62、p54、p30和p72四种蛋白为非洲猪瘟病毒重要的结构蛋白，在非洲猪瘟病毒的组装和侵染宿主细胞中有着极其重要的作用，也是目前非洲猪瘟病毒致病机制、疫苗研制以及检测方法的主要靶蛋白。
目前，虽然现有技术中有对于上述四种蛋白的分别表达或个别进行部分共表达，但至今未见有在昆虫细胞中同时共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72四种蛋白的方法和体系。而鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟病毒分离等实验。因此，寻求多种结构蛋白一次性共表达作为病毒替代，能够为在无法进行非洲猪瘟病毒操作的情况下提供了一种制备其高效抗原的新的研究途径和方法，具有极其重要意义。
鉴于此，提出本发明。
发明内容
本申请的目的之一是提供了一种含pF4-pp62-p54-p30-p72的重组杆状病毒的构建方法，用该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后可同时表达非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72四种结构蛋白；
本申请的目的之二是提供了一种应用，利用重组杆状病毒同时表达来制备pp62、p30、p54和p72四种重组蛋白；
本申请的目的之三是提供了一种间接ELISA方法，以共表达的pp62、p30、p54和p72四种混合重组蛋白为包被抗原，建立了一种用于非洲猪瘟抗体检测的间接ELISA方法；
为实现上述目的，本发明提供了一种重组穿梭质粒pF4，其具有4个多克隆位点；
在一些实施方式中，所述质粒pF4为载体pFastBac-Dual的第3510位碱基与第3985位碱基之间的序列被F4序列代替，从而具有4个含有独立启动子的多克隆位点MCS1、MCS2、MCS3、MCS4。
在一些优选的实施方式中，所述F4的基因序列如SEQ ID NO.1所示；优选的，所述重组穿梭质粒pF4的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
本申请还提供了一种插入了非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p30、p54和p72基因的重组穿梭质粒的pF4-pp62-p54-p30-p72，所述质粒是将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入所述的重组穿梭质粒pF4中。
在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒pp62基因插入pF4多克隆位点MCS3的酶切位点Sph I和Xho I之间；p54基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS1的酶切位点Sbf I和NheI之间；p30基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS2的酶切位点Aat II和Eco81 I之间；p72基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS4的酶切位点BamH I和EcoR I之间。
在一些实施方式中，所述pp62、p54、p30和p72基因序列分别如SEQ ID NO.2-5所示。
本发明还提供了一种重组病毒，其特征在于，包含上述所述重组穿梭质粒，或通过转入或转座上述所述重组穿梭质粒；
在一些优选的实施方式中，所述重组病毒为重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72。
本申请还提供了一种上述重组表达质粒或病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)限制性内切酶Bsp1407 I和SnaB I对质粒pUC–F4和载体pFastBac-Dual进行双酶切，切胶回收纯化获得线性的F4和pFastBac-Dual；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4；
2)限制性内切酶Sbf I和Nhe I对质粒pUC–pp62和重组穿梭质粒pF4进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的pp62和pF4；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62；
3)限制性内切酶Sph I和Xho I对质粒pUC–p54和重组穿梭质粒pF4-pp62进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的p54和pF4-pp62；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54；
4)限制性内切酶Aat II和Eco81I对质粒pUC–p30和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54进行双酶切，胶回收纯化获得线性的p30和pF4-pp62-p54；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30；
5)限制性内切酶BamH I和EcoR I对质粒pUC–p72和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30进行双酶切，切胶获得线性的p72和pF4-pp62-p54-p30；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-72；
6)将重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-72以热激方式转化入感受态细胞DH10Bac，通过菌落PCR筛选出转座成功的重组杆粒。通过脂质体转染昆虫细胞Sf9，从而获得重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-72。
本申请还提供一种利用上述重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30、p72蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将上述重组杆状病毒接种至Sf9细胞，27℃培养72h；
2)待80％Sf9细胞出现细胞病变，加入RIPA裂解液裂解细胞；
3)4℃，10000r/min离心10min，离心后，采用Ni亲和层析柱纯化上清中的目的蛋，从而获得纯化的非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72蛋白混合物。
