波氏杆菌噬菌体培养基及培养方法
阅读说明：本技术 波氏杆菌噬菌体培养基及培养方法 (Bordetella phage culture medium and culture method ) 是由 李国强 李海超 刘美 张媛媛 孔德江 常世恺 刘荣飞 曹凯典 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及噬菌体培养技术领域,尤其涉及波氏杆菌噬菌体培养基及培养方法。本发明提供的培养基包括水和：多聚蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠和柠檬酸钠。该培养基能够实现对波氏杆菌噬菌体的大规模、高密度培养。实验表明,相对于其他组分组成的培养基,本发明提供的培养基能够更有效的培养波氏杆菌噬菌体,获得更高的放罐效价。(The invention relates to the technical field of phage culture, in particular to a bordetella phage culture medium and a culture method. The culture medium provided by the invention comprises water and: polypeptone, yeast extract powder, tryptone, sodium chloride and sodium citrate. The culture medium can realize large-scale and high-density culture of the bordetella phage. Experiments show that compared with a culture medium consisting of other components, the culture medium provided by the invention can be used for more effectively culturing the bordetella phage and obtaining higher tank-placing titer.)
技术领域
本发明涉及噬菌体培养技术领域，尤其涉及波氏杆菌噬菌体培养基及培养方法。
背景技术
猪萎缩性鼻炎是一种慢性的呼吸道传染病，由支气管败血波氏杆菌和/或产毒素多杀性巴氏杆菌感染导致的。支气管败血波氏杆菌单独感染时，鼻腔病变较轻，如果支气管败血波氏杆菌和产毒素多杀性巴氏杆菌混合感染或继发感染时，则鼻腔病变很重。该病全年均可发生，春、秋两季发生较多，所有猪群都可感染，2-5月龄的猪只更易感染，以鼻甲骨萎缩和慢性鼻炎为特征。猪萎缩性鼻炎的死亡率不高，但患病猪生长迟缓，育肥时间会延长，种猪会携带病菌，丧失育种价值，这些都会给养猪场造成较大经济损失。
随着养猪生产的工业化和集约化程度的提高，猪萎缩性鼻炎发病率有增加趋势，影响仔猪的生长发育。目前，对猪萎缩性鼻炎主要采用抗生素和磺胺类药物治疗，例如：肌肉注射链霉素、氨苄青霉素，或者用卡那霉素鼻腔喷雾。上述方法可以杀灭病菌，减轻病情。但抗生素的长期使用会使猪产生抗药性，并易体内残留药物，所以用药方案还有待改善。
近年来，研究表明波氏杆菌噬菌体可以特异性裂解波氏杆菌，从而起到消灭病原阻断波氏杆菌相关疾病传播的作用。但若要将波氏杆菌噬菌体应用于波氏杆菌感染导致疾病的治疗中，则需要大量的波氏杆菌噬菌体。而噬菌体属于病毒，其培养宿主为细菌，且不同噬菌体的生长特性差异较大，很难针对不同噬菌体采用同一方法进行高密度培养。
目前，对波氏杆菌噬菌体，特别是多杀性波氏杆菌噬菌体的培养技术仍存在缺陷，无法实现波氏杆菌噬菌体的高密度培养。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供波氏杆菌噬菌体培养基及波氏杆菌噬菌体的高密度培养方法。
本发明提供的培养基包括水和：多聚蛋白胨10～20g/L、酵母浸粉1～5g/L、胰蛋白胨5～15g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠1～10g/L。
一些实施例中，培养基由水和多聚蛋白胨10～20g/L、酵母浸粉1～5g/L、胰蛋白胨5～15g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠1～10g/L组成。
一些具体实施例中，所述培养基由水和多聚蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、胰蛋白胨12g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠8g/L组成。
一些实施例中，所述培养基中还包括波氏杆菌，所述波氏杆菌的密度为3×1010cfu。本发明中，所述巴氏杆菌噬菌体为分离自猪的波氏杆菌噬菌体。所述巴氏杆菌为分离自猪的巴氏杆菌。
