用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株
阅读说明：本技术 用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株 (Molecular chaperone expression vector and strain for improving secretion expression of phytase in pichia pastoris ) 是由 江民华 李阳源 黄江 何小梅 边叶雨 贺金玲 陈丽芝 陈琼银 黄佳乐 于 2021-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程领域,具体涉及用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株。所述表达载体包括串联的分子伴侣基因BIP和PDI,或者串联的分子伴侣基因VHB和PDI,或者串联的分子伴侣基因HACI和PDI。将经基因工程改造筛选得到的包含上述表达载体的耐高温植酸酶高酶活表达菌株V28-VTR-001,50L发酵总酶活达到37239U/mL的重组毕赤酵母。(The invention relates to the field of genetic engineering, in particular to a molecular chaperone expression vector and a strain for improving the secretory expression of phytase in pichia pastoris. The expression vector comprises tandem molecular chaperone genes BIP and PDI, or tandem molecular chaperone genes VHB and PDI, or tandem molecular chaperone genes HACI and PDI. The high-temperature resistant phytase high-enzyme activity expression strain V28-VTR-001 obtained by screening through genetic engineering modification and containing the expression vector is fermented into recombinant pichia pastoris with total enzyme activity of 37239U/mL by 50L.)
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株。
背景技术
谷类、豆科类等作物是食品和动物饲料的主要原料。原料中50％～70％的磷是 以植酸磷的形式存在。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率较低，造 成大量磷的浪费和污染。
植酸酶能将植酸水解成肌醇和磷酸，在饲料中添加植酸酶不仅可以提高饲料中磷的利用率、减少粪便中磷对环境的污染，还可以降低植酸盐的抗营养作用，增加 动物对蛋白质和微量元素的吸收能力，是必不可少的饲料添加剂。高的发酵酶活和 优良的耐热性是植酸酶在饲料行业高效应用的前提和保障，因此，从自然界寻找或 通过分子改造等方法筛选高酶活的耐高温植酸酶成为目前饲料行业研究的热点。目 的蛋白与分子伴侣共表达是提高目标蛋白表达量的重要手段之一，也是提高植酸酶 酶活的非常重要的途径。
分子伴侣又称辅助蛋白，它是一类细胞内对蛋白质翻译、转运、折叠及修饰都 具有重要作用的蛋白质分子。大量研究表明分子伴侣对外源蛋白的分泌表达有着重 要意义，其主要作用是辅助蛋白质的正确折叠，减少由于蛋白质错误折叠而导致的 降解，从而提高蛋白质的分泌表达。分子伴侣主要来源于哺乳动物、原核和真核细 胞，少数来源于植物。分布的器官主要有内质网、细胞质、细胞核、胞浆以及线粒 体和叶绿体。
巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一种相对简单的真核表达系统，可以对外源重组蛋白质进行正确的折叠加工、糖基化修饰等，使用AOX1强启动子，以甲醇作为 碳源，实现了多种外源蛋白的高效表达，因而在外源蛋白表达领域得到广泛的利用。 研究表明，不同的外源蛋白在毕赤酵母表达系统中表达时有不同的折叠蛋白响应效 应和翻译后修饰的机制。
目前文献报道中，常用的分子伴侣有BIP、二硫键异构酶PDI(Protein disulfideisomerase)、EROI、内质网响应蛋白HACI、透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobingene VHb)、SSAI等。
Bip是最重要的Hsp70伴侣蛋白，是ER功能的主要调节者之一，对维持内质网 的稳态必不可少，对促进蛋白质的正确折叠至关重要。Bip具有ATP酶活性，Bip与 特定的内质网定位蛋白ERdjs相互作用，刺激Bip与底物结合。
当蛋白高水平表达时，未经折叠的蛋白质容易于内质网中错误折叠和累积，内 质网主要通过UPR进行调控，UPR激活调控因子HACI，可促进UPR相关蛋白质 及分子伴侣的高水平表达，介导蛋白质的正确折叠和分泌，将内质网中错误折叠的 蛋白进行降解等。
EROI在内质网中将还原态的蛋白二硫键异构酶PDI修饰成氧化态，PDI的氧 化活性帮助蛋白形成正确的折叠结构而分泌到胞外，对内质网腔内蛋白质二硫键的 形成具有促进作用，且EROI、PDI两种分子伴侣都负责内质网氧化蛋白的折叠。分 子伴侣如PDI1，也属于蛋白二硫化物异构酶，是内质网腔中多功能分子伴侣。
二硫键异构酶PDI(Protein disulfide isomerase)主要位于内质网中，是一种重要的折叠催化剂，特别是对含二硫键的蛋白的折叠发挥重要的作用。PDI同时具有氧 化活性和异构活性，既能帮助蛋白质形成二硫键，又能使错误配对的二硫键进行重 新排列。