本申请还提供了一种制备检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA试剂盒的方法，所述方法包括利用上述重组质粒共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72蛋白，纯化得混合重组蛋白，以混合重组蛋白作为包被抗原制备ELISA试剂盒；优选的，所述混合重组蛋白的加入量为0.25μg/孔。
本申请还提供了一种以共表达纯化的pp62、p30、p54和p72四种混合重组蛋白为包被抗原建立的用于检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法，优选的，所述混合重组蛋白的加入量为0.25μg/孔。
在一些实施方式中，上述方法具体包括以下步骤：
(1)包被用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH 9.6)包被液稀释纯化的混合重组蛋白，加入到酶标板中，每孔蛋白0.25μg，过夜包被；
(2)封闭PBST洗涤3次后，加入200μL/孔Protein-Free T20(PBS)Blocking Buffer室温封闭1h；
(3)血清样品孵育PBST洗涤3次后，加入PBST稀释后的待检血清样品(最佳稀释倍数为1/20)100μL/孔，37℃孵育30min；
(4)HRP标记的兔抗猪IgG孵育PBST洗涤3次后，加入20，000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，100μL/孔，室温孵育45min；
(5)显色与终止PBST洗涤3次后，加入TMB底物液，100μL/孔，室温避光显色10min。加入终止液50μL/孔，终止显色；
(6)读数与结果判定酶标仪读取OD450。样品OD450值≥0.226判为阳性，即非洲猪瘟阳性血清；OD450值≤0.213，则为非洲猪瘟阴性血清。0.226＜OD450＜0.213判为可疑，需通过再一次实验进行判定。
本发明还提供了一种所述的重组穿梭质粒或重组病毒在共表达非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72蛋白中的应用。
本发明还提供一种所述重组穿梭质粒或所述重组病毒在建立检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法中的应用，其特征在于，利用上述的重组穿梭质粒或重组病毒共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72蛋白，纯化得混合重组蛋白，以混合重组蛋白作为包被抗原制备ELISA试剂盒。
本发明具有以下优点：
(1)本发明获得一种全新的具有四个多克隆位点的重组质粒pF4，为共表达多种蛋白提供了有效可靠途径。基于该重组质粒构建的重组质粒pF4-pp62-p54-p30-p72，能够在昆虫细胞中可溶性共表达pp62、p30、p54和p72，且表达量高，适于下游应用。
(2)鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟病毒分离等实验。所以，利用本发明技术可在昆虫细胞中一次性高效共表达非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72四种结构蛋白，在无法进行非洲猪瘟病毒操作的情况下，提供了一种制备其高效抗原的新的研究途径和方法，在该方面具有显著意义。
(3)本发明以表达纯化后的非洲猪瘟病毒四种混合重组蛋白直接作为包被抗原，建立的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，不仅简易便捷性，节省成本，同时混合蛋白包被能够显著提高非洲猪瘟病毒抗体检出率。
(4)本发明建立的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，具有良好的特异性、高敏感和重复性，为非洲猪瘟病毒抗体检测提供了一种新的检测技术。
附图说明
图1为本申请的实验技术流程图。
图2为合成序列F4结构图。
图3为改造获得的载体pF4结构图。
图4为改造获得的重组载体pF4-pp62-p54-p30-p72结构图，其中，
f1 origin:碱基102-557
Ampicillin抗性基因:碱基689-1549
pUC origin:碱基1694-2367
Tn7R:碱基2611-2835
Gentamicin抗性基因:碱基2902-3435(complementary strand)
HSV tkpolyadenylation signal:
(1)碱基3992-4274(complementary strand)
(2)碱基4913-5195(complementary strand)
多克隆位点:
(1)碱基4275-4322(包含：SbfI(SdaI)，NcoI，NheI，EheI)
(1)碱基5196-5258(与原载体相同)
p10启动子(Pp10):
(1)碱基4323-4444(complementary strand)
(2)碱基5259-5380(complementary strand)
Polyhedrin启动子(PPH):
(1)碱基4463-4591
(1)碱基5399-5527
多克隆位点:
(1)碱基4592-4652(包含：AatII，Eco81I)
(2)碱基5528-5642(与原载体相同)
SV40 polyadenylation signal:
(1)碱基4653-4893
(2)碱基5643-5883
Tn7L:碱基5913-6077。
图5为重组质粒pF4-pp62-p54-p30-p72的构建鉴定结果，其中，
A为pF4-pp62构建结果，
B为pF4-pp62-p54构建结果，
C为pF4-pp62-p54-p30构建结果，
D为pF4-pp62-p54-p30-p72构建结果
图6为细胞病变结果，其中，
A为正常Sf9细胞；
B为转染后72h的病变Sf9细胞。
图7为间接免疫荧光结果，其中
A为野生杆状病毒感染的Sf9细胞；
B为重组杆状病毒rBac-PP62-P54-P30-P72感染的Sf9细胞
图8为纯化产物SDS-PAGE电泳结果，其中
1为纯化产物；
2为重组杆状病毒rBac-PP62-P54-P30-P72感染的Sf9细胞全蛋白；
3为野生杆状病毒感染的Sf9细胞全蛋白；
4为蛋白Marker。
图9为纯化产物Western blot结果，其中，
M为蛋白Marker；
1为野生杆状病毒感染的Sf9细胞全蛋白；
2为纯化产物。
图10为间接ELISA方法特异性试验结果。
图11为间接ELISA方法敏感性试验结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
部分术语定义
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
如下为具体的实施例：
实例1pF4载体的设计与制备
为同时表达非洲猪瘟病毒结构蛋白pp62、p30、p54和p72，对载体pFastBac-Dual进行改造，使其具有四个克隆位点，并且每个克隆位点均具有各自独立的启动子。本发明分析载体pFastBac-Dual的全序列，发现在载体的第3510碱基处为Bsp1407 I酶切位点且是唯一的，第3985碱基处为SnaB I酶切位点且是唯一的，同时在第3510碱基与第3985碱基之间没有任何元件，因此可作为改造区域对载体进行改造。