本发明所述的培养基在波氏杆菌噬菌体培养中的应用。
本发明还提供了一种波氏杆菌噬菌体的培养方法，其将波氏杆菌和波氏杆菌噬菌体接种于本发明所述的培养基，然后进行培养。
所述培养方法中，先接入波氏杆菌，培养后再接入波氏杆菌噬菌体；
接入波氏杆菌噬菌体时，所述波氏杆菌和波氏杆菌噬菌体的数量比为60：1；
所述培养的条件包括：接入噬菌体后，静置30min，转速100rpm、通气12L/min、37℃、pH7.0培养10～15h。
本发明所述培养方法培养获得的波氏杆菌噬菌体培养液。
本发明还提供了一种治疗猪萎缩性鼻炎的药物，其由所述的波氏杆菌噬菌体培养液制得。
所述治疗猪萎缩性鼻炎的药物的制备方法包括：将培养获得的波氏噬菌体菌液，经过0.45微米和0.22微米两级微滤得到高密度波氏杆菌噬菌体制剂。
本发明还提供了一种治疗猪萎缩性鼻炎的方法，其为给予本发明所述的药物。
本发明提供的培养基包括水和：多聚蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠和柠檬酸钠。该培养基能够实现对波氏杆菌噬菌体的大规模、高密度培养。实验表明，相对于其他组分组成的培养基，本发明提供的培养基能够更有效的培养波氏杆菌噬菌体，获得更高的放罐效价。
具体实施方式
本发明提供了波氏杆菌噬菌体培养基及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，波氏杆菌噬菌体和波氏杆菌皆来自牧原公司兽医部研发中心。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、种子液制备：
波氏杆菌种子液制备：将波氏杆菌菌株划线接种于TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)固体平板，37℃培养24h，然后挑单菌落转接入TSB(Tryptone SoyaBroth)培养基摇瓶中于37℃、140rpm摇床振荡培养16h得到纯培养种子菌液。
波氏杆菌噬菌体种子制备：将10微升波氏杆菌噬菌体液体均匀涂布于TSA双层平板于37℃培养24h，待平板表面出现噬菌斑后将噬菌斑刮下，用无菌TSB洗下，采用0.22微米滤膜过滤除菌。
噬双层平板制备过程及噬菌体效价检测方法：
①底层平板制备：在无菌操作台内，待TSA培养基冷却至40-50℃左右，以不烫手为宜，将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的蜀牛瓶，左手旋出瓶盖。右手拿蜀牛瓶，使瓶口迅速通过火焰2-3次；在酒精灯火焰旁，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将蜀牛瓶中的培养基(约15～20ml)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，正置放于无菌操作台内；手不经过培养皿上方将皿盖打开，等待平板冷却凝固(10-15min)后，旋转平板，使皿盖在下，皿底在上，放于冰箱4℃保存。
②上层平板制备：取一系列试管，分别添加8ml培养基(含有0.9％琼脂的TSB培养基，温度在50℃左右为宜，禁止凝固)；各试管中500ul的菌液与马血清(温度把控40℃左右防止凝固，以不烫手为宜，忌温度过高影响血清效果、烫死细菌)
摇匀试管内液体，均匀涂布于配置好的TSA平板培养基上(边倒入边摇动平板使其迅速铺展表面)；待平板晾干后，划分区域并标记。
③编号：取制备好的双层平皿4套，用记号笔标明样品信息及做样日期，另取8支无菌1.5ml离心管排列于试管架上，加入0.9ml生理盐水并标明梯度
④稀释：准备好标准样品及需要检测的样品(如果为未除菌的的则需要用0.22um针头滤器进行过滤)，将待测噬菌体样品及标准样品以10倍比例稀释8个梯度。取一系列1.5ml离心管(标注梯度)，分别加入0.9ml无菌生理盐水于离心管中，将待测样品放在振荡器上振荡1min，确保样品完全混匀，10-1离心管中加入过的待检测噬菌体原液0.1ml，注意加液时枪头不要接触液面，确保枪头内壁无菌液残留。震荡混匀1min，另取枪头，在液面下吸入菌液，吸时深入管底，吹时离开液面，在离心管壁上缓缓打出，吹打完保证枪头上无过多液体残留(慢吸慢打)，进行一次润洗后，在液面下准确吸取0.1ml10-1样品加入10-2离心管中，涡旋震荡30s，步骤同第一步操作，10-2～10-8稀释步骤相同。取最低浓度离心管涡旋震荡30s，移液器抽取10ul小心滴于平板培养基内相应区域，尽量一次性打完，避免分散；由低浓度至高浓度，依次摇匀、抽取、涂布平板
④涂布：晾干15-20min后，倒置平板，37℃温箱过夜培养。
⑤计数：观察计数：(以最终出现噬菌斑的最大稀释倍数分区计算；噬菌斑数量与前面梯度相对应为宜)。
噬菌体效价(PFU/ml)＝噬菌斑数×稀释倍数×100
计数标准:据样品估计稀释梯度，控制噬菌斑数在10-100PFU为宜。
3、试验方案
(1)波氏杆菌培养基优化
