包含突变的寨卡病毒全基因组cDNA的DNA分子及其应用

文档序号：128335 发布日期：2021-10-22 浏览：24次 >En<

阅读说明：本技术 包含突变的寨卡病毒全基因组cDNA的DNA分子及其应用 (DNA molecule comprising mutant Zika virus whole genome cDNA and application thereof ) 是由叶青张蓉蓉夏青秦成峰于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,公开了一种包含突变的寨卡病毒全基因组cDNA的DNA分子及其应用,所述DNA分子中,突变包括以下中的至少一种：(1)寨卡病毒全基因组cDNA的自5’末端起第8403-8405位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”；(2)寨卡病毒全基因组cDNA的自5’末端起第8481-8483位核苷酸由“GCT”突变为“TAG”；(3)寨卡病毒全基因组cDNA的自5’末端起第9348-9350位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”。本发明首次通过筛选获得了寨卡病毒非结构蛋白NS5中可引入非天然氨基酸的氨基酸残基位点；本发明的重组寨卡病毒的复制、感染和病毒蛋白表达受到非天然氨基酸的调控。(The invention relates to the technical field of biology, and discloses a DNA molecule of a mutant Zika virus whole genome cDNA and application thereof, wherein in the DNA molecule, the mutation comprises at least one of the following: (1) the 8403-8405 nucleotide from the 5' end of the Zika virus whole genome cDNA is mutated from GGG to TAG; (2) the 8481 st and 8483 th nucleotides from the 5 ' end of the Zika virus whole genome cDNA are mutated from ' GCT ' to ' TAG '; (3) the 9348-9350 nucleotides from the 5' end of the Zika virus whole genome cDNA were mutated from "GGG" to "TAG". The invention obtains the amino acid residue position which can introduce the unnatural amino acid in the Zika virus non-structural protein NS5 by screening for the first time; replication, infection, and viral protein expression of the recombinant Zika virus of the invention are regulated by unnatural amino acids.)

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种包含突变的寨卡病毒全基因组cDNA的DNA 分子、重组质粒、重组寨卡病毒及其构建方法以及它们在寨卡病毒疫苗中的应用。

背景技术

黄病毒属是一类有包膜的单股正链RNA病毒，包括多种重要人类传染病的病原体。近年来，以登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒和寨卡病毒等为代表的黄病毒感染流行呈现不断蔓延的趋势，且新发黄病毒病不断出现，因此已成为全球公共卫生健康的严重威胁。寨卡病毒自2007年以来先后在密克罗尼西亚联邦Yap岛、法属波利尼西亚和美洲地区出现爆发流行并进一步扩散至全球70多个国家和地区。寨卡病毒疫情的流行也伴随着新生儿小头畸形病例的大量出现。2016年2月，世界卫生组织正式宣布寨卡疫情构成“国际关注的突发公共卫生事件”。

寨卡病毒的基因组约为11kb，由两端的非编码区和内部的单一开放读码框构成，首先编码一个长的多聚蛋白，随后经宿主和病毒蛋白酶切割为3个结构蛋白(C、prM/M和E)和7 个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白主要负责病毒的组装和入侵，非结构蛋白参与病毒基因组的复制以及调控等过程。

利用非天然氨基酸的遗传密码子拓展是一门新兴化学生物学技术，能广泛应用于生命系统的蛋白质标记和修饰。该技术以氨酰tRNA合成酶-tRNA正交系统为基础，其中氨酰tRNA 合成酶将特定种类的非天然氨基酸转移到相应的tRNA上形成氨酰tRNA，而tRNA通过特异性识别无义密码子(例如琥珀终止密码子或者四碱基密码子)，将该非天然氨基酸插入到合成肽链中，具有特异性高、操作简单和反应条件温和等特点，非常适宜于在活细胞中改造和修饰生物大分子。目前该技术可用于原核细胞、真核细胞以及某些病毒蛋白的编辑和修饰，在病毒的定向改造、靶向调控和疫苗的合理设计和改造等方面都具有重要的应用价值。

目前，还没有报道非天然氨基酸靶向调控的条件感染性重组寨卡病毒，该重组病毒仅在非天然氨基酸存在的环境条件下才具备复制和感染能力，而获取这种条件感染性病毒在疫苗开发、病毒蛋白功能研究和病毒的功能改造等方面具有重要的意义，因此其研究开发具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种包含突变的寨卡病毒全基因组 cDNA的DNA分子及其应用。

本发明的发明人在研究过程中获得了多个寨卡病毒的反向遗传学系统，在此基础上，本发明的发明人将遗传密码子拓展和反向遗传学技术联合应用于寨卡病毒，通过将琥珀终止密码子引入寨卡病毒NS5的编码序列中，在表达氨酰tRNA合成酶和tRNA正交系统的细胞系中拯救获得重组寨卡病毒，使其仅在非天然氨基酸存在的环境条件下具备复制和感染能力，获得条件感染性的重组病毒，并评价了非天然氨基酸对病毒蛋白表达的调控效果。因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种包含突变的寨卡病毒全基因组cDNA的DNA 分子，其特征在于，所述突变包括以下中的至少一种：

(1)寨卡病毒全基因组cDNA的自5’末端起第8403-8405位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”；

(2)寨卡病毒全基因组cDNA的自5’末端起第8481-8483位核苷酸由“GCT”突变为“TAG”；

(3)寨卡病毒全基因组CDNA的自5’末端起第9348-9350位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”。

突变前的寨卡病毒全基因组cDNA(也即起始寨卡病毒全基因组cDNA)可以为各种常见的野生型寨卡病毒全基因组cDNA，例如，可以为寨卡病毒株FSS13025(Genbank No.KU955593)。