由于原载体已有两个克隆位点，各自的启动子分别为Polyhedrin和P10，因此本发明通过Bsp1407 I和SnaB I双酶切载体pFastBac–Dual，切除第3510位碱基与第3985位碱基之间的序列，随后插入一段合成序列F4(该序列含第3510位碱基与第3985位碱基之间的序列和两个克隆位点，且该两个克隆位点具有各自独立的启动子，具体系列参见SEQ IDNO.1)，如图2所示，从而完成载体的改造，改造后的载体命名为pF4，整个载体图谱见图3。
实例2重组载体pF4-pp62-p54-p30-p72的构建
以非洲猪瘟沈阳株为参考序列(GenBank：MH766894.1)，通过上海生工公司分别合成pp62、p30、p54和p72基因序列(为便于表达蛋白纯化，在每个基因序列的5’端增加一段His标签序列)，所述基因序列分别参见SEQ ID NO.2-5，获得重组质粒pUC-pp62(pp62序列的5’和3’端分别有酶切位点Sph I和Xho I)、pUC-p30(p30序列的5’和3’端分别有酶切位点Aat II和Eco81I)、pUC-p54(p54序列的5’和3’端分别有酶切位点Sbf I和Nhe I)和pUC-p72(p72序列的5’和3’端分别有酶切位点BamH I和EcoR I)。
按照常规的分子克隆技术，依次将pp62、p54、p30和p72基因序列基因依次插入到改造后的载体pF4的四个克隆位点，制备序列如SEQ ID NO.6所示的改造后具有四个多克隆位点的重组质粒pF4。具体构建包括以下步骤：
1)限制性内切酶Bsp1407 I和SnaB I对质粒pUC–F4和载体pFastBac-Dual进行双酶切，切胶回收纯化获得线性的F4和pFastBac-Dual；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4；
2)限制性内切酶Sbf I和Nhe I对质粒pUC–pp62和重组穿梭质粒pF4进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的pp62和pF4；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62；
3)限制性内切酶Sph I和Xho I对质粒pUC–p54和重组穿梭质粒pF4-pp62进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的p54和pF4-pp62；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54；
4)限制性内切酶Aat II和Eco81 I对质粒pUC–p30和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54进行双酶切，胶回收纯化获得线性的p30和pF4-pp62-p54；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30；
5)限制性内切酶BamH I和EcoR I对质粒pUC–p72和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30进行双酶切，切胶获得线性的p72和pF4-pp62-p54-p30；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-72。
6)对构建结果进行鉴定。
结果，经测序4个基因插入正确，从而构建重组质粒pF4-pp62-p54-p30-p72，重组质粒结构见图4，整个构建过程鉴定结果见图5。
实例3重组杆粒Bacmid-pp62-p54-p30-p72的提取
通过热转化的方式将重组质粒pF4-pp62-p54-p30-p72转化入感受态细胞DH10Bac中，48h后挑取单个白色菌落划线并继续培养48h。挑取单个白色菌落，进行菌落PCR鉴定，确定pp62-p54-p30-p72是否转座成功。鉴定结果为阳性的，过夜大量培养，并用PureLinkTMHiPure质粒纯化试剂盒大量提取纯化重组杆粒Bacmid-pp62-p54-p30-p72。
实例4重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72的获得
用转染试剂盒II Reagent将重组杆粒Bacmid-pp62-p54-p30-p72转染Sf9细胞，设空白对照，持续观察细胞病变情况。在细胞病变明显时，收集细胞培养上清，即P1代重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72，并继续传代以提高重组杆状病毒的滴度。转染后48到72h可以观察到明显的细胞病变：与正常Sf9细胞相比，细胞数量明显变少，细胞体积变大、变圆，且发生臌胀、变得容易脱落，并有少量细胞破碎，见图6。转染后超过72h，Sf9细胞出现大量破碎。
实例5间接免疫荧光检测PP62、P30、P54和P72的共表达情况
将Sf9细胞接种至24孔培养板中，贴壁1h后，接种重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72，28℃培养72h。弃去培养液，并用PBST(pH7.4)轻轻洗涤3次；加入预冷的4％多聚甲醛，室温固定1h；PBST洗涤后，加入1％Triton x-100，室温通透1h；洗涤后，加入无蛋白封闭液室温封闭2h；弃封闭液，加入非洲猪瘟标准阳性血清(购自西班牙国家兽医研究所)，4℃孵育过夜；洗涤后，加入Goat Anti-Pig IgG-FITC荧光抗体(1:200稀释)，37℃避光孵育30min；洗涤后，倒置荧光显微镜下观察。通过间接免疫荧光检测重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72感染Sf9细胞后pp62、p30、p54和p72蛋白的表达情况。
结果如图7，野生杆状病毒(未插入目的基因)感染的Sf9细胞未观察到任何特异性的绿色荧光，而重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72感染的Sf9细胞显示出强烈的绿色荧光。这一结果表明，重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72感染的Sf9细胞能够大量表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p30、p54和p72蛋白。
实例6 PP62、P30、P54和P72的表达和纯化