实验方案：分别采用TSB培养基、脑-心浸萃液态培养基、包姜氏培养基与自制培养基1(多聚蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、胰蛋白胨12g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠8g/L)按照2％接种量在50L反应器上对波氏杆菌进行37℃，pH7.0培养12h进行发酵OD及活菌数测定。
实验结果：实验数据见下表。波氏杆菌采用自制培养基在反应器上生长情况较好，可以作为波氏杆菌噬菌体培养用培养基。
培养基
发酵OD600
活菌数(亿cfu/ml)
TSB培养基
2.3
26
脑-心浸萃液态培养基
3.6
43
包姜氏培养基
3.0
51
自制培养基
5.0
126
(2)波氏杆菌噬菌体MOI实验
实验方案：将波氏杆菌噬菌体按照效价采用TSB培养基稀释至10亿pfu/ml。采用TSB培养基进行摇瓶种子制备(500ml摇瓶装量150ml)，37℃、140rpm摇床培养16h。采用自制培养基为波氏杆菌噬菌体培养用培养基，设置6组摇瓶试验(500ml摇瓶装量150ml)，按照2％接种量和MOI＝0对照、MOI1:10、MOI1:30、MOI1:60、MOI1:100、MOI1:500、MOI1:1000接入摇瓶于37℃140rpm条件下振荡培养10h。检测噬菌体效价。
实验数据及结果见下表。按照2％接种量接种波氏杆菌、同时按照MOI1:60比例接种噬菌体可以获得较高的噬菌体效价。
(3)波氏杆菌噬菌体培养基优化对比试验。
实验方案：分别采用TSB培养基、脑心浸萃液态培养基、包姜氏培养基、自制培养基1、自制培养基2、自制培养基3、自制培养基4、自制培养基5，按照接种量2％，MOI1:60进行摇瓶培养试验，分别在8h、10h、12h进行取样检测噬菌体效价，验证获得较适宜的培养用培养基。配方如下：
自制培养基1：多聚蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、胰蛋白胨12g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠8g/L:121℃灭菌20min。
自制培养基2：多聚蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、胰蛋白胨12g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠8g/L:121℃灭菌20min。
自制培养基3：多聚蛋白胨5g/L、酵母浸粉2.5g/L、胰蛋白胨18g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠8g/L:121℃灭菌20min。
自制培养基4：酵母浸粉5g/L、胰蛋白胨18g/L、氯化钠6g/L；121℃灭菌20min。
自制培养基5：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠6g/L；121℃灭菌20min。
实验数据及结果见下表。从数据结果可见自制培养基1在摇瓶培养上表现出较好的培养效果，选择为最佳培养用培养基。
(4)波氏杆菌噬菌体50L发酵罐培养试验。
实验方案：采用自制培养基，50L反应器配置20L培养液，121℃灭菌20min。按照2％接种量接种波氏杆菌，同时按照MOI1:60接入波氏杆菌，接种混匀后静置30min，然后按照初始转速100rpm、通气12L/min、37℃、pH7.0培养10-15h左右，过程检测OD值，待OD先增长后降低至平稳后结束发酵。取发酵液采用0.22μm液体过滤器过滤后检测噬菌体效价。重复五个批次。大批量反应器噬菌体处理可以采用碟片离心机10000rpm连续流离心后分别经过0.45μm、0.22μm两级级过滤除菌收获。
试验结果：按照相同工艺培养5批次.发酵液噬菌体效价分别为510亿pfu/ml、560亿pfu/ml、900亿pfu/ml、1000亿pfu/ml、830亿pfu/ml。
结论：波氏杆菌噬菌体采用优化筛选的培养基配方为:多聚蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、胰蛋白胨12g/L、氯化钠6g/L、柠檬酸钠8g/L。经过摇瓶MOI试验，确定较合适的噬菌体接种比例为MOI1:60。将配置的培养基调节pH至7.0，121℃灭菌20min，降温至37℃接种2％体积比此配方培养的波氏杆菌种子液，同时接入噬菌体：细菌＝1:60比例数量的噬菌体，先静置培养30分钟，再37℃培养，搅拌转速100转/min，通入空气发酵体积比按照0.6条件下培养10-15h，待菌体裂解后600nm处吸光度降至最低至平稳后结束培养，波氏杆菌噬菌体效价可以达到500-1000亿pfu/ml。反应器采用筛选的自制培养基1可以实现噬菌体的高密度培养，效价相当于摇瓶效价的5-10倍。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。