分子伴侣在基因工程菌中具有广泛的应用。不同蛋白在毕赤酵母中表达时对分子伴侣具有选择性，杜济良研究了10种不同定位的分子伴侣对外源蛋白葡聚糖酶 (EXG1)在巴斯德毕赤酵母中表达的影响，结果表明BIP、EROI、PDI、HACI在 外源蛋白葡聚糖酶(EXG1)表达过程中有重要作用，其中BIP共表达菌株使EXG1 的表达量提高了2倍。目前文献报道中主要是目标蛋白与单独的分子伴侣进行共表 达，极少数与多种分子伴侣同时进行共表达，且表达量提高不显著。闵琪等采用简 单串连的方式将HACI与不同的分子伴侣分别进行组合，与甘露聚糖酶进行共表达， 结果发现这些分子伴侣组合没有显著提高甘露聚糖酶的表达量，且分子伴侣组合效 果均比单一的HACI的效果差。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体。
本发明的再一目的是提供能够高效表达植酸酶的重组菌株。
本发明的再一目的是提供利用提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的方法。
根据本发明的提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体，所述表达载体包括串联的分子伴侣基因BIP和PDI，或者串联的分子伴侣基因VHB和PDI，或者串联的分子伴侣基因HACI和PDI。
根据本发明的提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体，其中，分子伴侣基因BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因PDI的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，分子伴侣基因VHB的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，分 子伴侣基因HACI的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID NO：1
Atgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccatttgctaaacctgttagagctgacgatgtc gaatcttatggaacagtgattggtatcgatttgggtaccacgtactcttgtgtcggtgtgatgaagtcgggtcgtgtagaaattcttgctaatgaccaaggt aacagaatcactccttcctacgttagtttcactgaagacgagagactggttggtgatgctgctaagaacttagctgcttctaacccaaaaaacaccatctt tgatattaagagattgatcggtatgaagtatgatgccccagaggtccaaagagacttgaagcgtcttccttacactgtcaagagcaagaacggccaac ctgtcgtttctgtcgagtacaagggtgaggagaagtctttcactcctgaggagatttccgccatggtcttgggtaagatgaagttgatcgctgaggacta cttaggaaagaaagtcactcatgctgtcgttaccgttccagcctacttcaacgacgctcaacgtcaagccactaaggatgccggtctcatcgccggttt gactgttctgagaattgtgaacgagcctaccgccgctgcccttgcttacggtttggacaagactggtgaggaaagacagatcatcgtctacgacttgg gtggaggaaccttcgatgtttctctgctttctattgagggtggtgctttcgaggttcttgctaccgccggtgacacccacttgggtggtgaggactttgact acagagttgttcgccacttcgttaagattttcaagaagaagcataacattgacatcagcaacaatgataaggctttaggtaagctgaagagagaggtcg aaaaggccaagcgtactttgtcttcccagatgactaccagaattgagattgactctttcgtcgacggtatcgacttctctgagcaactgtctagagctaag tttgaggagatcaacattgaattattcaagaagacactgaaaccagttgaacaagtcctcaaagacgctggtgtcaagaaatctgaaattgatgacattg tcttggttggtggttctaccagaattccaaaggttcaacaattattggaggattactttgacggaaagaaggcttctaagggaattaacccagatgaagct gtcgcatacggtgctgctgttcaggctggtgttttgtctggtgaggaaggtgtcgatgacatcgtcttgcttgatgtgaaccccctaactctgggtatcga gactactggtggcgttatgactaccttaatcaacagaaacactgctatcccaactaagaaatctcaaattttctccactgctgctgacaaccagccaactg tgttgattcaagtttatgagggtgagagagccttggctaaggacaacaacttgcttggtaaattcgagctgactggtattccaccagctccaagaggtac tcctcaagttgaggttacttttgttttagacgctaacggaattttgaaggtctctgccaccgataagggaactggaaaatccgagtccatcaccatcaaca atgatcgtggtagattgtccaaggaggaggttgaccgtatggttgaagaggccgagaagtacgccgctgaggatgctgcactaagagaaaagattg aggctagaaacgctctggagaactacgctcattcccttaggaaccaagttactgatgactctgaaaccgggcttggttctaaattggacgaggacgacaaagagacattgacagatgccatcaaagataccctagagttcttggaagacaacttcgacaccgcaaccaaggaagaattagacgaacaaagagaa aagctttccaagattgcttacccaatcacttctaagctatacggtgctccagagggtggtactccacctggtggtcaaggttttgacgatgatgatggag actttgactacgactatgactatgatcatgatgagttgtag