将2mL重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72接种至贴壁的Sf9细胞。28℃恒温培养箱中培养72h。待80％Sf9细胞出现细胞病变(细胞停止生长，细胞膨胀变大)且未出现细胞破碎，弃细胞培养液，加入1mL的RIPA裂解液，使裂解液平铺在细胞表面，静置10min。随后，将Sf9细胞吹下或用细胞刮将细胞刮下，收集至离心管中。为充分裂解细胞，可将收集的细胞反复冻融3次以上。收集足够的细胞裂解产物后，对细胞裂解产物进行离心，离心条件为4℃，10000r/min离心10min，留取上清、弃沉淀。采用Ni亲和层析柱纯化上清中的目的蛋白pp62、p30、p54和p72，获得非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72四种混合重组蛋白。
实例7纯化产物的SDS-PAGE结果
按照4:1的比例加入5×Loading buffer，煮沸后，取5μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。直接考马斯亮蓝染色0.5h，再进行脱色，结果见图8。SDS-PAGE结果显示，纯化产物(泳道1)存在4条明显的蛋白条带，大小分别为76KD、63KD、26KD和19KD，与预期的p72、pp62、p30和p54蛋白大小一致。
实例8纯化产物的Western blot结果
按照实例7进行SDS-PAGE电泳，转膜至NC膜，按照常规Western blot方法进行封闭、孵育一抗(以1:1000倍稀释的猪非洲猪瘟标准阳性血清为一抗)、酶标二抗(HRP标记的兔抗猪多克隆抗体1:5000)，最后显色，对纯化的蛋白(pp62、p30、p54和p72)的免疫原性进行评价。Western blot结果见图9，结果显示，纯化产物(泳道2)存在4条明显的印迹条带，大小分别为76KD、63KD、26KD和19KD，与预期的p72、pp62、p30和p54蛋白大小一致，也与SDS-PAGE电泳结果相一致。
SDS-PAGE和Western blot结果表明，本发明能够在昆虫细胞中同时大量表达非洲猪瘟病毒p72、pp62、p30和p54四种结构蛋白，并通过亲和层析纯化获得的四种结构蛋白的混合产物具有良好的免疫原性和反应原性。
实例9制备检测ASFV抗体的间接ELISA方法
以共表达并纯化的ASFV PP62、P30、P54和P72重组蛋白为包被抗原建立一种检测ASFV抗体的间接ELISA方法。具体步骤如下：
(1)包被
用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH 9.6)包被液稀释纯化的重组蛋白，加入到酶标板中，每孔蛋白0.25μg，过夜包被。
(2)封闭
PBST洗涤3次后，加入200μL/孔Protein-Free T20(PBS)Blocking Buffer(购自Thermo)，室温封闭1h。
(3)血清样品孵育
PBST洗涤3次后，加入PBST稀释后的待检血清样品(最佳稀释倍数为1/20)100μL/孔，37℃孵育,30min。
(4)HRP标记的兔抗猪IgG孵育
PBST洗涤3次后，加入20000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG 100μL/孔，室温孵育45min。
(5)显色与终止
PBST洗涤3次后，加入TMB底物液，100μL/孔，室温避光显色10min。加入2mol/LH2SO4 50μL/孔，终止显色。
(6)读数
酶标仪读取OD450
(7)结果判定
利用建立的间接ELISA方法对218份已知的非洲猪瘟阴性血清进行检测，计算检测结果的平均值X＝0.193，标准方差SD＝0.011，通过公式进一步计算得到阳性阈值PC＝0.226，阴性阈值NC＝0.213。从而确定检测方法的判定标准为：样品OD450值≥0.226判为阳性，即非洲猪瘟阳性血清；OD450值≤0.213，则为非洲猪瘟阴性血清。0.226＜OD450＜0.213判为可疑，需通过再一次实验进行判定。
表1间接ELISA反应条件
实例10特异性试验
使用建立的间接ELISA方法分别检测口蹄疫(FMDV)、水泡性口炎(VSV)、猪蓝耳病(PRRSV)、猪伪狂犬(PRV)、猪圆环病毒(PCV)和猪瘟病毒(CSFV)几种临床症状与非洲猪瘟相似或常见的猪传染病的阳性血清，判断是否存在交叉反应，检验其特异性。
用建立的间接ELISA方法对上述阳性血清进行检测，结果显示，6种病毒阳性血清的OD450nm值均＜0.209，均为阴性(图10)，表明该方法具有良好的特异性。
实例11检测限试验
将非洲猪瘟标准阳性血清从160倍开始进行倍比稀释，用建立的间接ELISA方法进行检测，将能检出阳性的稀释倍数确定为检测限。并与市场上商品化的检测试剂盒进行对比。结果显示，当阳性血清稀释5120倍时，OD450nm值仍大于临界值0.226，说明建立的间接ELISA方法具有非常高的灵敏度，其检测限可达5120倍，远高于商品化的检测试剂盒，结果见图11。
实例12重复性试验
取出3块同一时间包被的酶标板，每个板随机抽出4条。选取6份阴性血清样品和2份阳性血清样品，分别加入板中，根据优化好的ELISA条件进行操作，分别计算每个样品的平均OD450nm值和标准差，根据公式变异系数＝标准差/平均值，计算出每个样品的变异系数，最后求出所有样品的平均变异系数作为批内变异系数。同理，取不同时间包被的3块酶标板，每块板随机抽取4条。用6份阴性血清样品和2份阳性血清样品，根据以上叙述进行操作，计算批间变异系数。
表2 ELISA重复性试验结果
表2结果显示，批内变异系数为2.36％～8.56％，批间变异系数为3.34％～9.76％。说明建立的间接ELISA检测方法是稳定的、可以重复的，能够应用于实际检测。
以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请作出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳海关动植物检验检疫技术中心
<120> 一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用
<130> 2020
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtacaaaaa aacagtcata acaagccatg aaaaccgcca ctgcgccgtt accaccgctg 60
cgttcggtca aggttctgga ccagttgcgt gagcgcatac gctacttgca ttacagttta 120
cgaaccgaac aggcttatgt caactgggtt cgtgccttca tccgtttcca cggtgtgcgt 180
cacccggcaa ccttgggcag cagcgaagtc gaggcatttc tgtcctggct ggcgaacgag 240
cgcaaggttt cggtctccac gcatcgtcag gcattggcgg ccttgctgtt cttctacggc 300
aaggtgctgt gcacggatct gccctggctt caggagatcg gtagacctcg gccgtcgcgg 360
cgcttgccgg tggtgctgac cccggatgaa gtggttcgca tcctcggttt tctggaaggc 420