根据本发明的优选实施方式，所述DNA分子的核苷酸序列如第8403-8405位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”的SEQ ID NO:1所示、或第8481-8483位核苷酸由“GCT”突变为“TAG”的SEQ ID NO:1所示、或第9348-9350位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”的SEQ ID NO:1所示。

基于本发明提供的DNA分子，能够获得条件感染性的重组病毒，且该重组病毒受非天然氨基酸的调控。

第二方面，本发明提供了一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有第一方面所述的 DNA分子。

所述重组质粒还可以包括启动子等元件，根据本发明优选的实施方式，所述重组质粒的 5’末端起第1-10808位核苷酸为所述DNA分子，第10809-10875位核苷酸为所述丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis delta virus ribozyme，HDVr)序列，第10876-14403位核苷酸为pACYC177 载体序列，第14404-14421位核苷酸为启动子。

更优选地，所述启动子为T7启动子。

根据本发明的优选实施方式，所述重组质粒的核苷酸序列如第8403-8405位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”的SEQ ID NO:2所示、或第8481-8483位核苷酸由“GCT”突变为“TAG”的SEQ ID NO:2所示、或第9348-9350位核苷酸由“GGG”突变为“TAG”的SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供了一株重组寨卡病毒，其特征在于，该重组寨卡病毒的基因组 RNA对应的cDNA的核苷酸序列与第一方面所述的DNA分子的核苷酸序列相同。

第四方面，本发明提供了一种制备重组寨卡病毒的方法，其特征在于，该方法包括将第二方面所述的重组质粒进行体外转录，将得到的转录体RNA转染敏感细胞。优选地，所述敏感细胞为能够表达氨酰tRNA合成酶和相应tRNA的细胞，特别是能够表达氨酰tRNA合成酶和相应tRNA的Vero细胞或293T细胞(如Longlong SI等，Generation of influenza Aviruses as live but replication-incompetent virus vaccines，SCIENCE.2016年12月2日；354(6316):1170-1173.中记载的HEK293T转基因细胞或由相似方法构建的类似细胞)。

第五方面，本发明提供了一种构建重组寨卡病毒的方法，其特征在于，该方法包括将寨卡病毒的非结构蛋白NS5自N端起第246、272和561位氨基酸中的至少一个对应的密码子突变为UAG。

本发明中，起始寨卡病毒毒株(突变前)可以为野生型毒株，如寨卡病毒FSS13025(Genbank No.KU955593)。

第六方面，本发明提供了第三方面所述的重组寨卡病毒在寨卡病毒疫苗中的应用。

第七方面，本发明提供了第四方面或第五方面所述的方法在制备寨卡病毒疫苗中的应用。

理论上，遗传密码子拓展技术的发展能够将不同种类的非天然氨基酸引入病毒基因组中研究者感兴趣的任意位点，但不同种类的病毒结构及生物学特性差异较大，因此，在引入非天然氨基酸的同时需考虑其对病毒原始的理化特性和蛋白生物学功能的影响，而这种影响是不可预期的。本发明首次通过筛选获得了寨卡病毒非结构蛋白NS5中可引入非天然氨基酸的氨基酸残基位点，从而首次将遗传密码子拓展系统成功应用于虫媒黄病毒，获得非天然氨基酸调控的重组虫媒黄病毒；本发明的重组寨卡病毒的复制、感染和病毒蛋白表达受到非天然氨基酸的调控，因此能够为虫媒黄病毒的靶向调控和病毒蛋白的功能研究提供新的思路。

附图说明

图1为寨卡病毒全长基因组的cDNA结构示意图以及突变位点示意图；

图2为实施例2中293T细胞间接免疫荧光实验结果；

图3为实施例2中Vero细胞间接免疫荧光实验结果；

图4为实施例3中通过ELISA检测Vero细胞上清中病毒NS1蛋白表达的结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

携带氨酰tRNA合成酶和tRNA正交系统的Vero和293T细胞系来自北京大学医学部夏青教授课题组，参照Longlong SI等，Generation of influenza A viruses as livebut replication-incompetent virus vaccines，SCIENCE.2016年12月2日；354(6316):1170-1173.的补充材料中记载的方法构建得到。

携带寨卡病毒FSS13025基因组全长cDNA的质粒pFLZIKV来自美国德克萨斯大学医学院史佩勇教授课题组(Shan C et al,Cell Host Microbe,2016)。

室温指“25℃”。

实施例1

重组寨卡病毒的构建和拯救

重组寨卡病毒PTC22、PTC108、PTC153、PTC246、PTC272、PTC268、PTC389和PTC561为将寨卡病毒株FSS13025(Genbank No.KU955593)非结构蛋白NS5(SEQ ID NO:3)自N 端起第22、108、153、246、272、268、389和561位氨基酸对应的密码子突变为终止密码子 UAG，利用携带氨酰tRNA合成酶和tRNA正交系统的细胞系，获得受非天然氨基酸调控的、 NS5编码区携带终止密码子的重组寨卡病毒；寨卡病毒FSS13025的全长基因组对应的cDNA 克隆结构示意图以及突变位点示意图见图1。