SEQ ID NO：2
Atgcaattcaactggaatattaaaactgtggcaagtattttgtccgctctcacactagcacaagcaagtgatcaggaggctattgctccagaggactctc atgtcgtcaaattgactgaagccacttttgagtctttcatcaccagtaatcctcacgttttggcagagttttttgccccttggtgtggtcactgtaagaagttg ggccctgaacttgtttctgctgccgagatcttaaaggacaatgagcaggttaagattgctcaaattgattgtacggaggagaaggaattatgtcaaggct acgaaattaaagggtatcctactttgaaggtgttccatggtgaggttgaggtcccaagtgactatcaaggtcaaagacagagccaaagcattgtcagct atatgctaaagcagagtttaccccctgtcagtgaaatcaatgcaaccaaagatttagacgacacaatcgccgaggcaaaagagcccgtgattgtgcaa gtactaccggaagatgcatccaacttggaatctaacaccacattttacggagttgccggtactctcagagagaaattcacttttgtctccactaagtctact gattatgccaaaaaatacactagcgactcgactcctgcctatttgcttgtcagacctggcgaggaacctagtgtttactctggtgaggagttagatgaga ctcatttggtgcactggattgatattgagtccaaacctctatttggagacattgacggatccaccttcaaatcatatgctgaagctaacatccctttagccta ctatttctatgagaacgaagaacaacgtgctgctgctgccgatattattaaaccttttgctaaagagcaacgtggcaaaattaactttgttggcttagatgc cgttaaattcggtaagcatgccaagaacttaaacatggatgaagagaaactccctctatttgtcattcatgatttggtgagcaacaagaagtttggagttc ctcaagaccaagaattgacgaacaaagatgtgaccgagctgattgagaaattcatcgcaggagaggcagaaccaattgtgaaatcagagccaattcc agaaattcaagaagagaaagtcttcaagctagtcggaaaggcccacgatgaagttgtcttcgatgaatctaaagatgttctagtcaagtactacgcccc ttggtgtggtcactgtaagagaatggctcctgcttatgaggaattggctactctttacgccaatgatgaggatgcctcttcaaaggttgtgattgcaaaact tgatcacactttgaacgatgtcgacaacgttgatattcaaggttatcctactttgatcctttatccagctggtgataaatccaatcctcaactgtatgatggat ctcgtgacctagaatcattggctgagtttgtaaaggagagaggaacccacaaagtggatgccctagcactcagaccagtcgaggaagaaaaggaag ctgaagaagaagctgaaagtgaggcagacgctcacgacgagctttaa
SEQ ID NO：3
Atgttggatcaacagactatcaacatcatcaaggctactgttccagtcttgaaggaacatggtgttactatcactactactttctacaagaacttgtttgcta agcatccagaagttagaccattgtttgatatgggtagacaagaatctttggaacaaccaaaggctttggctatgactgtcttggctgctgctcagaacatt gagaacttgccagctatcttgccagctgttaagaagattgctgttaagcattgtcaagctggtgttgctgctgctcattacccaattgttggtcaagaattgt tgggtgctatcaaggaagtcttgggtgatgctgctactgatgatatcttggatgcttggggtaaggcttacggtgttattgctgatgtcttcattcaagttga agctgatttgtacgctcaagctgttgaataa
SEQ ID NO：4
atgcccgtagattcttctcataagacagctagcccacttccacctcgtaaaagagcaaagacggaagaagaaaaggagcagcgtcgagtggaacgt atcctacgtaataggagagcggcccatgcttccagagagaagaaacgaagacacgttgaatttctggaaaaccacgtcgtcgacctggaatctgcac ttcaagaatcagccaaagccactaacaagttgaaagaaatacaagatatcattgtttcaaggttggaagccttaggtggtaccgtctcagatttggatttaacagttccggaagtcgattttcccaaatcttctgatttggaacccatgtctgatctctcaacttcttcgaaatcggagaaagcatctacatccactcgcaga tctttgactgaggatctggacgaagatgacgtcgctgaatatgacgacgaagaagaggacgaagagttacccaggaaaatgaaagtcttaaacgac aaaaacaagagcacatctatcaagcaggagaagttgaatgaacttccatctcctttgtcatccgatttttcagacgtagatgaagaaaagtcaactctca cacatttaaagttgcaacagcaacaacaacaaccagtagacaattatgtttctactcctttgagtcttccggaggattcagttgattttattaacccaggtaa cttaaaaatagagtccgatgagaacttcttgttgagttcaaatactttacaaataaaacacgaaaatgacaccgactacattactacagctccatcaggtt ccatcaatgatttttttaattcttatgacattagcgagtcgaatcggttgcatcatccagcagtgatgacggattcatctttacacattacagcaggctccatc ggctttttctctttgattggggggggggaaagttctgtagcagggaggcgcagttcagttggcacatatcagttgacatgcatagcgatcaggtga