gagcatcgtt tgttcgccca ggactctagc tatagttcta gtggttggcc tacttacccg 480
tagtggctat ggcagggctt gccgccccga cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg 540
aacttggggg ttggggtggg gaaaaggaag aaacgcgggc gtattggtcc caatggggtc 600
tcggtggggt atcgacagag tgccagccct gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg 660
acccaacacc cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc 720
ggtattgtct ccttccgtgt ttcagttagc ctcccccatc tcccgggcgc cgctgctagc 780
accatggagg cccctgcagg tgatcaagtc ttcgtcgagt gattgtaaat aaaatgtaat 840
ttacagtata gtattttaat taatatacaa atgatttgat aataattctt atttaactat 900
aatatattgt gttgggttga attaaaggtc cgtatactcc ggaatattaa tagatcatgg 960
agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta ttttactgtt ttcgtaacag 1020
ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ggattattca taccgtccca ccatcgggcg 1080
cggatcgacg tccgaactac ctaaggtaga gcgtctcgac aggcttgtcg agaagtacta 1140
gaggatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 1200
acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat 1260
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 1320
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 1380
gatctgatca ttacgta 1397
<210> 2
<211> 1677
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 2
ctcgagatgt cgtactacca tcaccatcac catcacgatt acgatatccc aacgaccgaa 60
aacctgtatt ttcagggaat gccctctaat atgaaacagt tttgcaagat ttctgtatgg 120
ctacagcagc acgatccaga tttattagaa attatcaaca acttatgtat gcttggcaat 180
ttatccgcgg caaagtacaa acacggagtt accttcattt accccaaaca ggcaaagatc 240
cgcgatgaaa taaaaaaaca tgcctactcc aatgaccctt cacaagccat aaagacctta 300
gaatcactca tccttccatt ttacattccc actccagcgg agttcaccgg ggaaatcggc 360
tcctacaccg gagtgaaatt agaggttgaa aaaacggagg cgaataaagt tattttaaaa 420
aatggagaag cggtcctagt accggcggcc gattttaagc cctttcctga tcgccgacta 480
gcggtctgga tcatggagtc aggctctatg cccctggagg gtccccccta taagcggaaa 540
aaggagggtg gggggaatga cccgccggtt cctaagcata tctcgccgta tactccgcgc 600
acgcgtattg ccattgaggt ggaaaaggcc tttgatgact gtatgcgtca aaactggtgt 660
agtgtcaata atccctatct tgccaagtcg gtctccttgc tgtctttctt gtcgctcaac 720
catcccaccg agtttattaa ggtactgccg cttatagact ttgacccctt ggtgaccttt 780
tatctacttc ttgagcccta taaaacgcat ggggatgact ttttaattcc ggaaaccatt 840
ttattcggcc ctaccggatg gaatggtaca gatctgtatc aaagtgccat gctggagttt 900
aaaaagtttt ttacccagat tactcgccaa acctttatgg acatagccga ttcggctact 960
aaggaggtag atgttcccat atgttactct gatcccgaaa ccgtacattc ctatgccaat 1020
cacgtgcgta ctgaaatttt gcatcacaat gccgtcaata aggttacaac acctaacctc 1080
gtcgtgcagg cctataatga gcttgagcaa accaatacca tacgacatta cggccctatt 1140
ttcccggaaa gtaccatcaa cgcactgcgt ttttggaaaa agctgtggca ggatgaacag 1200
cgatttgtta tccacggcct gcaccgcacg ttgatggatc aacccaccta tgaaacctct 1260
gagtttgcag agatcgttag aaatttacgg ttttcgcgtc ccggcaataa ctatataaac 1320
gagcttaata ttacaagtcc cgctatgtac ggcgacaagc ataccaccgg agatattgcg 1380
cccaatgata gatttgccat gttggtggcc tttatcaaca gtactgactt tttatacacc 1440
gcgattcccg aggaaaaggt aggggggaat gaaacccaaa ccagtagcct tacagaccta 1500
gttccaacac ggctacactc ttttttaaat cataatctaa gcaaacttaa aatcttaaac 1560