基于寨卡病毒FSS13025反向遗传学系统拯救的恢复病毒RNA对应的cDNA序列如序列表的SEQ ID NO:1所示，自5’末端第1-107位核苷酸为5’UTR，第108-473位核苷酸为衣壳蛋白C的编码基因(C)，第474-977位核苷酸为膜蛋白及其前体prM/M的编码基因，第 978-2489位核苷酸为包膜糖蛋白E的编码基因，第2490-3545位核苷酸为非结构蛋白NS1的编码基因(NS1)，第3546-4613位核苷酸为非结构蛋白NS2的编码基因(NS2)，第4614-6464 位核苷酸为非结构蛋白NS3的编码基因(NS3)，第6465-7667位核苷酸为非结构蛋白NS4 的编码基因(NS4)，第7668-10376位核苷酸为非结构蛋白NS5的编码基因(NS5)，第 10380-10808位核苷酸为3’UTR。

具体步骤如下：

1)以携带SEQ ID NO:1所示双链DNA分子的载体pFLZIKV为模板(载体pFLZIKV 为SEQ ID NO:2所示的质粒，自5’末端第1-10808位核苷酸为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，第10809-10875位核苷酸为HDVr，第10876-14403位核苷酸为pACYC177载体，第 14404-14421位核苷酸为T7启动子)，设计扩增引物对FSS-NS5-246F/FSS-NS5-246R、 FSS-NS5-272F/FSS-NS5-272R、FSS-NS5-561F/FSS-NS5-561R、FSS-NS5-22F/FSS-NS5-22R、 FSS-NS5-108F/FSS-NS5-108R、FSS-NS5-153F/FSS-NS5-153R、FSS-NS5-268F/FSS-NS5-268R 和FSS-NS5-389F/FSS-NS5-389R，采用Q5点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit，NEB公司产品)，利用高保真DNA聚合酶扩增，分别得到携带8个密码子突变的质粒全长扩增产物：

FSS-NS5-246F：5’-GCGCATGGACtagCCCAGGAGGC-3’(SEQ ID NO:4)

FSS-NS5-246R：5’-CCCAAAAGGAGCTGGCTC-3’(SEQ ID NO:5)

FSS-NS5-272F：5’-CTGCGCTGAAtagCCCAACATGAAGATCATTGG-3’(SEQ ID NO:6)

FSS-NS5-272R：5’-CTTACCACAGCCCGCGTG-3’(SEQ ID NO:7)

FSS-NS5-561F：5’-AATGGAGAAAtagCACAGGGCCTTG-3’(SEQ ID NO:8)

FSS-NS5-561R：5’-TGGTTGGTGATTAGAGCTTC-3’(SEQ ID NO:9)

FSS-NS5-22F：5’-GATGTCGGCCtagGAGTTCTACTCCTACAAAAAG(SEQ ID NO:10)

FSS-NS5-22R：5’-TGGTTCAGGCGGGCCTTC(SEQ ID NO:11)

FSS-NS5-108F：5’-AAAAGGAGGCtagGGTCATGAAGAAC(SEQ ID NO:12)

FSS-NS5-108R：5’-GTGTATCCTTTCACTTCTTG(SEQ ID NO:13)

FSS-NS5-153F：5’-GTCATCATCTtagCCTGAAGTGGAAGAAG(SEQ ID NO:14)

FSS-NS5-153R：5’-TCACCTATATCACACAGC(SEQ ID NO:15)

FSS-NS5-268F：5’-GGCTGTGGTAtagTGCGCTGAAGCTCCCAACATGAAGATC(SEQ ID NO:16)

FSS-NS5-268R：5’-CGCGTGCCAGAGCCGAGA(SEQ ID NO:17)

FSS-NS5-389F：5’-GTTAGGCAAAtagAAACGGCCAC(SEQ ID NO:18)

FSS-NS5-389R：5’-TCTTTCCACAACCAGGAAG(SEQ ID NO:19)

分别将上述得到的8个携带琥珀终止密码子的寨卡病毒全长DNA片段使用Q5点突变试剂盒中的KLD酶混合液进行连接(KLD酶混合液中包括连接酶和DpnI)，将连接产物转化HB101感受态细胞，挑取正确的克隆，得到重组质粒pFLZIKV-NS5-246、pFLZIKV-NS5-272、pFLZIKV-NS5-561、pFLZIKV-NS5-22、pFLZIKV-NS5-108、pFLZIKV-NS5-153、 pFLZIKV-NS5-268和pFLZIKV-NS5-389。

结果如下：重组质粒pFLZIKV-NS5-246、pFLZIKV-NS5-272和pFLZIKV-NS5-561分别为将pFLZIKV载体的SEQ ID NO:1片段替换成命名为A246、A272、A561的双链DNA分子得到的质粒，其A246为将SEQ ID NO:1所示的核苷酸自5’末端8403-8405位核苷酸由“ggg”突变为“tag”得到的序列，A272为将SEQ ID NO:1所示的核苷酸自5’末端8481-8483位核苷酸由“gct”突变为“tag”得到的序列，A561为将SEQ ID NO:1所示的核苷酸自5’末端 9348-9350位核苷酸由“ggg”突变为“tag”得到的序列。类似地，pFLZIKV-NS5-22、 pFLZIKV-NS5-108、pFLZIKV-NS5-153、pFLZIKV-NS5-268和pFLZIKV-NS5-389分别为 pFLZIKV载体的SEQ IDNO:1对应的序列自5’末端7731-7733位、7989-7991位、8124-8126 位、8469-8471位、8832-8834位核苷酸突变为“tag”得到的序列。

2)用限制性内切酶ClaI酶切重组质粒pFLZIKV-NS5-22、pFLZIKV-NS5-108、pFLZIKV-NS5-153、pFLZIKV-NS5-268、pFLZIKV-NS5-389、pFLZIKV-NS5-246、 pFLZIKV-NS5-272和pFLZIKV-NS5-561，用酚氯仿纯化回收线性化产物；以线性化的质粒为模板，采用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production System-T7(Promega公司产品)，按说明书进行体外转录，转录体RNA采用RNA Mini Kit试剂盒进行纯化后，将RNA 定量并分装后置于-80℃冻存待用。