本发明的高效表达植酸酶的重组菌株，包括上述提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体。
根据本发明的
具体实施方式
，将经基因工程改造筛选得到耐高温植酸酶高酶活表达菌株V28-VTR-001，即50L发酵总酶活达到37239U/mL的重组毕赤酵母，于 2021年1月保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO.61456。
本发明突破了现有的目标蛋白与单独的分子伴侣进行共表达的表达方式，克服了常规串联分子伴侣对目标蛋白表达量提高不显著或比单一分子伴侣效果差等缺 点。
附图说明
图1为VectorB质粒示意图；
图2为VectorP质粒示意图；
图3为VectorBP质粒示意图；
图4为V28-VTR-001和V1植酸酶发酵酶活曲线图；
图5为V28-VTR-001植酸酶热稳定性曲线图；
图6为V28-VTR-001植酸酶最适反应pH曲线图；
图7为V28-VTR-001植酸酶pH稳定性曲线图。
耐高温植酸酶高酶活表达菌株V28-VTR-001(Pichia sp.)于2021年1月20日保 藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼， 广东省微生物研究所，邮政编码510070)，保藏编号GDMCC NO:61456(分类命 名：Pichiasp.)。
具体实施方式
下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌Topl0、毕赤酵母X33、质粒pPIC9k、Amp和G418抗生素均购自 Invitrogen公司。
2、酶与试剂
Q5高保真PCR扩增酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；质粒提取、 DNA胶回收纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。 LB+Amp培养基为LB培养基加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素。LB+G418培 养基为LB培养基加入终浓度为300ug/mL的G418抗生素。
酵母培养基为YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵 母筛选培养基为YPD+G418培养基(YPD+G418培养基为YPD培养基加入终浓度 为300ug/mL的G418)。
酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY 相同)。
重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫 酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高 压后每升加4.35毫升PTM1。
PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水 钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、 浓硫酸0.5％、生物素0.02％。
下面将通过实施例对本发明作详细描述：
实施例1VectorB、VectorV、VectorH载体的构建
1、VectorB载体的构建
分别以Pichiapastoris X33基因组和pPIC9k质粒为模板，设计2对引物，PCR 扩增BIP基因、pPIC9k载体2个片段，并在引物中引入融合区域，采用融合PCR的 方法将BIP基因和pPIC9k载体这两个片段融合，如图1所示，构建成VectorB环形 质粒，将融合环形质粒转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，在含Amp(100μg/mL)抗 生素的平板中筛选重组转化子，挑取部分转化子至LB+Amp液体培养基中，37℃培 养3h，用验证引物BIP-F11和BIP-R11进行菌液PCR验证，片段大小约为2kb，将 转化子送去测序，VectorV、VectorH的构建方法参照VectorB，引物序列如下：
BIP-F1：caactaattattcgaaggatccaaacgatgctgtcgttaaaaccatcttggc
BIP-R1：caaatggcattctgacatcctcttgactacaactcatcatgatcatagtcat
pPIC9k-F1：tatgactatgatcatgatgagttgtagtcaagaggatgtcagaatgccatttg
pPIC9k-R1：gccaagatggttttaacgacagcatcgtttggatccttcgaataattagttg
BIP-F11：atgctgtcgttaaaaccatcttggc
BIP-R11：ctacaactcatcatgatcatagtcat
VectorV、VectorH的构建方法参照VectorB，引物序列如下：
VGB-F1：caactaattattcgaaggatccaaacgatgttggatcaacagactatcaacatc
VGB-R1：caaatggcattctgacatcctcttgattattcaacagcttgagcgtacaaatc
pPIC9k-VF1：gatttgtacgctcaagctgttgaataatcaagaggatgtcagaatgccatttg
pPIC9k-VR1：gatgttgatagtctgttgatccaacatcgtttggatccttcgaataattagttg