cgcgcgcagc aaacggttag aaatattctt tcaaatgatt gtcttaatca actgaaacat 1620
tatgttaaac acacgggaaa aaatgaaata ctaaagttac ttcaagaata agcatgc 1677
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<211> 551
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 3
cctgcaggat gtcgtactac catcaccatc accatcacga ttacgatatc ccaacgaccg 60
aaaacctgta ttttcagggc atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc ttagtcatca 120
ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct gctattgagg 180
aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa gtcactccac 240
aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag ccagtcacgg 300
gcagaccggc aacaaacaga ccagcaacaa acaaaccagt tacggacaac ccagttacgg 360
acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg agtgctcctg 420
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cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta gaaaactcct 540
tgtaagctag c 551
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<211> 691
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 4
gacgtcatgt cgtactacca tcaccatcac catcacgatt acgatatccc aacgaccgaa 60
aacctgtatt ttcagggcat ggattttatt ttaaatatat ccatgaaaat ggaggtcatc 120
ttcaaaacgg atttaagatc atcttcacaa gttgtgtttc atgcgggtag cctgtataat 180
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actgaacatc aggctcaaga agaatggaat atgattctgc atgtgctgtt tgaagaggag 360
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<211> 2025
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 5
ggatccatgt cgtactacca tcaccatcac catcacgatt acgatatccc aacgaccgaa 60
aacctgtatt ttcagggcat ggcatcagga ggagcttttt gtcttattgc taacgatggg 120
aaggccgaca agattatatt ggcccaagac ttgctgaata gcaggatctc taacattaaa 180
aatgtgaaca aaagttatgg gaaacccgat cccgaaccca ctttgagtca aatcgaagaa 240
acacatttgg tgcattttaa tgcgcatttt aagccttatg ttccagtagg gtttgaatac 300
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ccccagtacg gagacttttt ccatgatatg gtgggccatc atatattggg tgcatgtcat 420
tcatcctggc aggatgctcc gattcagggc acgtcccaga tgggggccca tgggcagctt 480
caaacgtttc ctcgcaacgg atatgactgg gacaaccaaa cacccttaga gggcgccgtt 540
tacacgcttg tagatccttt tggaagaccc attgtacccg gcacaaagaa tgcgtaccga 600
aacttggttt actactgcga ataccccgga gaacgacttt atgaaaacgt aagattcgat 660
gtaaatggaa attccctaga cgaatatagt tcggatgtca caacgcttgt gcgcaaattt 720
tgcatcccag gggataaaat gactggatat aagcacttgg ttggccagga ggtatcggtg 780
gagggaacca gtggccctct cctatgcaac attcatgatt tgcacaagcc gcaccaaagc 840
aaacctattc ttaccgatga aaatgatacg cagcgaacgt gtagccatac caacccgaaa 900
tttctttcac agcattttcc cgagaactct cacaatatcc aaacagcagg taaacaagat 960
attactccta tcacggacgc aacgtatctg gacataagac gtaatgttca ttacagctgt 1020
aatggacctc aaacccctaa atactatcag ccccctcttg cgctctggat taagttgcgc 1080
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cgctttatca ccataaagct tgcatcgcaa aaggatttgg tgaatgaatt tcctggactt 1200
tttgtacgcc agtcacgttt tatagctgga cgccccagta gacgcaatat acgctttaaa 1260
ccatggttta tcccaggagt cattaatgaa atctcgctca cgaataatga actttacatc 1320
aataacctgt ttgtaacccc tgaaatacac aacctttttg taaaacgcgt tcgcttttcg 1380