用Lipofectamine^TMMessengerMAX^TM(Invitrogen公司产品)将上述得到的转录体RNA 分别转染携带表达氨酰tRNA合成酶和相应tRNA的Vero(Vero-tRNA/pylRS)以及293T(HEK293T-tRNA/pylRS)细胞系，方法如下：将能够表达氨酰tRNA合成酶和相应tRNA的细胞接种至24孔板中，在37℃，5％CO₂条件下过夜培养至细胞密度为80％；将1μlMessengerMAX^TMReagent和25μl Opti-MEM^TM培养基轻轻混匀，室温静置10min后与1μg重组寨卡病毒转录体RNA和25μl的Opti-MEM^TM培养基轻轻混匀，室温静置5min；将混合液加入到24孔板的1个孔中，补加150μl的Opti-MEM^TM培养基以及终浓度为4mM的非天然氨基酸(Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸，NAEK，下同)，每孔用1ml的PBS溶液充分洗涤细胞2次后，置于37℃、5％CO₂条件下孵育6h，移去上清并补加含2％FBS的DMEM培养基以及终浓度为4mM的非天然氨基酸，3天后收集上清，即为非天然氨基酸调控的重组寨卡病毒。

实施例2

重组寨卡病毒对细胞的感染率

将携带氨酰tRNA合成酶和tRNA正交系统的293T或Vero细胞传至预先放有盖玻片的 24孔板中，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞密度为80％。将1μg重组寨卡病毒RNA转染细胞，转染方法同实施例1。在转染后48h将盖玻片取出，置于固定液(丙酮：甲醇体积比为3:7)中固定30min，晾干后保存于-20℃冰箱密封，即为抗原片。

采用寨卡病毒E蛋白单抗通过间接免疫荧光实验对细胞中的病毒蛋白进行检测。方法如下：将寨卡病毒E蛋白单抗(BioFront公司产品)用PBS缓冲液按1:1500稀释后，与抗原片中的细胞在37℃孵育约1.5h，用PBS缓冲液(10mM K₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)振荡洗涤3次，每次10min；在病毒抗原片上加入用PBS缓冲液1:200 倍稀释的Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃作用1h，然后将病毒抗原玻片放入 PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次5min，将DAPI(6-二脒基-2-苯基吲哚)稀释为终浓度为 100ng/ml，与抗原片细胞室温孵育约4min后弃去，用PBS缓冲液洗涤5min，荧光显微镜下观察结果。以未加入非天然氨基酸的细胞作为阴性对照。

间接免疫荧光的结果见图2(293T细胞)和图3(Vero细胞)。WT代表寨卡病毒FSS13025， PTC246、PTC272和PCT561分别代表3种基因组编码区携带终止密码子、受非天然氨基酸调控的重组病毒(也即实施例1获得的重组寨卡病毒)。除寨卡病毒FSS13025外，未加入非天然氨基酸的阴性对照均不能在相应细胞中表达寨卡病毒包膜糖蛋白(未观察到红色荧光)，但PTC246、PTC272和PCT561均能够在4mM非天然氨基酸浓度下在相应细胞中表达寨卡病毒包膜糖蛋白，说明3种重组病毒在非天然氨基酸存在的环境条件下才具备复制和感染能力，为条件感染性的重组病毒，另外5种重组质粒转染细胞后均未检测到病毒蛋白的表达，因此非天然氨基酸仅被成功引入到NS5蛋白的第246、272和561位氨基酸。

实施例3

重组寨卡病毒的NS1蛋白表达特征

将携带氨酰tRNA合成酶和tRNA正交系统的Vero细胞传至预先放有盖玻片的24孔板中，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞密度为80％。将1μg重组寨卡病毒RNA转染细胞，转染方法同实施例1。分别收集转染后24h、48h与72h的细胞培养上清，置于-80℃保存备用。

使用购自BioFront公司的ELISA试剂盒(BioFront MonoTrace^TMZika Virus NS1ELISA Kit)测定不同时间点细胞上清中寨卡病毒NS1蛋白的表达量，方法如下：取细胞培养上清，等体积加入细胞裂解缓冲液(Cell lysis buffer)，37℃孵育30min后，以18000rcf/min的转速离心2min；等体积加入样品稀释缓冲液(Sample diluent buffer)稀释样品；取稀释好的样品 100μl，加入到包被好的孔中(包括标准品)，37℃孵育30min；弃去孔中的内容物，每孔加入200μl的洗涤液(Wash buffer)洗涤3次，每次15s；每孔加入100μl的一抗(CON：anti-NS1 HRP-conjugate)，37℃避光孵育30min；弃去孔中的内容物，每孔加入200μl的洗涤液，洗涤3次，每次15s；每孔加入100μl的二抗(SUB：High sensitivity TMBsubstrate)，37℃避光孵育10min；每孔加入100μl的终止液(STOP：HRP quench solution)；将酶标板置于酶标仪中，450nm波长下读取数据。

ELISA结果见图4。在4mM非天然氨基酸浓度下，PTC246、PTC272和PTC561能够在表达氨酰tRNA合成酶和tRNA的细胞系中表达寨卡病毒NS1蛋白，在转染重组病毒RNA 的24h、48h和72h后，其NS1蛋白表达量随着转染时间延长呈现明显增长的趋势，在未加入非天然氨基酸的细胞上清中未观察到NS1蛋白表达水平的变化，且在转染后48h和72h，加入和未加入非天然氨基酸的细胞上清中NS1的表达量存在明显的差异。说明本发明的重组寨卡病毒的蛋白表达受到非天然氨基酸的调控。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