VGB-F11：atgttggatcaacagactatcaacatc
VGB-R11：gatttgtacgctcaagctgttgaataa
HACI-F1：caactaattattcgaaggatccaaacgatgcccgtagattcttctcataagac
HACI-R1：caaatggcattctgacatcctcttgatcacctgatcgctatgcatgtcaac
pPIC9k-HF1：gttgacatgcatagcgatcaggtgatcaagaggatgtcagaatgccatttg
pPIC9k-HR1：gtcttatgagaagaatctacgggcatcgtttggatccttcgaataattagttg
HACI-F11：atgcccgtagattcttctcataagac
HACI-R11：tcacctgatcgctatgcatgtcaac
2、VectorP载体的构建
以Pichiapastoris X33基因组为模板，设计2对引物，PCR扩增PDI基因、P2 启动子2个片段，并在引物中引入融合区域，采用融合PCR的方法将PDI基因和P2 启动子这两个片段融合，以融合产物为模板，以P2-F1和PDI-R1为引物，PCR扩增 P2-PDI全长片段，大小约2kb。
以pPIC9k质粒为模板，设计引物pPIC9k-F2和pPIC9k-R2，扩增pPIC9k载体线 性片段，将回收到的P2-PDI全长片段与载体pPIC9k载体线性进行连接，如图2所 示，构建VectorP表达载体，将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，在含 Amp(100μg/mL)抗生素的平板中筛选重组转化子，挑取部分转化子至LB+Amp液 体培养基中，37℃培养3h，用P2-F1和3’AOX引物进行菌液PCR验证，片段大小 约为2kb，将转化子送去测序，引物序列如下：
PDI-F1：cctatttcaatcaattgaacaactatatgcaattcaactggaatattaaaactg
PDI-R1：gcaaatggcattctgacatcctcttgattaaagctcgtcgtgagcgtctgcc
P2-F1：gggaacactgaaaaataacagttattattcgaagatcttttttgtagaaatgtcttgg
P2-R1：atagttgttcaattgattgaaatagggttttaatattccagttgaattgcat
pPIC9k-F2：ggcagacgctcacgacgagctttaatcaagaggatgtcagaatgccatttgc
pPIC9k-R2：ccaagacatttctacaaaaaagatcttcatgttggtattgtgaaatagacgcagatct
3、BIP、VGB、HACI基因、PDI基因序列分析
用生物分析软件VectorNTI对测序结果进行分析，BIP基因的开放阅读框(OpenReading Frame,ORF)由2037个核苷酸组成，登录号XM_002490982。其中，BIP基 因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。BIP基因编码一个含679个氨基酸的 蛋白质，预测该蛋白质的理论分子量大小为74.3KDa。
VHB基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)由441个核苷酸组成，登 录号AY278220。其中，BIP基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。VHB 基因编码一个含147个氨基酸的蛋白质，预测该蛋白质的理论分子量大小为15.9 KDa。
HACI基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)由996个核苷酸组成， 登录号XM-002489994.1。其中，HACI基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。 HACI基因编码一个含332个氨基酸的蛋白质，预测该蛋白质的理论分子量大小为 37.1KDa。
PDI基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)由1554个核苷酸组成，登 录号EU805807。其中，PDI基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。PDI 基因编码一个含518个氨基酸的蛋白质，预测该蛋白质的理论分子量大小为57.9 KDa。
4、VectorBP、VectorVP、VectorHP的构建
以成功构建的VectorB质粒为模板，设计引物VectorB-F和VectorB-R，在引物 中引入融合区域，PCR扩增线性载体片段a；以成功构建的VectorP质粒为模板，以 P-F和P-R为引物，PCR扩增线性片段b。采用融合PCR的方法将线性载体片段a 和线性片段b进行融合，如图3所示，构建VectorBP表达载体，将融合环形质粒转 化大肠杆菌Topl0感受态细胞，在含Amp(100μg/mL)抗生素的平板中筛选重组转 化子，挑取部分转化子至LB+Amp液体培养基中，37℃培养3h，以菌液为模板，用 验证引物AOX-F和P-R扩增分子伴侣完整表达框，片段大小约为4.5kb，将转化子 送去测序。
VectorVP、VectorHP的构建方法参照VectorBP，引物序列如下：
VectorB-F：cacagttaaattgctaacgcagtcag
VectorB-R：ccaagacatttctacaaaaaagatcttctcacttaatcttctgtactctgaag
P-F：cttcagagtacagaagattaagtgagaagatcttttttgtagaaatgtcttgg
P-R：ctgactgcgttagcaatttaactgtg
AOX-F：gatctaacatccaaagacgaaaggttg
实施例2载体VectorBP、VectorVP、VectorHP在毕赤酵母分泌表达耐高温植 酸酶中的应用
(1)VectorBP、VectorVP、VectorHP在耐高温植酸酶表达宿主V1中的表达