ctgatacgtg tccataaaac gcaggtgacc cacaccaaca ataaccacca cgatgaaaaa 1440
ctaatgtctg ctcttaaatg gcccattgaa tatatgttta taggattaaa acctacctgg 1500
aacatctccg atcaaaatcc tcatcaacac cgagattggc acaagttcgg acatgttgtt 1560
aacgccatta tgcagcccac tcaccacgca gagataagct ttcaggatag agatacagct 1620
cttccagacg catgttcatc tatatctgat attagccccg ttacgtatcc gatcacatta 1680
cctattatta aaaacatttc cgtaactgct catggtatca atcttatcga taaatttcca 1740
tcaaagttct gcagctctta catacccttc cactacggag gcaatgcgat taaaaccccc 1800
gatgatccgg gtgcgatgat gattaccttt gctttgaagc cacgggagga ataccaaccc 1860
agtggtcata ttaacgtatc cagagcaaga gaattttata ttagttggga cacggattac 1920
gtggggtcta tcactacggc tgatcttgtg gtatcggcat ctgctattaa ctttcttctt 1980
cttcagaacg gttcagctgt gctgcgttac agtacctaag aattc 2025
<210> 6
<211> 6159
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 420
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 480
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 540
attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 600
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 660
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 720
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 780
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 840
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 900
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 960
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 1020
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 1080
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 1140
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 1200
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 1260
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 1320
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 1380
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 1440
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1500
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1560
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1620
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1680
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1740
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1800
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1860
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1920
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1980
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 2040
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 2100
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 2160
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 2220
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2280
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 2340
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2400
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2460
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2520
tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2700
aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact 2760
cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2880
gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac 2940
ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc 3000
ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag 3060
cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat 3120
ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc 3180
ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta 3240
atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag 3300
atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat 3360
gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt 3420
gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 3480
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga 3540
aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg 3600
agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc 3660
gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg 3720
aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg 3780
cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc 3840
aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag 3900
tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct 3960
atagttctag tggttggcct acttacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac 4020
gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga 4080
aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg 4140
ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt 4200
ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc 4260
tcccccatct cccgggcgcc gctgctagca ccatggaggc ccctgcaggt gatcaagtct 4320
tcgtcgagtg attgtaaata aaatgtaatt tacagtatag tattttaatt aatatacaaa 4380
tgatttgata ataattctta tttaactata atatattgtg ttgggttgaa ttaaaggtcc 4440
gtatactccg gaatattaat agatcatgga gataattaaa atgataacca tctcgcaaat 4500
aaataagtat tttactgttt tcgtaacagt tttgtaataa aaaaacctat aaatattccg 4560
gattattcat accgtcccac catcgggcgc ggatcgacgt ccgaactacc taaggtagag 4620
cgtctcgaca ggcttgtcga gaagtactag aggatcataa tcagccatac cacatttgta 4680
gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 4740
aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 4800
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 4860
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctgatcat tacgtacccg tagtggctat 4920
ggcagggctt gccgccccga cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg aacttggggg 4980
ttggggtggg gaaaaggaag aaacgcgggc gtattggtcc caatggggtc tcggtggggt 5040
atcgacagag tgccagccct gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg acccaacacc 5100
cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct 5160
ccttccgtgt ttcagttagc ctcccccatc tcccggtacc gcatgctatg catcagctgc 5220
tagcaccatg gctcgagatc ccgggtgatc aagtcttcgt cgagtgattg taaataaaat 5280
gtaatttaca gtatagtatt ttaattaata tacaaatgat ttgataataa ttcttattta 5340
actataatat attgtgttgg gttgaattaa aggtccgtat actccggaat attaatagat 5400
catggagata attaaaatga taaccatctc gcaaataaat aagtatttta ctgttttcgt 5460
aacagttttg taataaaaaa acctataaat attccggatt attcataccg tcccaccatc 5520
gggcgcggat cccggtccga agcgcgcgga attcaaaggc ctacgtcgac gagctcacta 5580
gtcgcggccg ctttcgaatc tagagcctgc agtctcgaca agcttgtcga gaagtactag 5640
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