本发明涉及的序列：

SEQ ID NO:1(起始病毒RNA对应的cDNA序列，10808bp)

SEQ ID NO:2(载体pFLZIKV的DNA序列，14421bp)

SEQ ID NO:3(非结构蛋白NS5的氨基酸序列)

GGGTGETLGEKWKARLNQMSALEFYSYKKSGITEVCREEARRALKDGVATGGHAVSRGSAKLRWLVERGYLQPYGKVIDLGCGRGGWSYYA ATIRKVQEVKGYTKGGPGHEEPMLVQSYGWNIVRLKSGVDVFHMAAEPCDTLLCDIGESSSSPEVEEARTLRVLSMVGDWLEKRPGAFCIK VLCPYTSTMMETLERLQRRYGGGLVRVPLSRNSTHEMYWVSGAKSNTIKSVSTTSQLLLGRMDGPRRPVKYEEDVNLGSGTRAVVSCAEAP NMKIIGNRIERIRSEHAETWFFDENHPYRTWAYHGSYEAPTQGSASSLINGVVRLLSKPWDVVTGVTGIAMTDTTPYGQQRVFKEKVDTRV PDPQEGTRQVMSMVSSWLWKELGKHKRPRVCTKEEFINKVRSNAALGAIFEEEKEWKTAVEAVNDPRFWALVDKEREHHLRGECQSCVYNM MGKREKKQGEFGKAKGSRAIWYMWLGARFLEFEALGFLNEDHWMGRENSGGGVEGLGLQRLGYVLEEMSRIPGGRMYADDTAGWDTRISRF DLENEALITNQMEKGHRALALAIIKYTYQNKVVKVLRPAEKGKTVMDIISRQDQRGSGQVVTYALNTFTNLVVQLIRNMEAEEVLEMQDLW LLRRSEKVTNWLQSNGWDRLKRMAVSGDDCVVKPIDDRFAHALRFLNDMGKVRKDTQEWKPSTGWDNWEEVPFCSHHFNKLHLKDGRSIVV PCRHQDELIGRARVSPGAGWSIRETACLAKSYAQMWQLLYFHRRDLRLMANAICSSVPVDWVPTGRTTWSIHGKGEWMTTEDMLVVWNRVWIEENDHMEDKTPVTKWTDIPYLGKREDLWCGSLIGHRPRTTWAENIKNTVNMMRRIIGDEEKYVDYLSTQVRYLGEEGSTPGVL 。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 包含突变的寨卡病毒全基因组cDNA的DNA分子及其应用