用限制性内切酶分别将VectorBP、VectorVP、VectorHP、VectorB、VectorV、VectorH、VectorP载体酶切为线性化DNA片段，采用纯化试剂盒分别纯化VectorBP、VectorVP、VectorHP、VectorB、VectorV、VectorH、VectorP线性DNA片段，采用电 转化方法分别转化VectorBP、VectorVP、VectorHP、VectorB、VectorV、VectorH、 VectorP线性DNA片段至已包含耐高温植酸酶基因的表达宿主V1感受态细胞中，分 别构建V11、V12、V13、V14、V15、V16、V17耐高温植酸酶表达菌株，涂布于 YPD+G418平板中，30℃倒置培养3-4天，分别各挑取约300个单菌落至2ml液体 BMGY培养基中，30℃，200rpm培养24小时，用1％甲醇诱导培养24小时，收集 发酵液，离心，取上清即为粗酶液。
(2)高产耐高温植酸酶表达菌V11、V12、V13、V14、V15、V16、V17的筛 选
植酸酶活性定义是指样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.5 的条件下，每min从植酸钠中释放l pmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U 表示。植酸酶的活性测定按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。
U＝FxC/(Vx30)
式中：U-试样中植酸酶的活性，U/mL；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方 程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，mL；30-反 应时间，min。
标准曲线的制定如表1：
磷浓度(mmol/L)
0
1.5625
3.125
6.25
12.5
25
OD值
0
0.0539
0.111
0.213
0.436
0.941
根据国家标准《GB/T 18634-2002》分别测定263个V11、212个V12、237个 V13、273个V14、232个V15、257个V16、227个V17转化子发酵粗酶液植酸酶酶 活。结果显示156个V11、117个V12、132个V13转化子酶活比出发菌株提高15％ 以上；V15转化子酶活普遍降低，相对酶活在75％-95％之间；V14、V16、V17转化 子酶活提升不显著，相对酶活在95％-105％之间。与单独的分子伴侣BIP、VGB、 HACI、PDI共表达相比，经串联优化的分子伴侣BIP和PDI、VGB和PDI、HACI 和PDI对V1植酸酶酶活提升更为显著，各筛选10个酶活最高的V11、V12、V13转化子进行复筛，最终确认一株酶活提高最为显著的转化子，包含串联的分子伴侣 基因BIP和PDI，命名为V28-VTR-001，与原始出发菌株V1相比，V28-VTR-001 植酸酶发酵酶活提高了27％。参照VectorBP、VectorVP、VectorHP的构建方法分别 构建PDI和SSAI、PDI和EROI、PDI和YDJI等10个表达载体，并与表达宿主V1 进行共表达，分别对VectorSP、VectorEP、VectorYP等双分子伴侣各约300个转化 子经过3轮筛选，结果显示PDI与EROI共表达使V1植酸酶酶活有小幅度提升，相 对酶活约107％，SSAI等其他分子伴侣与PDI共表达时，V1植酸酶酶活普遍降低， 相对酶活在53％-97％之间。BIP和PDI进行共表达时，V1植酸酶酶活提升最为显著， 优于单独的BIP、PDI及其他双分子伴侣组合，BIP和PDI对V1植酸酶的表达有显 著的协同增效效果。
(3)耐高温植酸酶表达菌V28-VTR-001的高密度发酵
50L发酵试验结果显示，与对照V1相比，V28-VTR-001植酸酶发酵酶活有显著 提升，V28-VTR-001植酸酶209h放罐酶活为37239U，比V1提高32.5％。
(4)耐高温植酸酶V28-VTR-001的酶学性质
如图5所示，V28-VTR-001植酸酶随着热处理的温度升高，酶活保留率呈平稳 趋势，80℃、85℃、90℃水浴热处理5min，酶活损失率低，其中95℃水浴热处理5min 酶活保留率在85％以上，优良的耐热性能使其在加工后处理过程中保持较高的酶活 力保留率，减少资源的浪费。如图6所示，V28-VTR-001植酸酶最适pH为4.5； V28-VTR-001植酸酶pH稳定性良好，在pH2.5-pH5.5的缓冲液下处理4h，酶活保 留率高，如图7所示，在酸性条件下酶活保留率高，使其在动物肠道中能更好的发 挥作用。
V28-VTR-001具有高的植酸酶发酵酶活，且以V28-VTR-001植酸酶优良的耐酸 性和耐热性能可高效的提高豆粕、玉米、全价料中磷的释放率，提高饲料的利用率， 减少粪便中磷对环境的污染，还可以降低植酸盐的抗营养作用，增加动物对蛋白质 和微量元素的吸收能力，在饲料行业中具有广泛的应用价值。
序列表
<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司
<120> 用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2037
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgtcgt taaaaccatc ttggctgact ttggcggcat taatgtatgc catgctattg 60
gtcgtagtgc catttgctaa acctgttaga gctgacgatg tcgaatctta tggaacagtg 120
attggtatcg atttgggtac cacgtactct tgtgtcggtg tgatgaagtc gggtcgtgta 180
gaaattcttg ctaatgacca aggtaacaga atcactcctt cctacgttag tttcactgaa 240
gacgagagac tggttggtga tgctgctaag aacttagctg cttctaaccc aaaaaacacc 300
atctttgata ttaagagatt gatcggtatg aagtatgatg ccccagaggt ccaaagagac 360
ttgaagcgtc ttccttacac tgtcaagagc aagaacggcc aacctgtcgt ttctgtcgag 420
tacaagggtg aggagaagtc tttcactcct gaggagattt ccgccatggt cttgggtaag 480
atgaagttga tcgctgagga ctacttagga aagaaagtca ctcatgctgt cgttaccgtt 540
ccagcctact tcaacgacgc tcaacgtcaa gccactaagg atgccggtct catcgccggt 600
ttgactgttc tgagaattgt gaacgagcct accgccgctg cccttgctta cggtttggac 660
aagactggtg aggaaagaca gatcatcgtc tacgacttgg gtggaggaac cttcgatgtt 720
tctctgcttt ctattgaggg tggtgctttc gaggttcttg ctaccgccgg tgacacccac 780
ttgggtggtg aggactttga ctacagagtt gttcgccact tcgttaagat tttcaagaag 840
aagcataaca ttgacatcag caacaatgat aaggctttag gtaagctgaa gagagaggtc 900
gaaaaggcca agcgtacttt gtcttcccag atgactacca gaattgagat tgactctttc 960
gtcgacggta tcgacttctc tgagcaactg tctagagcta agtttgagga gatcaacatt 1020
gaattattca agaagacact gaaaccagtt gaacaagtcc tcaaagacgc tggtgtcaag 1080
aaatctgaaa ttgatgacat tgtcttggtt ggtggttcta ccagaattcc aaaggttcaa 1140
caattattgg aggattactt tgacggaaag aaggcttcta agggaattaa cccagatgaa 1200
gctgtcgcat acggtgctgc tgttcaggct ggtgttttgt ctggtgagga aggtgtcgat 1260
gacatcgtct tgcttgatgt gaacccccta actctgggta tcgagactac tggtggcgtt 1320
atgactacct taatcaacag aaacactgct atcccaacta agaaatctca aattttctcc 1380
actgctgctg acaaccagcc aactgtgttg attcaagttt atgagggtga gagagccttg 1440
gctaaggaca acaacttgct tggtaaattc gagctgactg gtattccacc agctccaaga 1500
ggtactcctc aagttgaggt tacttttgtt ttagacgcta acggaatttt gaaggtctct 1560
gccaccgata agggaactgg aaaatccgag tccatcacca tcaacaatga tcgtggtaga 1620
ttgtccaagg aggaggttga ccgtatggtt gaagaggccg agaagtacgc cgctgaggat 1680
gctgcactaa gagaaaagat tgaggctaga aacgctctgg agaactacgc tcattccctt 1740
aggaaccaag ttactgatga ctctgaaacc gggcttggtt ctaaattgga cgaggacgac 1800
aaagagacat tgacagatgc catcaaagat accctagagt tcttggaaga caacttcgac 1860
accgcaacca aggaagaatt agacgaacaa agagaaaagc tttccaagat tgcttaccca 1920
atcacttcta agctatacgg tgctccagag ggtggtactc cacctggtgg tcaaggtttt 1980
gacgatgatg atggagactt tgactacgac tatgactatg atcatgatga gttgtag 2037
<210> 2
<211> 1554
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcaattca actggaatat taaaactgtg gcaagtattt tgtccgctct cacactagca 60
caagcaagtg atcaggaggc tattgctcca gaggactctc atgtcgtcaa attgactgaa 120
gccacttttg agtctttcat caccagtaat cctcacgttt tggcagagtt ttttgcccct 180
tggtgtggtc actgtaagaa gttgggccct gaacttgttt ctgctgccga gatcttaaag 240
gacaatgagc aggttaagat tgctcaaatt gattgtacgg aggagaagga attatgtcaa 300
ggctacgaaa ttaaagggta tcctactttg aaggtgttcc atggtgaggt tgaggtccca 360
agtgactatc aaggtcaaag acagagccaa agcattgtca gctatatgct aaagcagagt 420
ttaccccctg tcagtgaaat caatgcaacc aaagatttag acgacacaat cgccgaggca 480
aaagagcccg tgattgtgca agtactaccg gaagatgcat ccaacttgga atctaacacc 540
acattttacg gagttgccgg tactctcaga gagaaattca cttttgtctc cactaagtct 600
actgattatg ccaaaaaata cactagcgac tcgactcctg cctatttgct tgtcagacct 660