<130> I62385JSY

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10808

<212> DNA

<213> Zika virus

<400> 1

agttgttgat ctgtgtgaat cagactgcga cagttcgagt ttgaagcgaa agctagcaac 60

agtatcaaca ggttttattt tggatttgga aacgagagtt tctggtcatg aaaaacccaa 120

agaagaaatc cggaggattc cggattgtca atatgctaaa acgcggagta gcccgtgtga 180

gcccctttgg gggcttgaag aggctgccag ccggacttct gctgggtcat gggcccatca 240

ggatggtctt ggcgattcta gcctttttga gattcacggc aatcaagcca tcactgggtc 300

tcatcaatag atggggttca gtggggaaaa aagaggctat ggaaataata aagaagttta 360

agaaagatct ggctgccatg ctgagaataa tcaatgctag gaaggagaag aagagacgag 420

gcacagatac tagtgtcgga attgttggcc tcctgctgac cacagccatg gcagtggagg 480

tcactagacg tgggaatgca tactatatgt acttggacag aagcgatgct ggggaggcca 540

tatcttttcc aaccacaatg gggatgaata agtgttatat acagatcatg gatcttggac 600

acatgtgtga tgccaccatg agctatgaat gccctatgct ggatgagggg gtagaaccag 660

atgacgtcga ttgttggtgc aacacgacgt caacttgggt tgtgtacgga acctgccacc 720

acaaaaaagg tgaagcacgg agatctagaa gagctgtgac gctcccctcc cattccacta 780

ggaagctgca aacgcggtcg cagacctggt tggaatcaag agaatacaca aagcacctga 840

ttagagtcga aaattggata ttcaggaacc ctggcttcgc gttagcagca gctgccatcg 900

cttggctttt gggaagctca acgagccaaa aagtcatata cttggtcatg atactgctga 960

ttgccccggc atacagcatc aggtgcatag gagtcagcaa tagggacttt gtggaaggta 1020

tgtcaggtgg gacttgggtt gatgttgtct tggaacatgg aggttgtgtt accgtaatgg 1080

cacaggacaa accgactgtc gacatagagc tggttacaac aacagtcagc aacatggcgg 1140

aggtaagatc ctactgctat gaggcatcaa tatcggacat ggcttcggac agccgctgcc 1200

caacacaagg tgaagcctac cttgacaagc aatcagacac tcaatatgtc tgcaaaagaa 1260

cgttagtgga cagaggctgg ggaaatggat gtggactttt tggcaaaggg agcctggtga 1320

catgcgctaa gtttgcttgc tctaagaaaa tgaccgggaa gagcatccag ccagagaatc 1380

tggagtaccg gataatgctg tcagttcatg gctcccagca cagtgggatg atcgttaatg 1440

atacaggaca tgaaactgat gagaatagag cgaaggttga gataacgccc aattcaccaa 1500

gagccgaagc caccctgggg ggttttggaa gcctaggact tgattgtgaa ccgaggacag 1560

gccttgactt ttcagatttg tattacttga ctatgaataa caagcactgg ttggttcaca 1620

aggagtggtt ccacgacatt ccattacctt ggcacgctgg ggcagacacc ggaactccac 1680

actggaacaa caaagaagca ctggtagagt tcaaggacgc acatgccaaa aggcagactg 1740

tcgtggttct agggagtcaa gaaggagcag ttcacacggc ccttgctgga gctctggagg 1800

ctgagatgga tggtgcaaag ggaaggctgt cctctggcca cttgaaatgt cgcctgaaaa 1860

tggacaaact tagattgaag ggcgtgtcat actccttgtg taccgcagcg ttcacattca 1920

ctaagatccc ggctgaaaca ctgcacggga cagtcacagt ggaggtacag tacgcaggga 1980

cagatggacc ttgcaaggtt ccagctcaga tggcggtgga catgcaaact ctgaccccag 2040

ttgggaggtt gataaccgct aaccctgtaa tcactgaaag cactgagaac tccaagatga 2100

tgctggaact ggatccacca tttggggact cttacattgt cataggagtc ggggaaaaga 2160

agatcaccca ccactggcac aggagtggca gcaccattgg aaaagcattt gaagccactg 2220

tgagaggtgc caagagaatg gcagtcttgg gagacacagc ctgggacttt ggatcagttg 2280

ggggtgctct caactcactg ggcaagggca tccatcaaat ttttggagca gctttcaaat 2340

cattgtttgg aggaatgtcc tggttctcac aaattctcat tggaacgttg ctggtgtggt 2400

tgggtctgaa tacaaagaat ggatctattt cccttatgtg cttggcctta gggggagtgt 2460

tgatcttctt atccacagcc gtctctgctg atgtggggtg ctcggtggac ttctcaaaga 2520

aggaaacgag atgcggtaca ggggtgttcg tctataacga cgttgaagct tggagggaca 2580

ggtacaagta ccatcctgac tcccctcgta gattggcagc agcagtcaag caagcctggg 2640

aagatgggat ctgtgggatc tcctctgttt caagaatgga aaacatcatg tggagatcag 2700

tagaagggga gctcaacgca atcctggaag agaatggagt tcaactgacg gtcgttgtgg 2760

gatctgtaaa aaaccccatg tggagaggtc cacagagatt gcccgtgcct gtgaacgagc 2820

tgccccatgg ctggaaggct tgggggaaat cgtacttcgt cagggcagca aagacaaata 2880

acagctttgt cgtggatggt gacacactga aggaatgccc actcaaacat agagcatgga 2940

acagctttct tgtggaggat catgggttcg gggtatttca cactagtgtc tggctcaagg 3000

ttagagaaga ttattcatta gagtgtgatc cagccgtcat tggaacagcc gctaagggaa 3060

aggaggctgt gcacagtgat ctaggctact ggattgagag tgagaagaac gacacatgga 3120

ggctgaagag ggcccacctg atcgagatga aaacatgtga atggccaaag tcccacacat 3180

tgtggacaga tggaatagaa gaaagtgatc tgatcatacc caagtcttta gctgggccac 3240

tcagccatca caacaccaga gagggctaca ggacccaaat gaaagggcca tggcatagtg 3300

aagagcttga aattcggttt gaggaatgcc caggcactaa ggtccacgtg gaggaaacat 3360

gtggaacaag aggaccatct ctgagatcaa ccactgcaag cggaagggtg atcgaggaat 3420

ggtgctgcag ggagtgcaca atgcccccac tgtcgttccg ggctaaagat ggttgttggt 3480