ggcgaggaac ctagtgttta ctctggtgag gagttagatg agactcattt ggtgcactgg 720
attgatattg agtccaaacc tctatttgga gacattgacg gatccacctt caaatcatat 780
gctgaagcta acatcccttt agcctactat ttctatgaga acgaagaaca acgtgctgct 840
gctgccgata ttattaaacc ttttgctaaa gagcaacgtg gcaaaattaa ctttgttggc 900
ttagatgccg ttaaattcgg taagcatgcc aagaacttaa acatggatga agagaaactc 960
cctctatttg tcattcatga tttggtgagc aacaagaagt ttggagttcc tcaagaccaa 1020
gaattgacga acaaagatgt gaccgagctg attgagaaat tcatcgcagg agaggcagaa 1080
ccaattgtga aatcagagcc aattccagaa attcaagaag agaaagtctt caagctagtc 1140
ggaaaggccc acgatgaagt tgtcttcgat gaatctaaag atgttctagt caagtactac 1200
gccccttggt gtggtcactg taagagaatg gctcctgctt atgaggaatt ggctactctt 1260
tacgccaatg atgaggatgc ctcttcaaag gttgtgattg caaaacttga tcacactttg 1320
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gtaaaggaga gaggaaccca caaagtggat gccctagcac tcagaccagt cgaggaagaa 1500
aaggaagctg aagaagaagc tgaaagtgag gcagacgctc acgacgagct ttaa 1554
<210> 3
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttggatc aacagactat caacatcatc aaggctactg ttccagtctt gaaggaacat 60
ggtgttacta tcactactac tttctacaag aacttgtttg ctaagcatcc agaagttaga 120
ccattgtttg atatgggtag acaagaatct ttggaacaac caaaggcttt ggctatgact 180
gtcttggctg ctgctcagaa cattgagaac ttgccagcta tcttgccagc tgttaagaag 240
attgctgtta agcattgtca agctggtgtt gctgctgctc attacccaat tgttggtcaa 300
gaattgttgg gtgctatcaa ggaagtcttg ggtgatgctg ctactgatga tatcttggat 360
gcttggggta aggcttacgg tgttattgct gatgtcttca ttcaagttga agctgatttg 420
tacgctcaag ctgttgaata a 441
<210> 4
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcccgtag attcttctca taagacagct agcccacttc cacctcgtaa aagagcaaag 60
acggaagaag aaaaggagca gcgtcgagtg gaacgtatcc tacgtaatag gagagcggcc 120
catgcttcca gagagaagaa acgaagacac gttgaatttc tggaaaacca cgtcgtcgac 180
ctggaatctg cacttcaaga atcagccaaa gccactaaca agttgaaaga aatacaagat 240
atcattgttt caaggttgga agccttaggt ggtaccgtct cagatttgga tttaacagtt 300
ccggaagtcg attttcccaa atcttctgat ttggaaccca tgtctgatct ctcaacttct 360
tcgaaatcgg agaaagcatc tacatccact cgcagatctt tgactgagga tctggacgaa 420
gatgacgtcg ctgaatatga cgacgaagaa gaggacgaag agttacccag gaaaatgaaa 480
gtcttaaacg acaaaaacaa gagcacatct atcaagcagg agaagttgaa tgaacttcca 540
tctcctttgt catccgattt ttcagacgta gatgaagaaa agtcaactct cacacattta 600
aagttgcaac agcaacaaca acaaccagta gacaattatg tttctactcc tttgagtctt 660
ccggaggatt cagttgattt tattaaccca ggtaacttaa aaatagagtc cgatgagaac 720
ttcttgttga gttcaaatac tttacaaata aaacacgaaa atgacaccga ctacattact 780
acagctccat caggttccat caatgatttt tttaattctt atgacattag cgagtcgaat 840
cggttgcatc atccagcagt gatgacggat tcatctttac acattacagc aggctccatc 900
ggctttttct ctttgattgg ggggggggaa agttctgtag cagggaggcg cagttcagtt 960
ggcacatatc agttgacatg catagcgatc aggtga 996
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