atggaatgga gataaggccc aggaaagaac cagaaagtaa cttagtaagg tcaatggtga 3540

ctgcaggatc aactgatcac atggatcact tctcccttgg agtgcttgtg attctgctca 3600

tggtacagga agggctaaag aagagaatga ccacaaagat catcataagc acatcaatgg 3660

cagtgctggt agctatgatc ctgggaggat tttcaatgag tgacctggct aagcttgcaa 3720

ttttgatggg tgccaccttc gcggaaatga acactggagg agatgttgct catctggcgc 3780

tgatagcggc attcaaagtc agacctgcgt tgctggtatc tttcattttc agagctaatt 3840

ggacaccccg tgagagcatg ctgctggcct tggcctcgtg tcttctgcaa actgcgatct 3900

ccgccttgga aggcgacctg atggttccca tcaatggttt tgctttggcc tggttggcaa 3960

tacgagcgat ggttgttcca cgcactgaca acatcacctt ggcaatcctg gctgctctga 4020

caccactggc ccggggcaca ctgcttgtgg cgtggagagc aggccttgct acttgcgggg 4080

ggttcatgct cctttctctg aaggggaaag gcagtgtgaa gaagaactta ccatttgtca 4140

tggccctggg actaaccgct gtgaggctgg tcgaccccat caacgtggtg ggactgctgt 4200

tgctcacaag gagtgggaag cggagctggc cccctagtga agtactcaca gctgttggcc 4260

tgatatgcgc attggctgga gggttcgcca aggcggatat agagatggct gggcccatgg 4320

ccgcggtcgg tctgctaatt gtcagttacg tggtctcagg aaagagtgtg gacatgtaca 4380

ttgaaagagc aggtgacatc acatgggaaa aagatgcgga agtcactgga aacagtcccc 4440

ggctcgatgt ggcactagat gagagtggtg atttctccct agtggaggat gatggtcccc 4500

ccatgagaga gatcatactc aaagtggtcc tgatggccat ctgtggcatg aacccaatag 4560

ccataccctt tgcagctgga gcgtggtacg tgtatgtgaa gactggaaaa aggagtggtg 4620

ctctatggga tgtgcctgct cccaaggaag taaaaaaggg ggagaccaca gatggagtgt 4680

acagagtaat gactcgtaga ctgctaggtt caacacaagt tggagtggga gtcatgcaag 4740

agggggtctt ccacactatg tggcacgtca caaaaggatc cgcgctgaga agcggtgaag 4800

ggagacttga tccatactgg ggagatgtca agcaggatct ggtgtcatac tgtggtccat 4860

ggaagctaga tgccgcctgg gacgggcaca gcgaggtgca gctcttggcc gtgccccccg 4920

gagagagagc gaggaacatc cagactctgc ccggaatatt taagacaaag gatggggaca 4980

ttggagcagt tgcgctggac tacccagcag gaacttcagg atctccaatc ctagataagt 5040

gtgggagagt gataggactc tatggtaatg gggtcgtgat caaaaatggg agttacgtta 5100

gtgccatcac ccaagggagg agggaggaag agactcctgt tgagtgcttc gagccttcga 5160

tgctgaagaa gaagcagcta actgtcttag acttgcatcc tggagctggg aaaaccagga 5220

gagttcttcc tgaaatagtc cgtgaagcca taaaaacaag actccgcact gtgatcttag 5280

ctccaaccag ggttgtcgct gctgaaatgg aggaagccct tagagggctt ccagtgcgtt 5340

atatgacaac agcagtcaat gtcacccatt ctgggacaga aatcgttgac ttaatgtgcc 5400

atgccacctt cacttcacgt ctactacagc caatcagagt ccccaactat aatctgtata 5460

ttatggatga ggcccacttc acagatccct caagtatagc agcaagagga tacatttcaa 5520

caagggttga gatgggcgag gcggctgcca tcttcatgac tgccacgcca ccaggaaccc 5580

gtgacgcatt cccggactcc aactcaccaa ttatggacac cgaagtggaa gtcccagaga 5640

gagcctggag ctcaggcttt gattgggtga cggatcattc tggaaaaaca gtttggtttg 5700

ttccaagcgt gaggaatggc aatgagatcg cagcttgtct gacaaaggct ggaaaacggg 5760

tcatacagct cagcagaaag acttttgaga cagagttcca gaaaacaaaa catcaagagt 5820

gggacttcgt cgtgacaact gacatttcag agatgggcgc caactttaaa gctgaccgtg 5880

tcatagattc caggagatgc ctaaagccgg tcatacttga tggcgagaga gtcattctgg 5940

ctggacccat gcctgtcaca catgccagcg ctgcccagag gagggggcgc ataggcagga 6000

accccaacaa acctggagat gagtatctgt atggaggtgg gtgcgcagag actgatgaag 6060

accatgcaca ctggcttgaa gcaagaatgc ttcttgacaa catttacctc caagatggcc 6120

tcatagcctc gctctatcga cctgaggccg acaaagtagc agctattgag ggagagttca 6180

agcttaggac ggagcaaagg aagacctttg tggaactcat gaaaagagga gatcttcctg 6240

tttggctggc ctatcaggtt gcatctgccg gaataaccta cacagataga agatggtgct 6300

ttgatggcac gaccaacaac accataatgg aagacagtgt gccggcagag gtgtggacca 6360

gatacggaga gaaaagagtg ctcaaaccga ggtggatgga cgccagagtt tgttcagatc 6420

atgcggccct gaagtcattc aaagagtttg ccgctgggaa aagaggagcg gcctttggag 6480

tgatggaagc cctgggaaca ctgccaggac atatgacaga gagattccag gaggccattg 6540

acaacctcgc tgtgctcatg cgggcagaga ctggaagcag gccctacaaa gccgcggcgg 6600

cccaattacc ggagacccta gagactatca tgcttttggg gttgctggga acagtctcgc 6660

tgggaatctt tttcgtcttg atgcggaaca agggcatagg gaagatgggc tttggaatgg 6720

tgactcttgg ggccagcgca tggcttatgt ggctctcgga aattgagcca gccagaattg 6780

catgtgtcct cattgttgtg ttcctattgc tggtggtgct catacctgag ccagaaaagc 6840

aaagatctcc ccaggacaac caaatggcaa tcatcatcat ggtagcagtg ggtcttctgg 6900

gcttgattac cgccaatgaa ctcggatggt tggagagaac aaagagtgac ctaagccatc 6960

taatgggaag gagagaggag ggggcaacta taggattctc aatggacatt gacctgcggc 7020

cagcctcagc ttgggctatc tatgctgctc tgacaacttt cattacccca gccgtccaac 7080

atgcagtgac cacttcatac aacaactact ccttaatggc gatggccacg caagctggag 7140

tgttgttcgg tatgggtaaa gggatgccat tctatgcatg ggactttgga gtcccgctgc 7200

taatgatagg ttgctactca caattaacac ccctgaccct aatagtggcc atcattttgc 7260

tcgtggcgca ctacatgtac ttgatcccag ggctgcaggc agcagctgcg cgtgctgccc 7320

agaagagaac ggcagctggc atcatgaaga accctgttgt ggatggaata gtggtgactg 7380

acattgacac aatgacaatt gacccccaag tggagaaaaa gatgggacag gtgctactca 7440

tagcagtagc tgtctccagc gccatactgt cgcggaccgc ctgggggtgg ggtgaggctg 7500

gggccctgat cacagctgca acttccactt tgtgggaggg ctctccgaac aagtactgga 7560

actcctccac agccacctca ctgtgtaaca tttttagggg aagctacttg gctggagctt 7620

ctctaatcta cacagtaaca agaaacgctg gcttggtcaa gagacgtggg ggtggaacgg 7680

gagagaccct gggagagaaa tggaaggccc gcctgaacca gatgtcggcc ctggagttct 7740

actcctacaa aaagtcaggc atcaccgagg tgtgcagaga agaggcccgc cgcgccctca 7800

aggacggtgt ggcaacggga ggccacgctg tgtcccgagg aagtgcaaag ctgagatggt 7860

tggtggagag gggatacctg cagccctatg gaaaggtcat tgatcttgga tgtggcagag 7920

ggggctggag ttactatgcc gccaccatcc gcaaagttca agaagtgaaa ggatacacaa 7980

aaggaggccc tggtcatgaa gaacccatgt tggtgcaaag ctatgggtgg aacatagtcc 8040

gtcttaagag tggggtggac gtctttcata tggcggctga gccgtgtgac acgttgctgt 8100

gtgatatagg tgagtcatca tctagtcctg aagtggaaga agcacggacg ctcagagtcc 8160

tctccatggt gggggattgg cttgaaaaaa gaccaggagc cttttgtata aaagtgttgt 8220

gcccatacac cagcactatg atggaaaccc tggagcgact gcagcgtagg tatgggggag 8280

gactggtcag agtgccactc tcccgcaact ctacacatga gatgtactgg gtctctggag 8340

cgaaaagcaa caccataaaa agtgtgtcca ccacgagcca gctccttttg gggcgcatgg 8400

acgggcccag gaggccagtg aaatatgaag aggatgtgaa tctcggctct ggcacgcggg 8460

ctgtggtaag ctgcgctgaa gctcccaaca tgaagatcat tggtaaccgc attgagagga 8520

tccgcagtga gcacgcggaa acgtggttct ttgacgagaa ccacccatat aggacatggg 8580

cttaccatgg aagctacgag gcccccacac aagggtcagc gtcctctcta ataaacgggg 8640

ttgtcaggct cctgtcaaaa ccctgggatg tggtgactgg agtcacagga atagccatga 8700

ccgacaccac accgtatggt cagcaaagag ttttcaagga aaaagtggac actagggtgc 8760

cagaccccca agaaggcact cgtcaggtta tgagcatggt ctcttcctgg ttgtggaaag 8820

agttaggcaa acacaaacgg ccacgagtct gtaccaaaga agagttcatc aacaaggttc 8880

gtagcaacgc agcattaggg gcaatatttg aagaggaaaa agagtggaag actgcagtgg 8940

aagctgtgaa cgatccaagg ttctgggctc tagtggacaa ggaaagagag caccacctga 9000

gaggagagtg ccagagctgt gtgtacaaca tgatgggaaa aagagaaaag aaacaagggg 9060

aatttggaaa ggccaagggc agccgcgcca tctggtacat gtggctaggg gctagatttc 9120

tagagttcga agcccttgga ttcttgaacg aggatcactg gatggggaga gagaattcag 9180

gaggtggtgt tgaagggcta ggattacaaa gactcggata tgtcttagaa gagatgagtc 9240

gcataccagg aggaaggatg tatgcagatg atactgctgg ctgggacacc cgcatcagca 9300

ggtttgatct ggagaatgaa gctctaatca ccaaccaaat ggagaaaggg cacagggcct 9360

tggcattggc cataatcaag tacacatacc aaaacaaagt ggtaaaggtc cttagaccag 9420

ctgaaaaagg gaagacagtt atggacatta tttcaagaca agaccaaagg gggagcggac 9480

aagttgtcac ttacgctctt aatacattta ccaacctagt ggtgcagctc attcggaata 9540

tggaggctga ggaagttcta gagatgcaag acttgtggct gctgcggagg tcagagaaag 9600

tgaccaactg gttgcagagc aatggatggg ataggctcaa acgaatggca gtcagtggag 9660

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gggcgggatg gagcatccgg gagactgctt gcctagcaaa atcatatgcg caaatgtggc 9960

agctccttta tttccacaga agggacctcc gactgatggc caatgccatt tgttcatctg 10020

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ggatgaccac tgaagacatg cttgtggtgt ggaacagagt gtggattgag gagaacgacc 10140

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aagacttgtg gtgtgggtct ctcatagggc acagaccgcg caccacctgg gctgagaaca 10260

ttaaaaacac agtcaacatg atgcgtagga tcataggtga tgaagaaaag tacgtggact 10320

acctatccac ccaagttcgc tacttgggcg aagaagggtc cacacctgga gtgctataag 10380

caccaatctt agtgttgtca ggcctgctag tcagccacag cttggggaaa gctgtgcagc 10440

ctgtgacccc cccaggagaa gctgggaaac caagcccata gtcaggccga gaacgccatg 10500

gcacggaaga agccatgctg cctgtgagcc cctcagagga cactgagtca aaaaacccca 10560

cgcgcttgga ggcgcaggat gggaaaagaa ggtggcgacc ttccccaccc tttaatctgg 10620

ggcctgaact ggagatcagc tgtggatctc cagaagaggg actagtggtt agaggagacc 10680

ccccggaaaa cgcaaaacag catattgacg ctgggaaaga ccagagactc catgagtttc 10740

caccacgctg gccgccaggc acagatcgcc gaatagcggc ggccggtgtg gggaaatcca 10800

tggtttct 10808

<210> 2

<211> 14421

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 2